论ATP-TCA法检测乳腺癌细胞对化疗药物敏感性的探究

1.3 方法 ATP-TCA操作步骤（按试剂盒使用说明操作）摘要：取肿瘤组织标本，在无菌条件下，剥离肿瘤组织的纤维、脂肪及结缔组织，然后用剪刀将肿瘤组织尽可能剪成小碎块，过200目钢网后放入肿瘤组织解离酶液中，置37℃、5%CO2、95%湿度下孵育1.5～3h。在室温下，以1500r/mim条件下离心20min，弃上清液，用Hanks洗2次，以PRMI-1640制成癌细胞悬液，取35μl用台盼蓝染色，显微镜下计数，并观察细胞活性。调整细胞浓度至20～40万/ml，以每孔0.1ml接种至96孔培养板内。按400%、200%、100%、50%、25%和12.5%的血浆峰值浓度，将药物加入培养孔每孔0.1ml，每个浓度3个平行孔，并设最大抑制（MI）和无药物（MO）对照孔，于5%CO2、37℃、95%湿度下孵育6～7天。加入肿瘤细胞ATP提取液0.1ml，混匀后室温下15min，取0.05ml混合液置微板荧光分析仪检测。
论ATP-TCA法检测乳腺癌细胞对化疗药物敏感性的探究
日期： 05月31日
作者;唐永梅，苏承武，蔡捷，唐东，李佳荃，李梅，田海梅，张伟
［摘要］ 目的 探索体外ATP法化疗药物敏感试验在乳腺癌细胞中的可行性。方法 以ATP-TCA法，检测37例乳腺癌患者的癌细胞对6种常用化疗药物的敏感性。结果 ATP-TCA法的可评估率为91.89%；6种试验用化疗药物的敏感率分别为摘要：足叶乙甙14.71%，紫杉醇20.59%，丝裂霉素32.35%，5-氟尿嘧啶47.06%，草酸铂58.82%，表阿霉素67.65%。结论 ATP-TCA肿瘤细胞化疗药敏试验可作为乳腺癌患者个体化疗中化疗药物敏感性的猜测。
1 材料和方法
1.1 一般资料 收集 3月～ 5月在本院手术治疗的乳腺癌（经病理确诊）患者37例标
本。37例患者最小年龄25岁，最大年龄65岁。
1.2 材料 ATP-TCA试剂盒（包括改良PRMI-1640培养基）由北京金紫晶生物技术有限公司提供。MPL-1型自发光分析仪为德国Berthold公司产品。化疗药物摘要：5-氟尿嘧啶（5-FU，南通制药总厂），表阿霉素（EPI，浙江海政制药），足叶乙甙（VP-16，江苏恒瑞），紫杉醇（TXL，澳大利亚FH科贸有限公司），丝裂霉素（MMC，日本明治药厂），草酸铂（OXA，法国Sanofi Winthrop公司）。
1.4 ATP-TCA结果评估
1.4.1 应用ATP-TCA的条件 (1)检测的标本必须经细胞学和病理学证实为恶性肿瘤，且混悬液中肿瘤细胞数 %26gt;20%。(2)培养板MO对照行必须可观察。(3)药物活性的剂量反应曲线须可观察。(4)平行孔间CV 值%26lt;20%。
1.4.2 ATP-TCA药物敏感和耐药的解读 (1)药物敏感定义摘要：高AUC（抑制曲线下面积）值，低IC90（抑制90%癌细胞生长时的药物浓度）、IC50（抑制半数癌细胞生长时的药物浓度）和SI（敏感指数）值，和高TGI（癌细胞生长抑制）值（表示癌细胞生存100%抑制）。(2)药物耐受定义摘要：低 AUC值，高IC90、IC50和SI值和低TGI值（非凡是在高测试浓度和弱剂量反应时）。(3)敏感度分级，定义为摘要：强敏感摘要：IC90≤ 100%TDC（测试肿瘤药物浓度）和IC50≤25%TDC。部分敏感摘要： IC90＞100% TDC和 IC50≤25%TDC。弱敏感摘要： IC90≤100%TDC和IC50＞25%TDC。耐药摘要：IC90%26gt;100%TDC和IC50≤25%TDC。
2 结果
在收集的37例患者中，34例具有评估性，总可评估率为91.89%，乳腺癌ATP-TCA试验药物剂量效应曲线图（见图1）。
图1 乳腺癌ATP-TCA剂量效应曲线图
ATP-TCA试验结果显示不同个体的乳腺癌细胞对6种化疗药物具有不同的敏感性。在所测试的化疗药物中，它们的敏感率排序如下摘要：表阿霉素（EPI）67.65%，草酸铂（OXA）58.82%，5-氟尿嘧啶（5-FU）47.05%，丝裂霉素（MMC）32.35%，紫杉醇（TXL）20.59%，足叶乙甙（VP-16）14.71%。其中表阿霉素的敏感率最高，足叶乙甙的敏感率最低（见表1）。
4 邵长君，田海梅，傅军，等.ATP-生物荧光法在筛选卵巢癌化疗药物中的应用.标记免疫分析和临床，2003，10(3)摘要:152-155.
5 齐青萍，高国兰.ATP肿瘤体外药敏试验探究进展.实用癌症杂志，2004，19(1)摘要:106-108.
［参考文献］
1 Ng TY，Ngan HY，Cheng DK，et al.Clinical applicability of the ATP cell viability assay as a predictor of chemoresponse in platinum-resistant epithelial ovarian cancer using nonsurgical tumor cell samples.Genecol Oncol，2000，癌；化疗药物
Application of ATPbioluminescence assay for screening chemotherapeutic agents of breast tumor
［Abstract］ Objective To study the application of the ex vivo ATPbioluminescence assay(ATP-TCA)in the chemotherapy of breast tumor.Methods The surgical specimens of 37 patients were tested by the ATP-TCA.Results Evaluable test results were achieved in 34 of 37 patients，the evaluability rate was 91.89%.The sensitive rates of etoposid(Vp-16)，paclitaxel(TXL)，mitomycin(MMC)，5-fluoruracil(5-FU)，oxaliplati(OXA)，epirubicin(EPI)was 14.71%，20.59%，32.35%，47.06%，58.82%，67.65%，respectively.Conclusion ATPbioluminescence assay is a good option in the chemotherapeutic agents screening of breast tumors.
表1 6种化疗药物敏感试验结果
注摘要：四格表确切概率法，EPI、OXA高于VP-16（△P%26lt;0.05）；MMC、TXL、VP-16低于EPI（▲P%26lt;0.05）
3 讨论
在本探究中，应用对乳腺癌有较高评估率的ATP-TCA法［2］，对37例乳腺癌患者的癌细胞进行体外化疗药物敏感性检测方法学的再探究。ATP是活细胞的基本能量单位，当细胞的代谢受损时，ATP合成水平下降，其和活细胞数量呈正相关，故通过测定ATP水平可反映生物体的增殖活性。ATP体外药敏试验的原理是细胞内ATP和荧光素-荧光素酶复合物功能产生可测定荧光（波长562nm），检测荧光值计算出ATP量可反映活细胞数。Sevin等探究认为乳腺癌手术后组织的可评估率为97%，敏感性为90%，特异性为86%，其临床符合率为70%～80%［2］。本组实验结果较之为低，这可能和我们的操作不够熟练、培养过程真菌污染及试验用药有关。乳腺癌被认为是一种全身性疾病，对化疗中度敏感，Rein等［3］用ATP-TCA法测试晚期乳腺癌体外对蒽环类抗生素、肽素类和铂类的敏感性，同时用免疫组化法检测P53、bcl-2的表达，发现体外反应率最高为66.7%，提示化疗反应和凋亡无关及P53、bcl-2的表达和体外药敏结果无关。我们应用北京金紫晶生物技术有限公司提供的ATP-TCA试剂盒，心得到ATP-TCA法有如下优点摘要：（1）成功率及重复性高，达97%；（2）细胞用量少（1.5～2.5）×1011/L；（3）采用荧光检测范围较大，且可定量；（4）药物浓度呈线性范围，有6个细胞级数，判定趋向明显；（5）干扰因素少；（6）改良的RMPI-1640培养基可选择性地促进肿瘤细胞生长，并抑制纤维细胞和血细胞的生长［4］。探究表明，ATP-TCA法用于体外乳腺癌患者的癌细胞化疗药物检测在方法学上是可靠的［5］。因本探究样本有限，涉及临床因素不多，药敏试验结果和临床疗效一致性有待进一步的探究。
［Key words］ ATPbioluminescence；breast tumor；chemotherapy drug
选择针对个体有效的药物进行化疗是治疗乳腺癌的重要手段之一。由于同一化疗方案对不同个体的类同肿瘤的疗效存在差异，化疗前对药物进行体外敏感试验，猜测出有效的单药或有效（或敏感）联合药物组成的化疗方案，是提高化疗药物疗效的潜在方法之一。ATP-TCA法（三磷酸腺苷-肿瘤细胞药敏试验）是近年发展起来的敏感而稳定的药敏检测方法［1］。本文应用ATP-TCA法对37例乳腺癌患者的乳腺癌细胞进行6种化疗药物的药敏试验，以探索ATP-TCA法用于乳腺癌患者体外化疗药物检测在方法学方面的可靠性。
2 Sevin BU，Perras JP.Tumor heterogeneity and in vitro chemosensitivity testing in ovarian cancer.Am J Obstet Gynecol，1997，176(4)摘要:759.
3 Ikawa H，Kameda H，Kamitani H，et al.Effect of PPAR activators on cytokinestimulated cyclooxygenase-2 expression in human colorectal carcinoma cells.Exp Cell Res，2001，267(1)摘要:73.