乳腺癌药敏药敏试验详解

四唑蓝比色法（MTT法）

原理：活细胞内线粒体脱氢酶能将四甲基偶氮唑 盐转化为蓝紫色结晶物(formazan)，用二甲亚砜 （DMSO）溶解后，可在酶标仪上记录吸光度。 优点:1.操作简便，设备要求不高，时间短。 2.实验精确，重复性好，而且无主观人为 因素影响，临床符合率85％。 3.成功率高，约为80－90％
如何解决这些问题？
肿瘤化疗个体化 : 研究发现，根据药敏
检测结果指导选药，有效率可在原来固定 化疗方案的基础上提高一倍以上，于是提 出了肿瘤化疗个体化的概念 ( 即预见性化 疗)。根据个体肿瘤敏感性检测的结果，选 用敏感的药物的联合方案，无疑将会大大 提高肿瘤的治疗水平。
肿瘤药敏的可行性
七十年代细胞培养技术的突破，新型培 养材料、培养基的问世。 1983年Mosmann建立了MTT法，方法简便， 设备要求不高，检测时间短，便于在临 床上广泛开展。 新的抗癌药不断问世，同一种肿瘤有多 种联合化疗方案可供选择。

肿瘤药敏的方法学

肿 瘤 细 胞 药 敏
体内法


裸鼠皮下移植 裸鼠肾包膜下移植 裸鼠原位移植 染料排斥法 集落形成法 同位素法 四唑蓝比色法

体外法


裸鼠肾包膜下移植
裸鼠肾包膜下移植实验是肿瘤细
胞药敏体内实验最常用的方法， 但由于裸鼠需要在无菌条件下饲 养，而且肾包膜下移植实验操作 复杂，实验周期长，不易在临床 广泛开展。
染料排斥实验
原理是细胞死亡后膜通透性增加，染
料通过细胞膜而使细胞着色，故通过 计数未着色细胞可计算出药物的杀伤 率。但由于某些受杀伤尚未死亡的细 胞Baidu Nhomakorabea不易着色，故假阴性率较高。另 外在计数时主观的因素会出现较大的 误差，目前较少应用。
集落形成法

集落法(Human Tumor Cell Cloning Assay, HTCA）肿瘤组织由增殖和非增殖细胞组 成，其中仅有 1％具有旺盛的增殖能力， 是肿瘤浸润扩散和复发的根源。 这种细 胞具有形成细胞集落的能力,故又称为肿 瘤干细胞。 测定肿瘤干细胞对药物的敏 感性符合临床药物治疗的需要。

MTT法操作方法
用培养液调整细胞浓度为 1 × 10 5 /ml 后接 种于微量培养板，每孔 100 ，每组设三个平 行孔，加入100μl 含有化疗药的培养基,置 培养箱内培养 68 小时，加入 20 μl MTT 后再 培养4小时,吸弃上清，每孔加二甲亚砜 200μl,用微量震荡器震荡,使结晶产物充分 溶解，在自动酶标仪上比色，测出波长 570nm 处的吸光度，最后计算细胞杀伤活性。
2.化学治疗的抗药性
有些肿瘤对某些药物存在先 天耐药,还有些肿瘤经化疗缓解， 肿瘤敏感株杀灭，耐药株成为 复发的根源，而且对以后的化 疗抵抗。
3. 抗癌药物的毒性
所有抗肿瘤药物在杀伤肿瘤细胞 的同时，也杀伤正常的组织细胞，尤 其是增殖旺盛的骨髓造血细胞和胃肠 道细胞。期望通过增大剂量、增加用 药品种、缩短间隔时间的方法来提高 抗癌效果，则将进一步加重毒性作用。
集落形成法的优点

抑制纤维母细胞的增殖，不受肿瘤细胞 以外的细胞的影响。 下层滋养层可加入各种辅助分子，更利 于肿瘤的生长。 直接测定药物对肿瘤细胞中最活跃的成 分肿瘤干细胞的影响。


集落形成法的缺点
高纯度单细胞悬液的制备困难。 所形成的细胞集落并非都是肿瘤
细胞集落。 成功率低，有一定的难度。 培养周期长，需10天左右。
集落形成法方法学

双层琼酯法：底层 加入0.5% 的琼脂培 养液, 上层加含肿 瘤细胞悬液的0.3 % 琼脂培养液。上层 培养液供肿瘤细胞 生长，下层防止细 胞贴壁及成纤维细 胞的过度生长。

玻璃毛细管法: 培养 基0.6ml，瘤细胞悬液 0.1ml,抗癌药0.1 ml, 1％琼脂糖0.2ml加在 一起混匀后向玻璃毛 细管内加入50μl，冷 却凝固后置37℃二氧 化碳培养箱内培养。
MTT法注意事项
血供丰富的肿瘤组织在制取肿瘤单细胞悬 液时，大量的红细胞影响测定，可用红细 胞裂解液裂解红细胞。 有色的抗癌药物对吸光度有影响，可用同 浓度的药物作为本底，去除药物的影响。 吸弃上清时要注意不要吸掉结晶物，一般 要先离心，板底留约30μl的培养基

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肿瘤化疗的局限性
肿瘤的化学治疗在半个世纪 以来，虽然取得显著进展，但临 床抗肿瘤药物治疗的总有效率并 不高，阻碍化学治疗取得更好疗 效的原因众多，主要包括：
1. 现行化疗的盲目性
抗肿瘤药物研究表明，即使是相同 组织学类型的肿瘤对同一抗肿瘤药物 的反应也并不尽一致，对不同脏器或 不同组织学类型的肿瘤采用相同的用 药方案，效果更是千差万别。目前大 多数化疗是采用的对某种脏器既定的 联合方案,仍有一定的盲目性。
3HTdR掺入法
用培养液调整细胞浓度为1×105/ml。将 此浓度的细胞接种于微量培养板，每孔 100μl，每3孔为一组，加入100μl含有化 疗药的培养基，培养 52 小时，加入 20 μl 3HTdR, 实验结束后，吸弃上清，加入 0.3 ％ 胰蛋白酶消化细胞，用多头细胞收集器收 集细胞。最后用液体闪烁计数仪测定每分 钟脉冲数（CPM）值。
肿瘤药物敏感实验
化疗的重要性
自1946年Gillman和Phillip报道氮芥类 药物治疗造血系统肿瘤以来，化学治疗巳取 得很大的进步。目前化学治疗已使绒癌、恶 性淋巴瘤、睾丸精原细胞瘤、小细胞肺癌等 多种恶性肿瘤获得治愈的机会，大多数恶性 肿瘤能得到缓解，化疗在恶性肿瘤的治疗中 具有不可替代的地位。
放射同位素法
3H的β射线能量低，分辨率高，半衰期长达
12年,3H标记胸腺嘧啶核苷(3HTdR)为最常用。



放射性同位素标记 的核苷酸容易掺入 DNA和RNA分子中 放射性同位素发灵 敏度高，重复性好。 时间短，可较快地 得到结果。



仪器设备要求高。 由于具有放射性，故 操作时需要一定的防 护措施。 废料需特别处理。