登革热实验室检测指南
登革热实验室检测指南
登革热实验室检测指南附件2一、目的（一）及时发现、确诊病例。
（二）及时了解伊蚊媒介携带登革病毒状况。
（三）病毒分型和溯源。
（四）为登革热盛行趋势的预测、预警和制订预防对策、措施提供更多科学依据。
二、检测对象（一）疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准ws216-2021）。
（二）伊蚊成蚊和幼虫。
三、样本采集、保存和运输（一）临床标本收集用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及时分离血清，分装2份，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中1份用于现场实验室检测，1份用于上级预防控制机构复核（附件1，附表1）。
1.登革热临床确诊病例及疑似病例，每次收集血液标本5ml。
2.登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴性），应采集双份血液标本，入院当天和出院前1天各一份。
3.疫点首发病例，必要时应收集第二份血标本，距第一份血样收集日期间隔在7天以上。
（二）蚊媒标本采集疫点内收集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴别后，核对媒介标本收集信息表中，按照收集地点灌装，每管及10-20只。
（三）标本保存、运送标本应当-70℃以下留存，血液标本可以-20℃以下留存，但不少于1周。
标本载运时使用低温冷藏运输，防止冻融，样本运输应当严格遵守国家有关生物安全规定。
四、检测内容（一）实验室检测登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体，检测流程参见图1。
（二）核查检测1.送市或省级疾病预防控制机构的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。
2.疫点首发病例，重症病例、输出病例急性期标本应当使用pcr方法展开分型检测，阳性者拆分病毒，从临床标本或所拆分病毒中扩充e蛋白编码基因，顺利完成序列分析。
3.每次暴发疫情应开展病毒全基因组序列分析。
4.实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应付恢复期血清展开igm、igg抗体和/或中和抗体检测。
登革热诊断与实验室检测
特异性
检测时机
登革热不同诊断方法的可操作性和可信性
直接检测
可操作性
间接检测
病毒分离 核酸检测 NS1检测
可信性
IgM检测
IgG检测
登革病毒结构
细胞间病毒(未成熟)
细胞外病毒(成熟)
包膜糖蛋白
前M
(双体) 基质蛋白
核衣壳蛋白 (C蛋白)
登革病毒基因组结构
结构蛋白
非结构蛋白
登革病毒分离
细胞
昆虫细胞: C6/36、AP61 哺乳动物细胞: Vero、BHK21
YF PRNT 80% 减少 DV抗体用捕获法化学发光
接种17D疫苗后黄热和登革抗体
登革病毒感染后的黄热和登革抗体
检测登革病毒IgM抗体的试剂比较
真核rEIII蛋白MacELISA法检测早期登革病人血清
OD Value
3.5
dengue virus patients sera
3.0
hantan virus patients sera
登革分型实时PCR
登革抗体检测方法
检测IgM MacELISA、免疫层析(ICT)
检测IgG 间接法ELISA、GacELISA、IFA、 免疫层析(ICT)
中和试验 特异性高，可以用于分型
登革病人血清和乙脑交叉反应
乙脑、黄热和登革热的抗体交叉反应
登革病人血清和乙脑交叉反应
黄热病毒中和抗体和登革病毒抗体
NS1为50kD的糖蛋白 以300kD的六聚体形式分泌到血液中
DHF患者血清中NS1明显升高 激活补体 血管内皮细胞功能不全 血管通透性增加
NS1抗原特点及其应用
一、分泌性表达，易于检测 二、出现早，发病或发病前即可检出 三、浓度高，可达50 ug/ml 四、持续时间长，初次感染可持续9-12天 五、大量临床应用验证 六、NS1抗体可能用于血清分型 七、再次感染不易检测，在发病5-7天后很少能检出 八、高浓度NS1患者发病较重 九、可检测蚊子中的NS1抗原，用于监测
登革热检测规程
登革热（一）登革病毒感染与机体免疫反应登革病毒感染后，潜伏期为3～14 天，通常 4～7 天，潜伏期内采集的患者标本尚不能检出登革病毒或相应的机体免疫反应。
发病后，病毒在血液中存在的时间（病毒血症期）约为7 天，病毒 NS1抗原在血液存在的时间略长。
发病后4～ 5 天内，可在病人的血清、血浆、白细胞、脑脊液和尸检组织标本中分离到病毒，病毒核酸及NS1抗原在这个时期的检出率高。
病人血液中抗体水平，因个体免疫状态不同而具有显著差异。
若以前没有感染过登革病毒或其他黄病毒，或接种过黄病毒疫苗（如：乙脑、黄热等），病人首次感染抗体免疫反应呈现为特异性抗体水平缓慢升高， IgM 抗体出现最早，随后出现的是IgA 和 IgG 抗体。
在发病后3～5 天的患者中IgM 抗体检出率约为50%，发病后第 5 天的患者中检出率约为80%，而在发病后第10 天患者中，约 99%的患者可检出。
IgM 抗体水平在发病后 2 周达高峰，然后逐步下降，可保持2～3 个月。
IgA 抗体出现略晚于IgM 抗体，可保持约45 天。
在发病一周后，可在血液标本中检出较低滴度的IgG 抗体，之后抗体滴度缓慢升高，可持续存在多月甚至终生。
如果病人属于再次感染登革病毒（登革病毒感染者以前曾感染过登革病毒，有时可能是曾接种其他黄病毒疫苗或感染过其他黄病毒），抗体滴度可快速升高并可和多种黄病毒产生反应。
主要为高水平的IgG 抗体，在急性期即可检出，可持续存在10 个月以上，甚至终生。
IgA 抗体也可在急性期标本中检出。
再次感染登革病毒的病人恢复期早期的IgM 抗体滴度明显低于首次感染，甚至无法检出，通过计算 IgM/IgG 抗体比例，可以区分首次或再次登革病毒感染。
IgA 抗体检测试剂在临床诊断中的应用尚处于评价阶段。
登革病毒 IgM/IgG 抗体检测规程【方法】胶体金法【预期用途】登革热（ Dengue Fever ）是一种由登革病毒引起的急性传染病，主要流行于热带和亚热带国家和地区。
登革热实验室检测指南.doc
附件2登革热实验室检测指南一、目的（一）及时发现、诊断病例。
（二）及时了解伊蚊媒介携带登革病毒状况。
（三）病毒分型和溯源。
（四）为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。
二、检测对象（一）疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准WS216-2008）。
（二）伊蚊成蚊和幼虫。
三、样本采集、保存和运输（一）临床标本采集用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及时分离血清，分装2份，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中1份用于现场实验室检测，1份用于上级预防控制机构复核（附件1，附表1）。
1.登革热临床诊断病例及疑似病例，每次采集血液标本5mL。
2.登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴性），应采集双份血液标本，入院当天和出院前1天各一份。
3.疫点首发病例，必要时应采集第二份血标本，距第一份血样采集日期间隔在7天以上。
（二）蚊媒标本采集疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴定后，填写媒介标本采集信息表，按照采集地点分装，每管10-20只。
（三）标本保存、运送标本应-70℃以下保存，血液标本可-20℃以下保存，但不超过1周。
标本运送时采用低温冷藏运输，避免冻融，样本运输应遵守国家相关生物安全规定。
四、检测内容（一）实验室检测登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体，检测流程参见图1。
（二）复核检测1.送市或省级疾病预防控制机构的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。
2.疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因，完成序列分析。
3.每次暴发疫情应开展病毒全基因组序列分析。
4.实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应对恢复期血清进行IgM、IgG 抗体和/或中和抗体检测。
登革热实验室检测指南
登革热实验室检测指南一、目的（-）及时发现、诊断病例。
（二）及时了解伊蚊媒介携带登革病毒状况。
（三）病毒分型和溯源。
（四）为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。
二、检测对象（-）疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准WS216-2008） o（二）伊蚊成蚊和幼虫。
三、样本采集、保存和运输（-）临床标本采集用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及时分离血清，分装2份，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中1份用于现场实验室检测，1份用于上级预防控制机构复核（附件1,附表1） o1.登革热临床诊断病例及疑似病例，每次采集血液标本5mLo2.登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴性），应采集双份血液标本，入院当天和出院前1天各一份。
3.疫点首发病例，必要时应采集第二份血标本，距第一份血样采集日期间隔在7天以上。
（二）蚊媒标本采集疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴定后，填写媒介标本采集信息表，按照采集地点分装，每管10-20 Ro （三）标本保存、运送标本应-70°C以下保存，血液标本可-20°C以下保存，但不超过1周。
标本运送时采用低温冷藏运输，避免冻融，样本运输应遵守国家相关生物安全规定。
四、检测内容（-）实验室检测登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体，检测流程参见图1。
（二）复核检测1.送市或省级疾病预防控制机构的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。
2.疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因，完成序列分析。
3.每次暴发疫情应开展病毒全基因组序列分析。
登革热实验室检测指南
附件2登革热实验室检测指南一、目的（一）及时发现、诊断病例。
（二）及时了解伊蚊媒介携带登革病毒状况。
（三）病毒分型和溯源。
（四）为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。
二、检测对象（一）疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准WS216-2008）。
（二）伊蚊成蚊和幼虫。
三、样本采集、保存和运输（一）临床标本采集用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及时分离血清，分装2份，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中1份用于现场实验室检测，1份用于上级预防控制机构复核（附件1，附表1）。
1.登革热临床诊断病例及疑似病例，每次采集血液标本5mL。
2.登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴性），应采集双份血液标本，入院当天和出院前1天各一份。
3.疫点首发病例，必要时应采集第二份血标本，距第一份血样采集日期间隔在7天以上。
（二）蚊媒标本采集疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴定后，填写媒介标本采集信息表，按照采集地点分装，每管10-20只。
（三）标本保存、运送标本应-70℃以下保存，血液标本可-20℃以下保存，但不超过1周。
标本运送时采用低温冷藏运输，避免冻融，样本运输应遵守国家相关生物安全规定。
四、检测内容（一）实验室检测登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体，检测流程参见图1。
（二）复核检测1.送市或省级疾病预防控制机构的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。
2.疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因，完成序列分析。
3.每次暴发疫情应开展病毒全基因组序列分析。
4.实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应对恢复期血清进行IgM、IgG 抗体和/或中和抗体检测。
登革热实验室检测
6-10天
工作量大，需要培养 蚊虫 适于登革病毒分离
4-8天
细胞培养的设备与技 术 适于登革病毒分离
4-8天
细胞培养的设备与技 术 可用于病毒分离
需要多次传代
耗时长、费用高 不再推荐使用
病毒分离的流程
• • • • • • 蚊媒匀浆或血清； 加入细胞培养管或瓶； 37℃吸附1小时，每15分钟轻轻摇动一次； 补液； 33 ℃孵育3-7天，每日或隔日观察CPE； IFA检测，传代，IFA检测。单抗检测分型。
阴性检测结果不能排除近期感染 孕妇和携带类风湿因子的患者常可出现假阳性结果
适用于多种标本
临床标本
急性期全血、血清或血浆，脑脊液（0-5天） 4-8℃保存不超过2天 长时间保存-70 ℃以下或干冰
尸检组织标本应立即保存于-70
疫情暴发地区的蚊虫媒介
℃以下或干冰
适用于所有血清型，首次感染更敏感
尸检组织标本的NS1抗原检测
登革热实验室诊断技术及评价
病毒病预防控制所 李建东
内容概述
• • • • • • • 检测指标及动态变化 检测策略 抗原检测 病毒分离 核酸检测 抗体检测 常用检测试剂比较
登革病毒实验室检测指标
重要免疫原
诊断标记
RT-PCR
Y
Y
Y
Y
NS1： 膜相关NS1，mNS1 分泌型NS1，sNS1 发病第1-9天出现 病毒血症期必然出现的分子标识物 可高达50µg/mL
登革病毒首次感染
急性期 恢复期期 IgM ~90天 病毒血症 发热期 IgA ~45天 IgG
潜伏期
7
0
7
14
21
天
病毒分离 核酸检测 NS1抗原检测
登革热检测方法
附件1：免疫荧光法（IFA）检测IgG抗体 试验材料： （1）DV1～4型抗原片：DV标准毒株感染C6/36或BHK21细胞制备，低温干燥保存； （2）对照：登革热患者恢复期血清（阳性对照），非登革热患者血清阴性对照）； （3）羊抗人（或兔抗人）IgG荧光素标记抗体； （4）常用稀释液：pH7.2～7.4PBS、伊文思兰等； （5）荧光显微镜。
检测步骤： （1）用pH7.4，0.02mol/LPBS稀释待检血清，从1：20开始做4倍连续稀释至需要的稀释度。
（2）取出抗原片，用蒸馏水漂洗后，冷风吹干。
（3）用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢复期血清），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟（每次试验设阳、阴性对照）。
（4）用PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗涤1次脱盐，冷风吹干。
（5）用含1：3万的伊文思兰PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟，然后同（4）洗涤、漂洗、吹干。
（6）荧光显微镜观察结果。
结果判断： 细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。
根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，可将免疫荧光反应大致区分为1～4个“＋”。
检测抗体滴度时，以能观察到明显特异性荧光反应（＞“＋”）最高血清稀释度的倒数表示。
意义： 阳性结果，表明曾受到DV感染，＞1：80有诊断参考意义； 恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。
附件2：酶联免疫吸附试验（ELISA） 检测单份和/或双份血清IgG抗体 试验材料： （1）抗原： 阳性抗原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。
阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。
（2）辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体； （3）缓冲液： 包被液：pH9.6碳酸缓冲液； 稀释液：pH7.4PBS（含5%脱脂奶） 洗涤液：pH7.4PBS－T（0.05％吐温－20）； （4）显色液：A/B液 （5）终止液：4NH2SO4 （6）酶标板、酶标仪。
登革热诊疗指南
整理课件
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• （三）登革热的临床表现
• 登革热的临床表现随病人的年龄不同而变
化。15岁以下的儿童感染多数无症状或症 状很轻，婴幼儿患登革热常常表现为难以 鉴别的发热疾病。典型登革热多见于年长 儿童，青少年和成人，他们很少无症状。
整理课件
10
• 1.典型登革热
（1）发热 所有患者均发热。起病急， 先寒战或畏寒，随之体温迅速升高，24小 时内可达40℃。一般持续5～7d，然后骤降 至正常，热型多不规则，多数为弛张热型， 部分病例于第3～5d体温降至正常，1日后 又再升高，称为双峰热或鞍型热。儿童病 例起病较缓、热度也较低。
整理课件
20
• 5.DHF/DSS的恢复期
• DHF的病程多为7~10天。康复期病人表现
为窦性心动过缓或心律不齐。瘀点等皮疹 发生融合。
• DSS经及时扩容对症治疗后，病人在很短时
间内能平静地康复，生还者常在2~3天内恢 复。
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21
• （五）并发症和少见临床表现
• 1.脑病：东南亚等多国均有神经系统病变引起死
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8
临床特征
• 一、临床表现
• （一）潜伏期
• 本病潜伏期为3~14天，一般5~7天。在收集流行
病学资料时，应注意两周内病人旅游史，密切接 触者以及与其居住在同一地点的家庭成员和人群。
• （二）临床分型
• 按世界卫生组织标准分为典型登革热、登革出血
热和登革休克综合征3型。我国近年来所见的登革 热可分为典型登革热、轻型登革热和重型登革热。
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22
• 3.急性肾功能衰竭：常见于终末期的病人。 • 4.容血尿毒综合征：多发生于G-6-PD缺乏
的病人。
全国登革热病毒检测技术规范(2023年修订版)
全国登革热病毒检测技术规范(2023年修订版)登革热是由登革热病毒引起的传染病，在我国广泛流行。
为提高登革热病毒的检测效率和准确性，特制定本技术规范，规范全国范围内的登革热病毒检测工作。
1. 引言本文档对登革热病毒检测的技术要求、流程和结果报告进行规范，以确保检测结果的准确性和可比性。
2. 技术要求2.1. 检测方法使用PCR技术作为主要的登革热病毒检测方法。
确保使用合格的设备、试剂和实验室条件，以提供准确可靠的检测结果。
2.2. 采样采样应在发病后的早期阶段进行，包括患者的血液、尿液、唾液等样本。
采样过程需遵循无菌操作规范，确保样本的纯净度和有效性。
2.3. 基因组提取与扩增使用可靠的基因组提取方法，提取样本中的登革热病毒RNA 或DNA，并进行PCR扩增。
确保提取和扩增过程的准确性和可靠性。
2.4. 结果判读根据PCR扩增的结果，进行病毒检测的阳性和阴性判定。
在结果判读过程中，需参考相应的正、阴性对照样本，确保结果的准确性。
3. 检测流程3.1. 采样严格按照采样规范获取患者样本，确保样本的来源和完整性。
3.2. 样本处理对样本进行标记、保存和运输，确保样本的质量和完整性。
若需要保存样本进行后续检测，应采用适当的保存方法和条件。
3.3. 基因组提取按照基因组提取的标准操作程序，提取样本中的登革热病毒RNA或DNA，确保提取的纯度和完整性。
3.4. PCR扩增根据所选的PCR方法和试剂的说明，进行PCR扩增反应。
确保扩增反应的准确性和可靠性。
3.5. 结果判读根据PCR扩增结果，根据阳性和阴性对照样本进行结果的判读。
确保结果判读的准确性和标准性。
4. 结果报告4.1. 报告格式检测结果应使用统一的报告格式进行记录，包含患者信息、样本编号、检测日期、检测结果等重要信息。
4.2. 结果解读根据检测结果，提供对结果的解读，包括阳性和阴性判断以及相关的检测标准说明。
4.3. 结果通知将检测结果及时通知相关部门和个人，以便开展相应的控制和治疗措施。
登革热病例的标本采集和实验室检测
血清标本
分离流程：
①尽量采集病人的急性期和恢复期血清。采集时间：第一份 血应在发病3天内采集，最迟不晚于发病后7天。第二份血 应在发病2～4周采集。
②无菌采集患者静脉血3ml，加入到无菌干燥的试管中，标 明病人姓名、采集日期，并做好病人性别、年龄、发热日 期、出疹日期的资料登记。常温送到实验室分离血清。
-上清液分离核酸，进行RT-PCR或荧光PCR检测登革病毒 核酸。
标本的包装运输
《生物安全手册》 (WHO 3rd edition): 运送感染性 材料的基本三层包装：内层容器、第二层包装、 外层包装 水、防漏（带吸 收性材料）
外层包装：为第 二层包装提供物 理性保护、保持 低温（冰袋，4℃）
C6/36细胞培养分离登革病毒
标本类型：血清、脑脊液、蚊匀浆液
正常C6/36
病变C6/36（++）
CPE:细胞皱缩脱落、胀大成空泡、折光度增大、内容物增多
RT-PCR检测登革病毒基因
标本类型：血清、脑脊液、蚊匀浆液
产物电泳，根据条带大小判断目的核酸存在与否
实时荧光PCR检测登革病毒基因
标本类型：血清、脑脊液、蚊匀浆液
③ 2000rpm离心10分钟，分离血清；如果没有离心机，血标 本应静置，直到血清析出；
④小心吸取血清，避免吸到红细胞；在无菌条件下，移至无 菌的螺口离心管中；短期（7天内）保存置于4～8℃，长 期保存于－20 ℃。
脑脊液标本
分离流程：
标本采集应由临床医生完成。由腰椎穿刺无菌采 集脑脊液3～5ml，放于无菌螺口离心管内。标本 采集后应立即4℃送检。
蚊标本
采集、处理流程：
登革热诊疗指南
登革热诊疗指南
一、概述 ￭登革热是由登革病毒引起的，由伊蚊传播的急性虫媒传
染病 ￭临床以高热、肌肉骨关节痛、极度乏力、皮疹、出血倾
向、淋巴结肿大及白细胞、血小板减少为特征 ￭重症病例临床表现为严重出血、休克、严重脏器损伤等
登革热诊疗指南
二、病原学 ￭黄病毒科黄病毒属，单股正链RNA病毒 ￭外膜含型、群特异性抗原（脂蛋白） ￭ 1~4血清型，四型之间有交叉免疫反应 ￭ 2型的出血、大出血及死亡率高于其他型
登革热诊疗指南
六、实验室检查 1.周围血象：
WBC↓↓、 N%↓ 、 PLT ↓
可有HCT增高（>20%），或血红蛋白升高；
2.尿常规：少量蛋白和红细胞 3.生化及其它检查:
ALT，AST，CK，LDH，BUN升高 少数有总胆红素增高 PT及APTT时间延长 纤维蛋白原，凝血酶原及凝血因子显著降低 低蛋白血症，低钠血症，低钾血症，BUN升高
登革热诊疗指南
六、实验室检查
4.病原学及血清学检查: 急性期可应用登革热抗原（NS1）检测及病毒核酸检测进行早期诊断，有条
件的进行血清分型和病毒分离 初次感染，发病后3~5天可检出IgM 抗体，2周达到高峰，持续2~3月 发病后1周，可检出IgG抗体，可持续数年至终身
5.影像学检查: CT或胸片:一侧或双侧胸水，部分间质性肺炎 B超:肝脾肿大，胆囊壁一过性增厚，心包、腹腔和盆腔积液 CT和核磁共振:脑水肿、颅内出血、皮下组织渗出
登革热诊疗指南
四、临床表现 1.急性发热期
（4）出血：第5～8天 ￭ 25％～50％病例有不同程度的出血现象 ￭注射部位有瘀点 ￭皮下出血（出血点，紫癜，瘀斑、血肿） ￭牙龈出血、鼻衄、消化道出血、咯血、血尿及阴道出血等
登革热临床诊断标准
登革热临床诊断标准
摘要：
一、流行病学资料
二、典型症状
三、实验室检查
四、诊断注意事项
正文：
登革热是一种由蚊子传播的急性传染病，诊断及时对其治疗至关重要。
以下是登革热的临床诊断标准：
一、流行病学资料
在登革热流行季节，如有疫区或有外地传入可能的港口和旅游地区，发生大量高热病例时，应考虑本病。
二、典型症状
1.突然起病，畏寒、发热。
2.伴随全身疼痛、明显乏力。
3.出现皮疹、皮下出血。
4.浅表淋巴结肿大。
5.束臂试验阳性。
三、实验室检查
1.血常规：白细胞总数减少，血小板减少，中性粒细胞减少。
2.血清学检查：单份血清补体结合试验滴度超过1：32，红细胞凝集抑制
实验滴度超过1：1280有诊断意义。
双份血清恢复期抗体滴度比急性期升高四倍以上。
四、诊断注意事项
1.关注流行病学资料，特别是在登革热流行季节。
2.注意典型症状，如发热、皮疹、骨及关节剧痛和淋巴结肿大等。
3.实验室检查结果可作为辅助诊断依据。
4.疑似病例需与医疗机构密切联系，进行进一步检查和确诊。
一旦出现疑似登革热症状，请及时就诊并遵循医生的诊断和治疗建议。
登革热诊疗指南(2014年第2版)
国家卫生计生委办公厅关于印发登革热诊疗指南（2014年第2版）的通知国卫发明电…2014‟66号各省、自治区、直辖市卫生计生委，新疆生产建设兵团卫生局：为进一步加强登革热患者医疗救治，保障人民群众健康和生命安全，结合近期登革热诊疗情况，我委组织制定了《登革热诊疗指南（2014年第2版）》（可从国家卫生计生委网站下载）。
现印发给你们，供医疗机构在临床工作中参考使用。
国家卫生计生委办公厅2014年10月11日登革热诊疗指南（2014年第2版）登革热是由登革病毒引起的急性传染病，主要通过埃及伊蚊或白纹伊蚊叮咬传播。
一、病原学登革病毒属黄病毒科黄病毒属。
登革病毒颗粒呈球形，直径45～55nm。
登革病毒共有4个血清型（DENV-1、DENV-2 DENV-3和DENV-4），4种血清型均可感染人，其中2型重症率及病死率均高于其他型。
登革病毒对热敏感，56℃ 30分钟可灭活，但在4℃条件下其感染性可保持数周之久。
超声波、紫外线、0.05%甲醛溶液、乳酸、高锰酸钾、龙胆紫等均可灭活病毒。
病毒在pH 7～9时最为稳定，在-70℃或冷冻干燥状态下可长期存活。
二、流行病学（一）传染源。
登革热患者、隐性感染者和登革病毒感染的非人灵长类动物以及带毒的媒介伊蚊。
（二）传播途径。
主要通过伊蚊叮咬传播。
传播媒介主要为埃及伊蚊和白纹伊蚊。
（三）易感人群。
人群普遍易感，但感染后仅有部分人发病。
登革病毒感染后，人体可对同型病毒产生持久免疫力，但对异型病毒感染不能形成有效保护，若再次感染异型或多个不同血清型病毒，机体可能发生免疫反应，从而导致严重的临床表现。
（四）流行特征。
登革热流行于全球热带及亚热带地区，尤其是在东南亚、太平洋岛屿和加勒比海等100多个国家和地区。
我国各省均有输入病例报告，广东、云南、福建、浙江、海南等南方省份可发生本地登革热流行，主要发生在夏秋季，居家待业和离退休人员较多。
三、临床表现登革热的潜伏期一般为3～15天，多数5～8天。
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附件2登革热实验室检测指南一、目的（一）及时发现、诊断病例。
（二）及时了解伊蚊媒介携带登革病毒状况。
（三）病毒分型和溯源。
（四）为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。
二、检测对象（一）疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准WS216-2008）。
（二）伊蚊成蚊和幼虫。
三、样本采集、保存和运输（一）临床标本采集用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及时分离血清，分装2份，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中1份用于现场实验室检测，1份用于上级预防控制机构复核（附件1，附表1）。
1.登革热临床诊断病例及疑似病例，每次采集血液标本5mL。
2.登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴性），应采集双份血液标本，入院当天和出院前1天各一份。
3.疫点首发病例，必要时应采集第二份血标本，距第一份血样采集日期间隔在7天以上。
（二）蚊媒标本采集疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴定后，填写媒介标本采集信息表，按照采集地点分装，每管10-20只。
（三）标本保存、运送标本应-70℃以下保存，血液标本可-20℃以下保存，但不超过1周。
标本运送时采用低温冷藏运输，避免冻融，样本运输应遵守国家相关生物安全规定。
四、检测内容（一）实验室检测登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体，检测流程参见图1。
（二）复核检测1.送市或省级疾病预防控制机构的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。
2.疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因，完成序列分析。
3.每次暴发疫情应开展病毒全基因组序列分析。
4.实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应对恢复期血清进行IgM、IgG 抗体和/或中和抗体检测。
（三）媒介标本检测1.核酸检测捕获的伊蚊成蚊或幼虫，进行核酸分型检测，并扩增病毒E蛋白编码基因，完成序列分析。
2.病毒分离病毒核酸阳性的标本由国家、省或有条件的市级疾病预防控制机构进行病毒分离、基因组序列分析。
图1登革热疑似病例实验室检测流程五、实验室检测方法（一）临床标本检测1、病原学检测病原学检测主要适用于急性期血液标本。
（1）抗原检测：一般发病后6天内血液标本NS1抗原检出率高。
标本中检出NS1抗原可以确诊病毒感染，适用于现场快速检测，可用于早期诊断（附件2，3）。
（2）核酸检测：一般发病后6天内血液标本病毒核酸检出率高。
在病人血清中检出病毒核酸，可确诊而且能够分型，可用于早期诊断，但核酸检测容易因污染而产生假阳性，因此要求严格分区操作（附件4）。
（3）病毒分离：一般发病后5天内血液标本病毒分离率较高。
将标本接种于蚊源细胞（C6/36）或哺乳动物细胞（BHK21、Vero）进行分离培养（附件5），出现病变以后，用检测抗原或核酸的方法鉴定病毒。
分离到登革病毒可以确诊，但其耗时长，不适于快速诊断。
2.血清学检测血清学特异性抗体检测主要适用于发病5天以后血液样本，但需注意可能与其他黄病毒感染发生交叉反应。
（1）血清特异性IgM抗体：采用ELISA、免疫层析等方法检测。
IgM抗体阳性，提示患者可能新近感染登革病毒，适用于登革热早期诊断，但单份标本不能确诊（附件6）。
（2）血清特异性IgG抗体：采用ELISA、免疫荧光（IFA）、免疫层析等方法检测。
患者恢复期血清IgG 抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊（附件7，8）。
（3）中和抗体：采用空斑减少中和实验、微量中和实验等方法检测，可用于分型。
患者恢复期血清中和抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊。
（二）媒介标本检测1.标本处理将分类后的伊蚊成蚊或幼虫，按照采集地点，每10～20只为一份进行研磨处理（附件9）。
2.病毒核酸检测用RT-PCR的方法进行登革病毒核酸检测（见附件4）。
3.病毒分离病毒核酸阳性的标本进行病毒分离（见附件5）。
六、实验室质量控制（一）标本采集、保存和运送采集的标本要做好标识，并记录标本的基本信息和流行病学信息，按本指南要求采集、保存和运送。
（二）实验室检测1.根据发病时间，按本指南要求选择不同的检测方法。
2.核酸检测要防止各种污染，按操作规范设立相应对照。
3.应对检测试剂开展质控评价。
（三）各级疾病预防控制机构应定期开展督导检查、实验室技术人员培训与考核，及时发现问题。
七、结果的报告和反馈疫点首发病例、重症病例和输入病例实验室检测结果24小时内反馈标本送检单位。
省级疾病防控机构应每年1月将上一年登革热实验室病原学（包括核酸检测、病毒分离、序列测定）监测结果，报国家疾病预防控制中心（见附表2），。
八、生物安全登革热实验室检测应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》等相关规定要求，做好生物安全工作。
附件：1.血液标本采集.血清分离.运送.保存标准化操作程序2.酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序3.免疫层析法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序4.RT-PCR法分型检测登革病毒核酸标准操作程序5.细胞培养分离登革病毒6.IgM捕捉ELISA法（MacELISA）检测登革热IgM抗体7.酶联免疫法检测登革病毒IgG抗体标准操作程序8.免疫荧光法检测登革病毒IgG抗体标准操作程序9.蚊媒标本处理标准操作程序附表：1.疑似登革热病人检材送检一览表2.病原学检测结果一览表附件1血液标本采集、血清分离、运送、保存标准化操作程序1 目的正确采集血液标本、分离血清、运送和保存。
2 范围适用于有资质的人采集登革热患者或疑似患者血液标本、分离血清、编号、分装、保存和运送。
3 操作步骤3.1 采血3.1.1 用70%酒精擦拭静脉穿刺部位待30秒钟以上。
3.1.2 然后用一根碘酊或碘伏棉签消毒皮肤（1-2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒），从穿刺点向外以1.5-2cm直径画圈进行消毒。
3.1.3 用70%酒精脱碘。
3.1.4 严格执行三步消毒后(注意对碘过敏的患者，只能用70%酒精消毒，消毒60秒钟)，待穿刺部位酒精挥发干燥用无菌真空管，采集患者非抗凝血5mL。
3.2分离血清3.2.1轻缓颠倒采血管数次，使血液与促凝剂混匀后静置，待血块完全凝固（放置时间过长会造成溶血，避免留置过夜）。
3.2.23000rpm离心，5分钟，然后用无菌吸管小心取上清转入3支冻存管，应避免吸取血细胞。
3.2.3 标记。
用标签纸或持久性标记笔在冻存管的侧壁标记标本编号，顶端标记序列号，标记清楚后将血清放进标本盒，保存于2-8℃冰箱待初筛检测或运送保存。
在编码规则为“地区拼音首字母（JH）年份（2位）月（2位）-序列号（3位）”，如景洪市2013年8月份采集的第12份血标本的血清编号为JH1308-012，冻存管顶端分别标记012-1，012-2和012-3。
3.3 运送保存。
3.3.1 如果24小时能够完成初筛检测，并将标本运送至上级单位，运送前应将标本保存于2-8℃冰箱，运送时采用低温冷藏运输。
3.3.2 如果不能及时运送，运送前应将标本保存于-20℃冰箱，运送时采用干冰或低温冷藏运输。
3.3.3 样本长期保存应记录剩余血清量和盒中位置，保存于-70℃以下冰箱。
3.3.4 所有样本运输和保存应遵守国家相关生物安全规定。
4 注意事项4.1 使用后的注射器和针头应放置于耐扎的容器中，最后集中高压消毒，在任何情况下均不应试图将针头重新盖帽。
4.2 采血结束后脱掉手套并弃于耐高压的废弃袋中，以备集中高压灭菌，并立即用肥皂和水洗手。
4.3 若发生针刺、皮肤破损或其它损伤，应立即用肥皂和水清洗伤口，不要立即止血。
4.4 当血液污染了身体的任何地方或发生针刺等事故时，均应及时报告上级并按医疗救护规程进行评估和救护。
附件2酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序1 目的酶联免疫法检测患者血清中登革病毒NS1抗原。
2 适用范围适用于患者血清或血浆中登革热病毒NS1抗原的快速检测。
3 实验前准备3.1 核对被检样品（血清或血浆）患者的姓名、编号及检测项目等。
3.2检测前应将待测样品置于2-8℃冰箱或冰上。
4 检测项目及参数本方法检测项目为检测血清或血浆中登革热病毒抗原。
5 检测仪器设备和材料加样器、温箱、洗板机、含波长450nm的酶标仪、登革病毒抗原检测试剂盒（酶联免疫法）（万泰公司）6 检测的环境条件生物安全二级实验室（BSL-2）中进行,灭活后样本在生物安全一级实验室（BSL-1）内进行。
7操作步骤7.1 将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡30分钟，使用前将试剂轻轻震荡混匀。
7.2 配液：将试剂盒中浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释。
7.3 编号：将样品对应微孔板编号，每板设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔。
7.4 加稀释液：每孔加稀释液50µL，空白孔除外。
7.5 加样：分别在相应孔加入待测样品或阴阳性对照各50µL，空白孔除外。
7.6 温育：用封板膜封板后，置37℃温育60分钟。
7.7 每孔加酶标试剂50µL，空白孔除外，轻轻震荡混匀。
7.8 温育：用封板膜封板后，置37℃温育30分钟。
7.9 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。
7.10显色：每孔加入显色剂A、B液各50µL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
7.11测定：每孔加终止液50µL，10分钟内测定结果。
设定酶标仪波长于450nm处（建议使用双波长450nm/600-650nm检测），用空白孔调零后测定各孔A值。
8 结果判定8.1 临界值计算：临界值=0.10+阴性对照孔A值均值（阴性对照孔A值低于0.05者以0.05计算）。
8.2 阴性对照的正常值范围：阴性对照孔A≤0.1（若1孔A大于0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照大于0.1，应重复实验）。
8.3 阳性对照正常值范围：A≥0.8.8.4阳性判定：样品A值≥临界值者为登革病毒抗原阳性。
8.5阴性判定：样品A值＜临界值者为登革病毒抗原阴性。
9 意义结合临床信息，阳性结果可以诊断为登革病毒感染，但阴性结果并不排除登革病毒感染的可能。
附件3胶体金免疫层析法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序1 目的检测患者血液中登革病毒抗原。
2 适用范围检测患者血清、血浆、全血中登革热病毒抗原水平，主要用于登革病毒感染的辅助诊断。
3 实验前准备3.1 核对被检样品（血清或血浆）患者的姓名、编号及检测项目等。
3.2检测前应将待测样品置于2-8℃冰箱或冰上。
4 检测项目及参数本方法检测项目为检测血清或血浆中登革热病毒抗原。