肿瘤体外药敏检测01(完整)

一、体外药敏检测
理想的药敏检测方法应该具备的条件
1. 操作简便，可以标准化，便于推广 2. 标本可评价率高 3. 检测敏感、可靠、客观 4. 临床相关性
肿瘤化疗药敏方法发展创新方向
1. 标准化，精确定量（无论是用药量或细胞数等）
2. 对体内环境的极近模拟
（一）瘤细胞直接损害试验
新鲜肿瘤标本制成单细胞悬液，与抗癌药接触 1～数小时后，洗去抗癌药，加入染色剂，与未 加药对照样本比较，可从瘤细胞的杀伤比例判 断药物抗肿瘤效应。根据染色剂与观察指标的 不同，可分为：美兰法、伊红台盼蓝法、吖啶 橙荧光测定法、同位素释放法等。上述试验周 期短、成本低、方法简便，但准确性差，现已 少用或仅作为细胞存活与否的判断方法。
集落形成法 （HTCA）
四唑蓝比色法 (MTT)
细胞毒性差异染 色法 (DiSC)
胸腺嘧啶核苷 掺入法 (3HTdR)
原代瘤细胞培养药敏检测方法的几点提示

本类方法在与其他学科的结合中仍在不断探索发展，并无 完美及完全定形的技术，各方法内部尚有细化及改进方法。 肿瘤细胞贴壁法、瘤细胞粘附培养法、细胞团培养法及流 式细胞仪测定法等已成为细胞分子生物学技术手段，不再 作为独立的药敏检测方法。
☆

肿瘤化疗药敏方法发展及简介
化学治疗是肿瘤的三大治疗手段之一。近30年来，虽然 某些恶性肿瘤的化学治疗有明显改善，但多数肿瘤，特别 是实体瘤疗效仍不理想。这与肿瘤存在个体差异性，以及 多重耐药性（MDR）等因素有关。 因此如何选择有效药物，进行有的放矢的治疗早已成为 化疗界所关注的问题。 早在上世纪 60年代已有报告，用卵巢癌组织进行药敏检 测，该组病人中位生存期有明显延长。化疗药敏检测已发 展成为体外（ in vitro ）与体内（ in vivo ）两类，成为 “当今癌症研究的主攻课题”之一。
3. 1998 年，Kurbacher 等人报道了 ATP-TCA 辅助化疗与传统化疗比较 的临床Ⅱ期试验结果，试验结果表明， ATP-TCA 指导的化疗治疗 复发性卵巢癌较传统化疗模式更能提高临床疗效，延长病人总生 存期和无进展生存期。 4. NIH 的 GOG (Gynecologic Oncology Group) 项目组认为 ATP-TCA 是 最有发展前途的一种药敏试验方法，已纳入重点科研项目 (1998)。
1.肿瘤细胞的异质性(heterogeneity)

肿瘤的发生具有多阶段、多基因的特点，而同一种肿瘤的基 因特性和发生阶段都可能会有非常大的差别；表现出在形态 上和生物学功能上的极大的不同。 这种肿瘤细胞的异质性已经得到越来越清楚的认识。
肿瘤细胞的异质性主要表现在 形态异质性：病理学上的形态多种多样。 基因异质性：肿瘤的发生经历了多基因的改变，同一种基 因可以有多个突变位点。如P53基因的突变 位点就已发现有 2000个之多。 功能异质性：基因的异质性导致生物学功能的异质性。
左：肠型腺癌(胃)
右：弥漫型胃癌
2.临床与个体化治疗

化疗作为全身性治疗的手段，在恶性肿瘤的治疗中 具有不可替代的地位。
同种肿瘤对化疗药物具有不同的反应性，忽视个体 差异仅凭经验式化疗存在盲目性，使得总体疗效不 佳。尤其对实体瘤，经验化疗的疗效仅为20％左右。


临床需要切实可行的检测方法，在用药前筛选出敏 感药物，以进行针对性较强的个体化治疗；是否进 行个体化治疗成为肿瘤化疗能否成功的关键因素。
ATP-TCA技术的核心试剂

◎. 荧光酶试剂(luciferin-luciferase counting reagent)
热稳定性和发光效率均好的重组酶试剂保证检测的敏感性和可靠性，满足
临床实际工作的需要

◎. 培养基(complete assay medium)
肿瘤细胞选择性培养基支持肿瘤细胞生长增殖，促进正常细胞死亡，从而 保证药敏检测的肿瘤细胞特异性
目前先进国家对该技术的评价
1. 1998 年德国 DCS 公司将该技术产业化，并获得国际 ISO 质量评 估体系认证，在欧洲和北美市场获得准入。 2. 2001 年 ， 美 国 全 国 医 疗 保 险 协 会 (Health Maintenance Organization) 认为，该技术是一项精确和可靠的并能指导医 生选择用药的 先进技术 ，建议在全美进行医疗保险赔付。目 前在加州等15个州已获医疗保险赔付。 3. 2003 年日本厚生省和保险联合会也认为，该技术是一项 先进
物对肿瘤细胞的杀伤效果。
荧光强度与活细胞数量的关系
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药敏检测方法 存在问题
标本可评价率低，仅有40~70％。 实验周期长，需要2周以上 测试药物种类和数量有限 操作繁琐，难以标准化 阳性预测值较低，仅有40～60％ 敏感性较差，最低仅能检测500个细胞 量程较小，有效量程在2.0以内 可适用标本类型不广，目前仅用于血液肿瘤 人为判断因素较大，难以推广 标本可评价率不高，仅有70～80％ 阳性预测值较低，仅有70～80％ 实验人员接触放射，不利于健康 标本可评价率不高，仅有70～80％ 测试结果仅能反映少量处于增殖相的肿瘤细胞 对某些药物的测试结果存在假阴性

（二）原代瘤细胞培养

体外药敏预测一般采用短期原代培养。在无菌条件下，用机 械法和／或酶消化法，将新鲜肿瘤标本分离为组织块、细胞 团或分散的单个细胞（视瘤组织多寡及所用培养方法而定）， 与各种抗癌药分别作用一定时间后，与对照组比较，可计算 用药组的瘤细胞杀伤比例，测出抗癌药物敏感度。
主要的原代瘤细胞培养药敏检测方法 及其存在的问题
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技术流程
Tumor
Mechanical and enzymatical dissociation Addition of drugs/medium
Single Cell suspension
ATP extraction and stabilization

☆ 几种原代瘤细胞培养药敏检测方法简介
一、MTT比色法
四氮唑化合物MTT（Methylthiazolyl tetrazolium） 在活细胞线粒体酶作用下可裂解为紫蓝色不溶性的甲臜化 合物（Formazan），加入异丙醇或二甲基亚砜后，用分光 光度计（酶标仪）测出其光密度变化。本法简单迅速，操 作可半自动化。缺点是不能区分正常细胞与肿瘤细胞，此 外对于不同类型的肿瘤标本可能需要不同的细胞浓度与药 物作用时间。故有待进一步改进。目前已有药物梯度浓度 的引入。

（四）瘤细胞连续培养

瘤细胞培养一定时间后（通常为1～4周），细胞生长增殖 达到一定密度，产生密度抑制。故需分离出一部分细胞， 进行传代培养，并可建立细胞株。本法得到的瘤细胞数量 多，在抗癌新药筛选中起重要作用。 缺点是实验周期长，只能作回顾性药敏检测。

二、体内药敏检测

即异种移植法。通常用啮齿类动物做移植宿主。将人癌标 本移植于受试动物体内如肾包膜下移植法（SRCA） ， 再给予抗癌药。数天至数周后处死动物，测量移植瘤的大 小变化，以评定药物敏感度。本法较体外试验更接近人体 情况，对需要体内代谢而发挥作用的药物，如临床常用的 环磷酰胺尤为适宜。还可测试联合化疗方案的疗效，临床 意义较大。 体外试验与体内试验可交替应用。如将体外培养的瘤细胞 植入裸鼠体内，或将人癌移植瘤再作HCTA培养均可。
Tumor Chemosensitivity Assay
肿瘤体外药敏检测技术进展及应用
广西医科大学外科实验室 苏承武
☆ 肿瘤化疗药物敏感性试验 是个体化治疗的基础

肿瘤化疗药物敏感性试验(TCA)
Tumor Chemosensitivity Assay
将肿瘤细胞进行体外的有药培养，然后 通过检测细胞活性的有关指标，判断不同 药物的疗效。通过这种试验，即可确定针 对个体肿瘤细胞具有最佳疗效的化疗药物 或药物组合。


一些相对简便经济的方法在目前仍应积极提倡，如MTT比 色法。
（三）同步瘤细胞培养

将处于不同细胞周期的瘤细胞分离培养，可研究 药物的周期特异性作用。
1.药物阻断法 如长春新碱使细胞阻滞于M期，博莱霉素 则使其堆积于G2期。 2.物理法 运用细胞同步化技术，如M期细胞震荡收集 法，可避免药物阻断法的干扰作用。
二、ATP-TCA
ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测 技术原理：
ATP + Luciferin + O2 AMP + 2Pi + Photons +Oxylaluciferin
Luciferase
在有氧条件下, 荧光酶（luciferase）可以催化荧光素 （ luciferin ）释放出荧光（波长为 562nm ），同时 ATP 转变成 AMP 。所释放的荧光强度与胞内 ATP 含量呈 正相关。细胞死亡后，胞内 ATP 迅速水解，而活细胞 的 ATP 含量基本恒定。因此所测得的荧光强度反映了 活细胞的数量。比较药物系列浓度对培养细胞的不同 抑制率，参照相应判断指标，从而可以评估该化疗药
的临床医学项目 ，该技术指导的肿瘤化疗较传统的化疗方案
更能明显提高胃肠道肿瘤的治愈率，建议该项技术在全国范 围内获得医疗保险赔付。
ATP-TCA技术是目前最先进的体外药敏技术，该技术敏感可靠，具有极大的临床应用价值

主要试剂仪器
ATP-TCA核心试剂盒（德国DCS）：包括完全分 析培养基（CAM）、最大ATP抑制剂、组织消化酶液、ATP提取液、 荧光素-荧光素酶（lulu）、ATP标准品、无菌96微孔培养板。自发 光分析仪（德国Berthold）、超净工作台
培养前后细胞组成变化
培养前细胞组成 3-5天培养后细胞组成
淋巴 细胞
40-50%
上皮 细胞
成纤维 细胞
肿瘤 细胞
10-20%
淋巴 细胞
<1%
上皮 细胞
<10%
成纤维 细胞
<10%
肿瘤 细胞
>80%
10-25% 5-10%
选择性培养基的研究结果表明该培养基具有良 好的选择性，适合肿瘤体外药敏检测的需要
Incubation for 3-5 days
Awenku.baidu.comPLuminescence
Construction of dose-response plots
Software Evaluation
国内外研究历史回顾
1. 1982年，Moyer等首先提出内源性ATP的含量可以反映细胞活性;随 后Kangas 等相继证实生物荧光技术是一种敏感、可靠的确定各种 细胞活性的检测方法。 2. 自1988年，Sevin首先将此方法用于新鲜肿瘤组织的药敏检测，在 欧洲和美国已经进行了大量的临床应用研究。
20 0
ATP-TCA指导的化疗 (n = 39)
p = 0,0016
传统化疗(n = 17)
传统化疗(n = 17)
0 50 100 150 200 250
100
150
200
250
Weeks
Weeks
引自Kurbacher CM, Cree IA, Brucker. Anticancer Drugs. 1998, 9: 51-57
ATP-TCA 药物测试方式
实验过程


实体瘤（也可以是穿刺样品或腹水等液体样品）先被切碎， 并用酶分离成细胞悬液。这一过程并不影响肿瘤细胞的活性。 将细胞悬液加入到含有浓度不同的化疗药物的无血清培养基 （CAM）中，在培养基板中培养3-5天。CAM培养基可以抑制 非瘤细胞的生长，选择性培养肿瘤细胞。 培养后，加入可以稳定细胞内ATP的提取试剂，提取出ATP。 加入荧光素-荧光素酶系统，在板式发光分析仪上进行ATP的 检测。 根据含药孔的荧光值与无药孔（M0）的荧光值的比较，得出 该浓度化疗药物对肿瘤细胞的抑制值。 做出化疗药物的剂量-抑制曲线，得到AUC值、IC90、IC50以 及敏感度指数SI值，判断化疗药物的敏感度。
传统化疗和ATP-TCA指导的化疗的 生存率比较
100 80 100 80 ATP-TCA指导的化疗 (n = 39)
p = 0,0009
Overall Survival
% Patients
Progression free Survival
% Patients
60 40 20 0 0 50
60
40