登革热实验室检测指南
登革热实验室检测指南
登革热实验室检测指南附件2一、目的（一）及时发现、确诊病例。
（二）及时了解伊蚊媒介携带登革病毒状况。
（三）病毒分型和溯源。
（四）为登革热盛行趋势的预测、预警和制订预防对策、措施提供更多科学依据。
二、检测对象（一）疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准ws216-2021）。
（二）伊蚊成蚊和幼虫。
三、样本采集、保存和运输（一）临床标本收集用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及时分离血清，分装2份，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中1份用于现场实验室检测，1份用于上级预防控制机构复核（附件1，附表1）。
1.登革热临床确诊病例及疑似病例，每次收集血液标本5ml。
2.登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴性），应采集双份血液标本，入院当天和出院前1天各一份。
3.疫点首发病例，必要时应收集第二份血标本，距第一份血样收集日期间隔在7天以上。
（二）蚊媒标本采集疫点内收集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴别后，核对媒介标本收集信息表中，按照收集地点灌装，每管及10-20只。
（三）标本保存、运送标本应当-70℃以下留存，血液标本可以-20℃以下留存，但不少于1周。
标本载运时使用低温冷藏运输，防止冻融，样本运输应当严格遵守国家有关生物安全规定。
四、检测内容（一）实验室检测登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体，检测流程参见图1。
（二）核查检测1.送市或省级疾病预防控制机构的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。
2.疫点首发病例，重症病例、输出病例急性期标本应当使用pcr方法展开分型检测，阳性者拆分病毒，从临床标本或所拆分病毒中扩充e蛋白编码基因，顺利完成序列分析。
3.每次暴发疫情应开展病毒全基因组序列分析。
4.实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应付恢复期血清展开igm、igg抗体和/或中和抗体检测。
登革热诊断与实验室检测
特异性
检测时机
登革热不同诊断方法的可操作性和可信性
直接检测
可操作性
间接检测
病毒分离 核酸检测 NS1检测
可信性
IgM检测
IgG检测
登革病毒结构
细胞间病毒(未成熟)
细胞外病毒(成熟)
包膜糖蛋白
前M
(双体) 基质蛋白
核衣壳蛋白 (C蛋白)
登革病毒基因组结构
结构蛋白
非结构蛋白
登革病毒分离
细胞
昆虫细胞: C6/36、AP61 哺乳动物细胞: Vero、BHK21
YF PRNT 80% 减少 DV抗体用捕获法化学发光
接种17D疫苗后黄热和登革抗体
登革病毒感染后的黄热和登革抗体
检测登革病毒IgM抗体的试剂比较
真核rEIII蛋白MacELISA法检测早期登革病人血清
OD Value
3.5
dengue virus patients sera
3.0
hantan virus patients sera
登革分型实时PCR
登革抗体检测方法
检测IgM MacELISA、免疫层析(ICT)
检测IgG 间接法ELISA、GacELISA、IFA、 免疫层析(ICT)
中和试验 特异性高，可以用于分型
登革病人血清和乙脑交叉反应
乙脑、黄热和登革热的抗体交叉反应
登革病人血清和乙脑交叉反应
黄热病毒中和抗体和登革病毒抗体
NS1为50kD的糖蛋白 以300kD的六聚体形式分泌到血液中
DHF患者血清中NS1明显升高 激活补体 血管内皮细胞功能不全 血管通透性增加
NS1抗原特点及其应用
一、分泌性表达，易于检测 二、出现早，发病或发病前即可检出 三、浓度高，可达50 ug/ml 四、持续时间长，初次感染可持续9-12天 五、大量临床应用验证 六、NS1抗体可能用于血清分型 七、再次感染不易检测，在发病5-7天后很少能检出 八、高浓度NS1患者发病较重 九、可检测蚊子中的NS1抗原，用于监测
登革热诊疗指南
登革热诊疗指南一、概述登革热是由登革热病毒引起的急性传染性疾病，主要通过蚊子叮咬传播。
该疾病在热带和亚热带地区广泛流行，并以高热、头痛、皮疹和关节痛等症状特点明显。
本文档旨在为临床医生提供登革热的诊断和治疗指南，以便他们能够及时有效地处理这种疾病。
二、临床特点1.病毒感染后潜伏期：通常为4至7天，最长可达14天。
2.发病初期症状：高热、头痛、肌肉酸痛、关节痛和全身不适。
3.皮疹：发热2至5天后常伴有皮疹，疹子呈小点状或斑丘疹，可在躯干、四肢和面部等部位出现。
4.溶血性血小板减少：患者常伴有血小板减少症，出血倾向明显。
5.登革热的严重类型：部分患者可能会发展为严重登革热，表现为血小板减少、血浆漏出和器官功能损害。
三、诊断标准根据世界卫生组织制定的诊断标准，登革热的诊断需要满足以下条件：1.临床特征：发热持续2至7天，伴有至少两项症状：头痛、眼结膜充血、肌肉疼痛、关节痛、皮疹、出血现象等。
2.实验室检测：患者血清IgM和IgG抗体检测阳性，或病毒RNA、抗原检测阳性。
3.流行病学联系：患者近期有旅行史或居住地为登革热疫区。
四、治疗方法目前，登革热的治疗主要是对症治疗，包括以下几个方面：1.休息：患者在感染初期需要充分休息，保持良好的体力和精神状态。
2.液体补充：病人应饮食清淡，多饮清水和含电解质的液体，以防止脱水。
3.退热药物：对于发热的患者，可以使用对成人安全且适用的退热药物，如对乙酰氨基酚。
4.控制疼痛：可以使用非甾体类抗炎药（NSAIDs）或其他止痛药缓解头痛和关节痛。
5.监测血小板：对于有血小板减少症状的患者，需要密切监测血小板数量和功能，必要时进行输血。
6.预防并发症：需要密切观察患者的情况，及时发现并处理可能出现的并发症。
五、并发症预防和处理严重登革热可导致出血、血浆漏出和器官功能损害等严重并发症，因此需要做好以下预防和处理工作：1.全面监测：密切观察患者的生命体征、病情进展和实验室检查结果，及时发现并处理并发症。
登革热样本采集、保存和运输
检测方法
血清学检测
主要适用于发病5天以后血液样本，但需注意可能与其他黄 病毒感染发生交叉反应。
1、血清特异性IgM抗体：采用ELISA、免疫层析等方法检测。 IgM抗体阳性，提示患者可能新近感染登革病毒，适用于 登革热早期诊断，但单份标本不能确诊 2、血清特异性IgG抗体：采用ELISA、免疫荧光（IFA）、 免疫层析等方法检测。患者恢复期血清 IgG 抗体阳转或滴 度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊 3、中和抗体：采用空斑减少中和实验、微量中和实验等方 法检测，可用于分型。患者恢复期血清中和抗体阳转或滴 度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊。
免疫荧光法检测登革病毒IgG抗体
检验步骤：
1 、用pH7.4，0.02mol/L PBS稀释待检血清，从1:20开始做2倍连 续稀释至需要的稀释度。 2 、取出抗原片，用蒸馏水漂洗后，风干。 3 、用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检 血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上 排为急性期血清，下排为恢复期血清），在37℃水浴箱湿盒孵 育30分钟（每次试验同时设阳、阴性对照）。 4 、用PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗涤1次脱盐， 风干。 5 、用含1：3万的伊文思兰PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴 加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37 ℃水浴箱湿盒孵育30 分钟，然后同（4）洗涤、漂洗、吹干。 6 、荧光显微镜观察结果。
2、酶联免疫检测仪检测：
酶联免疫法检测登革病毒IgG抗体
检测仪器设备和材料 加样器、温箱、洗板机、含波长450nm的酶标仪、登革病毒 IgG抗体检测试剂盒，或实验室自备材料： 1 、抗原： 阳性抗原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。 阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。 2 、辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体； 3 、缓冲液： 包被液：pH9.6碳酸缓冲液； 稀释液：pH7.4 PBS（含5%脱脂奶） 洗涤液：pH7.4 PBS－T（0.05％吐温－20）； 4 、显色液：A/B液 5 、终止液：4NH2SO4 6 、酶标板、酶标仪。
登革热实验室检测指南.doc
附件2登革热实验室检测指南一、目的（一）及时发现、诊断病例。
（二）及时了解伊蚊媒介携带登革病毒状况。
（三）病毒分型和溯源。
（四）为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。
二、检测对象（一）疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准WS216-2008）。
（二）伊蚊成蚊和幼虫。
三、样本采集、保存和运输（一）临床标本采集用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及时分离血清，分装2份，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中1份用于现场实验室检测，1份用于上级预防控制机构复核（附件1，附表1）。
1.登革热临床诊断病例及疑似病例，每次采集血液标本5mL。
2.登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴性），应采集双份血液标本，入院当天和出院前1天各一份。
3.疫点首发病例，必要时应采集第二份血标本，距第一份血样采集日期间隔在7天以上。
（二）蚊媒标本采集疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴定后，填写媒介标本采集信息表，按照采集地点分装，每管10-20只。
（三）标本保存、运送标本应-70℃以下保存，血液标本可-20℃以下保存，但不超过1周。
标本运送时采用低温冷藏运输，避免冻融，样本运输应遵守国家相关生物安全规定。
四、检测内容（一）实验室检测登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体，检测流程参见图1。
（二）复核检测1.送市或省级疾病预防控制机构的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。
2.疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因，完成序列分析。
3.每次暴发疫情应开展病毒全基因组序列分析。
4.实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应对恢复期血清进行IgM、IgG 抗体和/或中和抗体检测。
登革热诊疗指南
登革热诊疗指南登革热诊疗指南1：简介1.1 疾病概述1.2 流行状况2：病因与传播2.1 病因2.2 传播途径2.3 潜伏期3：临床表现3.1 症状3.2 体征3.3 并发症4：实验室诊断4.1 血液检测4.2 分离与鉴定4.3 血清学检测4.4 分子生物学检测5：影像学检查5.1 X射线检查5.2 CT扫描5.3 MRI6：诊断标准6.1 主要诊断标准 6.2 次要诊断标准7：临床分型与分级7.1 临床分型7.2 严重程度分级8：治疗原则8.1 对症治疗8.2 对病因治疗8.3 常规综合治疗9：药物治疗9.1 解热镇痛药9.2 抗药物9.3 免疫治疗药物9.4 补液与营养支持药物 9.5 其他药物治疗10：并发症处理10：1 血小板减少10：2 出血10：3 创面感染10：4 其他并发症处理11：预防与控制11.1 流行病学调查11.2 个体预防11.3 社区防控11.4 医疗机构防控12：康复与护理12.1 疾病康复12.2 心理护理12.3 饮食护理12.4 生活护理13：附件注释：- 登革热：一种由登革热引起的传染病，主要通过蚊虫叮咬传播。
- 潜伏期：指感染到出现临床症状的时间间隔。
- X射线：常用于检查肺部病变和骨骼损伤的医学影像学方法。
- CT扫描：计算机断层扫描，通过X射线成像技术断层图像来检查患者内部器官结构。
- MRI：磁共振成像，通过利用局部磁场和无线电波产生高分辨率的人体组织图像。
- 血小板减少：血小板数量较正常人减少，容易导致出血现象。
- 登革热预防：包括个人预防措施和社区卫生防控措施两部分，旨在减少蚊虫叮咬和传播风险。
登革热检测规程完整
登革病毒IgM/IgG 抗体检测规程【方法】胶体金法【预期用途】登革热（Dengue Fever ）是一种由登革病毒引起的急性传染病，主要流行于热带和亚热带国家和地区。
登革病毒为单股正链RNA 病毒，在分类学上属于黄病毒科，黄病毒属（flavivirus ）。
病毒核心为RNA 与蛋白质组成的20 面立体对称的病毒颗粒，外层为两种糖蛋白组成的包膜，包膜含有型和群特异性抗原。
病毒基因编码3个结构蛋白（核衣壳蛋白C,膜蛋白M,包膜蛋白E）和7个非结构蛋白（NS1,NS2a,NS2b,NS3,NS4a,NS4b,NS5 ）。
登革病毒感染可导致机体产生免疫应答，并产生病毒特异性的抗体。
初次感染者，发病后3－5天可在血液中检出病毒IgM 抗体，发病2周后达到高峰，可维持2－3个月，发病 1 周后可检出病毒IgG 抗体，IgG 抗体可维持数年甚至终生。
检测临床登革热症状的病人样本中登革病毒抗体，有助于登革热的辅助诊断。
【检验原理】采用胶体金免疫层析技术，在玻璃纤维上预包被胶体金标记的登革病毒抗原（Au-Dengue-Ag ）和羊IgG（Au-羊IgG）,在硝酸纤维素膜上IgG检测线，IgM检测线和对照线处分别包被鼠抗人IgG单克隆抗体，鼠抗人IgM 单克隆抗体和鼠抗羊IgG 单克隆抗体。
检测阳性标本时，样本中登革热病毒IgG 抗体（或IgM 抗体）与Au-Dengue-Ag 结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过IgG 检测线（或IgM 检测线）时与预包被的鼠抗人IgG 单抗（或鼠抗人IgM 单抗）形成“Au-Dengue-Ag －Dengue 病毒抗体－鼠抗人IgG 单抗（或鼠抗人IgM 单抗）－固相材料”夹心物而富集显色，胶体金标记羊IgG 则在对照线与鼠抗羊IgG 单克隆抗体结合富集显色，阴性标本则仅在对照线处显色。
【试剂组成成分】1，登革病毒IgM/IgG 抗体试剂检测线：鼠抗人IgM 抗体、鼠抗人IgG 抗体对照线：鼠抗羊IgG 抗体结合垫：胶体金标记登革病毒抗原和胶体金标记羊IgG2 ，梓品稀释液3 ，2uL 吸管【样本要求】1 ，检测样本为血清或血浆，避免溶血。
登革热实验室检测
6-10天
工作量大，需要培养 蚊虫 适于登革病毒分离
4-8天
细胞培养的设备与技 术 适于登革病毒分离
4-8天
细胞培养的设备与技 术 可用于病毒分离
需要多次传代
耗时长、费用高 不再推荐使用
病毒分离的流程
• • • • • • 蚊媒匀浆或血清； 加入细胞培养管或瓶； 37℃吸附1小时，每15分钟轻轻摇动一次； 补液； 33 ℃孵育3-7天，每日或隔日观察CPE； IFA检测，传代，IFA检测。单抗检测分型。
阴性检测结果不能排除近期感染 孕妇和携带类风湿因子的患者常可出现假阳性结果
适用于多种标本
临床标本
急性期全血、血清或血浆，脑脊液（0-5天） 4-8℃保存不超过2天 长时间保存-70 ℃以下或干冰
尸检组织标本应立即保存于-70
疫情暴发地区的蚊虫媒介
℃以下或干冰
适用于所有血清型，首次感染更敏感
尸检组织标本的NS1抗原检测
登革热实验室诊断技术及评价
病毒病预防控制所 李建东
内容概述
• • • • • • • 检测指标及动态变化 检测策略 抗原检测 病毒分离 核酸检测 抗体检测 常用检测试剂比较
登革病毒实验室检测指标
重要免疫原
诊断标记
RT-PCR
Y
Y
Y
Y
NS1： 膜相关NS1，mNS1 分泌型NS1，sNS1 发病第1-9天出现 病毒血症期必然出现的分子标识物 可高达50µg/mL
登革病毒首次感染
急性期 恢复期期 IgM ~90天 病毒血症 发热期 IgA ~45天 IgG
潜伏期
7
0
7
14
21
天
病毒分离 核酸检测 NS1抗原检测
登革热诊断标准
登革热诊断标准
登革热的诊断标准包括临床症状和实验室检测两个方面：
1. 临床症状：患者在发病期间可能出现以下症状和体征：- 高热（达到或超过39°C）
- 头痛、眼眶痛、关节痛、肌肉痛
- 皮疹，多为弥漫性皮疹，常伴有瘙痒
- 鼻出血或牙龈出血
- 淋巴结肿大
- 腹痛、呕吐、腹泻
- 疲劳、乏力
- 其他症状，如呼吸困难、心慌、低血压等
2. 实验室检测：通过实验室检测可以进一步确认诊断，常用的检测方法有：
- PCR（聚合酶链反应）：检测病毒RNA或DNA的存在
- 酶联免疫吸附测定法（ELISA）：检测登革热病毒抗体
- 血液细胞计数：检测白细胞和血小板计数是否减少
根据以上临床症状和实验室检测结果，医生可以做出登革热的诊断。
同时，应与其他热带病毒感染进行鉴别诊断，如寨卡病毒感染、黄热病、乌干达克里米亚出血热等。
因此，如果怀疑患有登革热，建议就诊专科医生进行详细检查和确诊。
中国登革热临床诊断和治疗指南
输入性病例和本地感染病例：
输入病例（Imported case）包括境外输入病 例和境内输入病例两类。 境外输入病例指发病 前 14 天内到过登革热流行的国家或地区的病 例。 境内输入病例是指发病前 14 天内离开本 县区（现住址）、到过本县区外的登革热流行 地区的病例。
本地病例（Indigenous case）指发病前 14 天内未离开本县区（现住址）的登革热病例 。 地方性流行（Endemic）：登革热呈地方性流 行的地区， 登革病毒在人群和媒介伊蚊间持续 传播循环， 疫情连年不断；成人多已被感染， 新发病例多为儿童；可出现多种登革病毒血清 型循环。
束臂试验（Tourniquet test）：又称为毛细血 管脆性试验。在前臂屈侧肘弯下 4 cm 处画一 直径 5 cm 的圆圈， 用血压计袖带束于该侧上 臂， 先测定血压，然后使血压保持在收缩压和 舒张压之间， 持续 8 min 后解除压力。待皮肤 颜色恢复正常时， 计数圆圈内皮肤出现新的出 血点数， 新出血点超 过 10 个为束臂试验阳性。
四、临床特征
登革热的潜伏期一般 为1～14天，多数5～ 9天。
典型的登革热病程分 为三期， 即发热期、 极期和恢复期。 根据 病情严重程度， 登革 热分为普通登革热和 重症登革热两种临床 类型。
（一）病程及临床表现
1、发热期：患者通常急性起病， 首发症状为骤起高热，可伴畏寒， 24 小时内体温可达 40 ℃。除发 热外，患者还可出现以下症状： 头痛，眼眶痛， 全身肌肉、骨骼 和关节疼痛， 乏力， 恶心、呕吐 以及纳差， 腹痛， 腹泻等胃肠道 症状。 发热期一般持续 3 ～ 7 天。 于病程第 3 ～ 6 天在颜面、四肢 出现充血性皮疹或点状出血疹， 典型皮疹为四肢的针尖样出血点， 或融合成片的红斑疹， 其中可见 有散在小片的正常皮肤， 如红色 海洋中的岛屿，简称“皮岛”等。 可出现不同程度的出血现象， 如 皮下或黏膜出血、注射部位瘀点 瘀斑、牙龈出血、 鼻衄及束臂试 验阳性等。
全国登革热病毒检测技术规范(2023年修订版)
全国登革热病毒检测技术规范(2023年修订版)登革热是由登革热病毒引起的传染病，在我国广泛流行。
为提高登革热病毒的检测效率和准确性，特制定本技术规范，规范全国范围内的登革热病毒检测工作。
1. 引言本文档对登革热病毒检测的技术要求、流程和结果报告进行规范，以确保检测结果的准确性和可比性。
2. 技术要求2.1. 检测方法使用PCR技术作为主要的登革热病毒检测方法。
确保使用合格的设备、试剂和实验室条件，以提供准确可靠的检测结果。
2.2. 采样采样应在发病后的早期阶段进行，包括患者的血液、尿液、唾液等样本。
采样过程需遵循无菌操作规范，确保样本的纯净度和有效性。
2.3. 基因组提取与扩增使用可靠的基因组提取方法，提取样本中的登革热病毒RNA 或DNA，并进行PCR扩增。
确保提取和扩增过程的准确性和可靠性。
2.4. 结果判读根据PCR扩增的结果，进行病毒检测的阳性和阴性判定。
在结果判读过程中，需参考相应的正、阴性对照样本，确保结果的准确性。
3. 检测流程3.1. 采样严格按照采样规范获取患者样本，确保样本的来源和完整性。
3.2. 样本处理对样本进行标记、保存和运输，确保样本的质量和完整性。
若需要保存样本进行后续检测，应采用适当的保存方法和条件。
3.3. 基因组提取按照基因组提取的标准操作程序，提取样本中的登革热病毒RNA或DNA，确保提取的纯度和完整性。
3.4. PCR扩增根据所选的PCR方法和试剂的说明，进行PCR扩增反应。
确保扩增反应的准确性和可靠性。
3.5. 结果判读根据PCR扩增结果，根据阳性和阴性对照样本进行结果的判读。
确保结果判读的准确性和标准性。
4. 结果报告4.1. 报告格式检测结果应使用统一的报告格式进行记录，包含患者信息、样本编号、检测日期、检测结果等重要信息。
4.2. 结果解读根据检测结果，提供对结果的解读，包括阳性和阴性判断以及相关的检测标准说明。
4.3. 结果通知将检测结果及时通知相关部门和个人，以便开展相应的控制和治疗措施。
登革热诊疗指南
登革热诊疗指南
一、概述 ￭登革热是由登革病毒引起的，由伊蚊传播的急性虫媒传
染病 ￭临床以高热、肌肉骨关节痛、极度乏力、皮疹、出血倾
向、淋巴结肿大及白细胞、血小板减少为特征 ￭重症病例临床表现为严重出血、休克、严重脏器损伤等
登革热诊疗指南
二、病原学 ￭黄病毒科黄病毒属，单股正链RNA病毒 ￭外膜含型、群特异性抗原（脂蛋白） ￭ 1~4血清型，四型之间有交叉免疫反应 ￭ 2型的出血、大出血及死亡率高于其他型
登革热诊疗指南
六、实验室检查 1.周围血象：
WBC↓↓、 N%↓ 、 PLT ↓
可有HCT增高（>20%），或血红蛋白升高；
2.尿常规：少量蛋白和红细胞 3.生化及其它检查:
ALT，AST，CK，LDH，BUN升高 少数有总胆红素增高 PT及APTT时间延长 纤维蛋白原，凝血酶原及凝血因子显著降低 低蛋白血症，低钠血症，低钾血症，BUN升高
登革热诊疗指南
六、实验室检查
4.病原学及血清学检查: 急性期可应用登革热抗原（NS1）检测及病毒核酸检测进行早期诊断，有条
件的进行血清分型和病毒分离 初次感染，发病后3~5天可检出IgM 抗体，2周达到高峰，持续2~3月 发病后1周，可检出IgG抗体，可持续数年至终身
5.影像学检查: CT或胸片:一侧或双侧胸水，部分间质性肺炎 B超:肝脾肿大，胆囊壁一过性增厚，心包、腹腔和盆腔积液 CT和核磁共振:脑水肿、颅内出血、皮下组织渗出
登革热诊疗指南
四、临床表现 1.急性发热期
（4）出血：第5～8天 ￭ 25％～50％病例有不同程度的出血现象 ￭注射部位有瘀点 ￭皮下出血（出血点，紫癜，瘀斑、血肿） ￭牙龈出血、鼻衄、消化道出血、咯血、血尿及阴道出血等
登革热诊疗指南(2014年第2版)
国家卫生计生委办公厅关于印发登革热诊疗指南（2014年第2版）的通知国卫发明电…2014‟66号各省、自治区、直辖市卫生计生委，新疆生产建设兵团卫生局：为进一步加强登革热患者医疗救治，保障人民群众健康和生命安全，结合近期登革热诊疗情况，我委组织制定了《登革热诊疗指南（2014年第2版）》（可从国家卫生计生委网站下载）。
现印发给你们，供医疗机构在临床工作中参考使用。
国家卫生计生委办公厅2014年10月11日登革热诊疗指南（2014年第2版）登革热是由登革病毒引起的急性传染病，主要通过埃及伊蚊或白纹伊蚊叮咬传播。
一、病原学登革病毒属黄病毒科黄病毒属。
登革病毒颗粒呈球形，直径45～55nm。
登革病毒共有4个血清型（DENV-1、DENV-2 DENV-3和DENV-4），4种血清型均可感染人，其中2型重症率及病死率均高于其他型。
登革病毒对热敏感，56℃ 30分钟可灭活，但在4℃条件下其感染性可保持数周之久。
超声波、紫外线、0.05%甲醛溶液、乳酸、高锰酸钾、龙胆紫等均可灭活病毒。
病毒在pH 7～9时最为稳定，在-70℃或冷冻干燥状态下可长期存活。
二、流行病学（一）传染源。
登革热患者、隐性感染者和登革病毒感染的非人灵长类动物以及带毒的媒介伊蚊。
（二）传播途径。
主要通过伊蚊叮咬传播。
传播媒介主要为埃及伊蚊和白纹伊蚊。
（三）易感人群。
人群普遍易感，但感染后仅有部分人发病。
登革病毒感染后，人体可对同型病毒产生持久免疫力，但对异型病毒感染不能形成有效保护，若再次感染异型或多个不同血清型病毒，机体可能发生免疫反应，从而导致严重的临床表现。
（四）流行特征。
登革热流行于全球热带及亚热带地区，尤其是在东南亚、太平洋岛屿和加勒比海等100多个国家和地区。
我国各省均有输入病例报告，广东、云南、福建、浙江、海南等南方省份可发生本地登革热流行，主要发生在夏秋季，居家待业和离退休人员较多。
三、临床表现登革热的潜伏期一般为3～15天，多数5～8天。
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附件2登革热实验室检测指南一、目的（一）及时发现、诊断病例。
（二）及时了解伊蚊媒介携带登革病毒状况。
（三）病毒分型和溯源。
（四）为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。
二、检测对象（一）疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准WS216-2008）。
（二）伊蚊成蚊和幼虫。
三、样本采集、保存和运输（一）临床标本采集用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及时分离血清，分装2份，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中1份用于现场实验室检测，1份用于上级预防控制机构复核（附件1，附表1）。
1.登革热临床诊断病例及疑似病例，每次采集血液标本5mL。
2.登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴性），应采集双份血液标本，入院当天和出院前1天各一份。
3.疫点首发病例，必要时应采集第二份血标本，距第一份血样采集日期间隔在7天以上。
（二）蚊媒标本采集疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴定后，填写媒介标本采集信息表，按照采集地点分装，每管10-20只。
（三）标本保存、运送标本应-70℃以下保存，血液标本可-20℃以下保存，但不超过1周。
标本运送时采用低温冷藏运输，避免冻融，样本运输应遵守国家相关生物安全规定。
四、检测内容（一）实验室检测登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体，检测流程参见图1。
（二）复核检测1.送市或省级疾病预防控制机构的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。
2.疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因，完成序列分析。
3.每次暴发疫情应开展病毒全基因组序列分析。
4.实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应对恢复期血清进行IgM、IgG 抗体和/或中和抗体检测。
（三）媒介标本检测1.核酸检测捕获的伊蚊成蚊或幼虫，进行核酸分型检测，并扩增病毒E蛋白编码基因，完成序列分析。
2.病毒分离病毒核酸阳性的标本由国家、省或有条件的市级疾病预防控制机构进行病毒分离、基因组序列分析。
图1登革热疑似病例实验室检测流程五、实验室检测方法（一）临床标本检测1、病原学检测病原学检测主要适用于急性期血液标本。
（1）抗原检测：一般发病后6天内血液标本NS1抗原检出率高。
标本中检出NS1抗原可以确诊病毒感染，适用于现场快速检测，可用于早期诊断（附件2，3）。
（2）核酸检测：一般发病后6天内血液标本病毒核酸检出率高。
在病人血清中检出病毒核酸，可确诊而且能够分型，可用于早期诊断，但核酸检测容易因污染而产生假阳性，因此要求严格分区操作（附件4）。
（3）病毒分离：一般发病后5天内血液标本病毒分离率较高。
将标本接种于蚊源细胞（C6/36）或哺乳动物细胞（BHK21、Vero）进行分离培养（附件5），出现病变以后，用检测抗原或核酸的方法鉴定病毒。
分离到登革病毒可以确诊，但其耗时长，不适于快速诊断。
2.血清学检测血清学特异性抗体检测主要适用于发病5天以后血液样本，但需注意可能与其他黄病毒感染发生交叉反应。
（1）血清特异性IgM抗体：采用ELISA、免疫层析等方法检测。
IgM抗体阳性，提示患者可能新近感染登革病毒，适用于登革热早期诊断，但单份标本不能确诊（附件6）。
（2）血清特异性IgG抗体：采用ELISA、免疫荧光（IFA）、免疫层析等方法检测。
患者恢复期血清IgG抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊（附件7，8）。
（3）中和抗体：采用空斑减少中和实验、微量中和实验等方法检测，可用于分型。
患者恢复期血清中和抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊。
（二）媒介标本检测1.标本处理将分类后的伊蚊成蚊或幼虫，按照采集地点，每10～20只为一份进行研磨处理（附件9）。
2.病毒核酸检测用RT-PCR的方法进行登革病毒核酸检测（见附件4）。
3.病毒分离病毒核酸阳性的标本进行病毒分离（见附件5）。
六、实验室质量控制（一）标本采集、保存和运送采集的标本要做好标识，并记录标本的基本信息和流行病学信息，按本指南要求采集、保存和运送。
（二）实验室检测1.根据发病时间，按本指南要求选择不同的检测方法。
2.核酸检测要防止各种污染，按操作规范设立相应对照。
3.应对检测试剂开展质控评价。
（三）各级疾病预防控制机构应定期开展督导检查、实验室技术人员培训与考核，及时发现问题。
七、结果的报告和反馈疫点首发病例、重症病例和输入病例实验室检测结果24小时内反馈标本送检单位。
省级疾病防控机构应每年1月将上一年登革热实验室病原学（包括核酸检测、病毒分离、序列测定）监测结果，报国家疾病预防控制中心（见附表2），将结果发送至denguetest@。
八、生物安全登革热实验室检测应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》等相关规定要求，做好生物安全工作。
附件：1.血液标本采集.血清分离.运送.保存标准化操作程序2.酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序3.免疫层析法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序4.RT-PCR法分型检测登革病毒核酸标准操作程序5.细胞培养分离登革病毒6.IgM捕捉ELISA法（MacELISA）检测登革热IgM抗体7.酶联免疫法检测登革病毒IgG抗体标准操作程序8.免疫荧光法检测登革病毒IgG抗体标准操作程序9.蚊媒标本处理标准操作程序附表：1.疑似登革热病人检材送检一览表2.病原学检测结果一览表附件1血液标本采集、血清分离、运送、保存标准化操作程序1目的正确采集血液标本、分离血清、运送和保存。
2范围适用于有资质的人采集登革热患者或疑似患者血液标本、分离血清、编号、分装、保存和运送。
3操作步骤3.1采血3.1.1用70%酒精擦拭静脉穿刺部位待30秒钟以上。
3.1.2然后用一根碘酊或碘伏棉签消毒皮肤（1-2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒），从穿刺点向外以1.5-2cm直径画圈进行消毒。
3.1.3用70%酒精脱碘。
3.1.4严格执行三步消毒后(注意对碘过敏的患者，只能用70%酒精消毒，消毒60秒钟)，待穿刺部位酒精挥发干燥用无菌真空管，采集患者非抗凝血5mL。
3.2分离血清3.2.3标记。
用标签纸或持久性标记笔在冻存管的侧壁标记标本编号，顶端标记序列号，标记清楚后将血清放进标本盒，保存于2-8℃冰箱待初筛检测或运送保存。
在编码规则为“地区拼音首字母（JH）年份（2位）月（2位）-序列号（3位）”，如景洪市2013年8月份采集的第12份血标本的血清编号为JH1308-012，冻存管顶端分别标记012-1，012-2和012-3。
3.3运送保存。
3.3.1如果24小时能够完成初筛检测，并将标本运送至上级单位，运送前应将标本保存于2-8℃冰箱，运送时采用低温冷藏运输。
3.3.2如果不能及时运送，运送前应将标本保存于-20℃冰箱，运送时采用干冰或低温冷藏运输。
3.3.3样本长期保存应记录剩余血清量和盒中位置，保存于-70℃以下冰箱。
3.3.4所有样本运输和保存应遵守国家相关生物安全规定。
4注意事项4.1使用后的注射器和针头应放置于耐扎的容器中，最后集中高压消毒，在任何情况下均不应试图将针头重新盖帽。
4.2采血结束后脱掉手套并弃于耐高压的废弃袋中，以备集中高压灭菌，并立即用肥皂和水洗手。
4.3若发生针刺、皮肤破损或其它损伤，应立即用肥皂和水清洗伤口，不要立即止血。
4.4当血液污染了身体的任何地方或发生针刺等事故时，均应及时报告上级并按医疗救护规程进行评估和救护。
附件2酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序1目的酶联免疫法检测患者血清中登革病毒NS1抗原。
2适用范围适用于患者血清或血浆中登革热病毒NS1抗原的快速检测。
3实验前准备3.1核对被检样品（血清或血浆）患者的姓名、编号及检测项目等。
3.2检测前应将待测样品置于2-8℃冰箱或冰上。
4检测项目及参数本方法检测项目为检测血清或血浆中登革热病毒抗原。
5检测仪器设备和材料加样器、温箱、洗板机、含波长450nm的酶标仪、登革病毒抗原检测试剂盒（酶联免疫法）（万泰公司）6检测的环境条件生物安全二级实验室（BSL-2）中进行,灭活后样本在生物安全一级实验室（BSL-1）内进行。
7操作步骤7.1将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡30分钟，使用前将试剂轻轻震荡混匀。
7.2配液：将试剂盒中浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释。
7.3编号：将样品对应微孔板编号，每板设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔。
7.4加稀释液：每孔加稀释液50μL，空白孔除外。
7.5加样：分别在相应孔加入待测样品或阴阳性对照各50μL，空白孔除外。
7.6温育：用封板膜封板后，置37℃温育60分钟。
7.7每孔加酶标试剂50μL，空白孔除外，轻轻震荡混匀。
7.8温育：用封板膜封板后，置37℃温育30分钟。
7.9洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。
7.10显色：每孔加入显色剂A、B液各50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
7.11测定：每孔加终止液50μL，10分钟内测定结果。
设定酶标仪波长于450nm处（建议使用双波长450nm/600-650nm检测），用空白孔调零后测定各孔A值。
8结果判定8.1临界值计算：临界值=0.10+阴性对照孔A值均值（阴性对照孔A值低于0.05者以0.05计算）。
8.2阴性对照的正常值范围：阴性对照孔A≤0.1（若1孔A大于0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照大于0.1，应重复实验）。
8.3阳性对照正常值范围：A≥0.8.8.4阳性判定：样品A值≥临界值者为登革病毒抗原阳性。
8.5阴性判定：样品A值＜临界值者为登革病毒抗原阴性。
9意义结合临床信息，阳性结果可以诊断为登革病毒感染，但阴性结果并不排除登革病毒感染的可能。
附件3胶体金免疫层析法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序1目的检测患者血液中登革病毒抗原。
2适用范围检测患者血清、血浆、全血中登革热病毒抗原水平，主要用于登革病毒感染的辅助诊断。
3实验前准备3.1核对被检样品（血清或血浆）患者的姓名、编号及检测项目等。
3.2检测前应将待测样品置于2-8℃冰箱或冰上。
4检测项目及参数本方法检测项目为检测血清或血浆中登革热病毒抗原。
5检测仪器设备和材料加样器、登革热病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）6检测的环境条件生物安全二级实验室（BSL-2）中进行,灭活后样本在生物安全一级实验室（BSL-1）内进行。
7检测步骤7.1将试剂盒和待检样本自冰箱中取出平衡至室温。
7.2当准备好测试时，打开密封的铝箔袋，取出检测卡，平放于水平桌面上。