骨髓细胞微核试验
实验五小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞的采集与处理
小鼠麻醉
将小鼠麻醉，并固定在 操作台上。
暴露骨髓
用消毒手术刀切开小鼠 的腿骨，暴露骨髓腔。
采集骨髓细胞
用注射器吸取生理盐水， 冲洗骨髓腔，收集骨髓
细胞。
细胞处理
将采集的骨髓细胞进行 洗涤、离心、分离等处 理，得到所需的细胞样
本。
骨髓细胞的培养与观察
细胞培养
将处理后的骨髓细胞接种在细胞 培养皿中，加入适量的细胞培养 基，在适宜的温度和湿度条件下 进行培养。
率之间存在正相关关系。
本实验为进一步研究致突变物的 致突变作用提供了有力证据，有 助于深入了解致突变物的致癌机
制。
对实验结果的理解与讨论
本实验结果表明，致突变物能够诱导小 鼠骨髓细胞微核的形成，这可能是致突 变物导致基因突变和细胞恶性转化的重 要机制之一。
实验结果还提示，致突变物的致突变作用可 能与其在体内的代谢活化有关，因此需要进 一步研究致突变物的代谢活化过程及其与微 核形成之间的关系。
实验五小鼠骨髓细胞 微核试验
目录
CONTENTS
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果分析 • 结论与讨论
01 实验目的
了解微核试验的原理
微核试验是一种用于检测染色体畸变和DNA损伤的细胞遗传 学方法。它通过观察细胞中微核（微小的细胞核）的数量， 来评估细胞受到的遗传损伤程度。
染色体结构畸变
分析实验组和对照组的染色体结构畸变类型，如断裂、倒位、重 复等。
染色体数目畸变
观察染色体数目畸变情况，包括非整倍体、多倍体等。
畸变类型与实验条件关系
探讨不同实验条件下染色体畸变类型的差异及其与实验条件的关系。
实验结果与预期结果的比较
小鼠骨髓细胞微核试验
五、作业
1. 观察并记数细胞微核率； 2. 用统计学软件SPSS统计结果。
ห้องสมุดไป่ตู้
小鼠骨髓细胞微核试验
一、实验目的
1． 观察诱变物质产生的微核； 2． 了解微核测定的方法与意义，计算微核 率。
二、实验原理
微核（Micronuclei）是真核类生物细胞中的一种异常结构， 往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。在细胞间 期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主 核1/3 以下。 已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈 正相关，这一点和染色体畸变一样。所以，可用间期的微 核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。 目前国内外不少部门已经把微核测试用于辐射损伤，辐射 防护，化学诱变剂，新药实验，染色体遗传疾病及癌症前 期诊断等各方面。
三、实验材料
小鼠骨髓
四、实验步骤
1. 实验前6小时用对苯二酚80mg/kg注射于小鼠腹腔内， 处死动物，用0.85%的生理盐水吹出股骨骨髓，离心1000 转/分5分钟，除上清液，滴入少量小牛血清混匀后涂片。 2. 固定：放入甲醇和冰醋酸固定液中固定5-10分钟； 3. 染色：直接在Gimsa染液中染色10分钟，然后冲洗； 用滤纸擦干载片背面的水分，再用滤纸轻轻吸干载片上面 的水分，取出盖上盖片； 4. 观察：嗜多染红细胞呈灰兰色，成熟红细胞呈桔红色， 每只动物计数1000-2000个嗜多染红细胞，微核率为千分 之2.58+0.41。
骨髓细胞微核实验
•实验原理
机理： 1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点的染色体 环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中 2 断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向移动， 从而遗留在细胞质中 结论：
微核试验能检测化学或其他物质因素诱导产生的染色 体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点
•有核细胞中
•微核难与正常核分叶
•及核突出物区别
•微
•核
•实
•无核细胞
•验
•红细胞
红细胞的分化成熟过程
小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成
环磷酰胺（CTX）
❖ 最常用的烷化剂类抗肿瘤药。
❖ 在体外无抗肿瘤活性，进入体内经转化、分解，生成酰 胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用。
❖ 副作用明显，有恶心、食欲减退、脱发、白细胞减少、 中毒性膀胱炎、肝功能损伤等。
❖ 具有显著的遗传、生殖毒性：停经或精子缺乏，妊娠初 期时给予可致畸胎。
❖ 用药后24-30小时，骨髓中微核形成达峰。
•8
结果
•示小鼠骨髓正常 嗜多染红细胞
•示小鼠骨髓嗜多染 红细胞中一个微核
•9
•示小鼠骨髓嗜多染红细胞中两个微核
•10
•示小鼠骨髓嗜多染红细胞中多个微核
•11
Giemsa染色
染 毒
•推片：30度角；
后
操
•晾干：一定要干；
作
步
•固定：甲醇固定10min,
骤
需要晾干； •染色：Gimesa染液染
色（10~15min） •冲洗：蒸馏水冲洗，晾
干•阅片: 观察微核。
推片方法
实验方法和步骤
观察与计数：低倍镜下选择分布均匀，染 色较好的区域
油镜下观察计数
骨髓细胞微核实验报告
骨髓细胞微核实验报告1. 背景骨髓细胞微核实验是一种常用的细胞遗传毒性检测方法，用于评估物质对人体细胞的影响。
该实验可以通过观察细胞核中的微核数量来判断物质是否具有诱发染色体损伤的能力。
在临床研究和毒理学评价中，骨髓细胞微核实验被广泛应用于药物筛选、环境污染物评估和职业危害监测等领域。
2. 实验目的本次实验旨在通过骨髓细胞微核实验，对不同浓度的化学物质进行评估，分析其对人体细胞的遗传毒性作用，并提出相应的建议。
3. 实验方法3.1 实验材料和设备•骨髓细胞培养基•不同浓度的化学物质溶液•细胞培养器•显微镜•细胞计数板•玻璃干片3.2 实验步骤1.采集实验对象的骨髓细胞，并将其接种在含有培养基的细胞培养器中，保持适宜的温度和湿度。
2.将不同浓度的化学物质溶液分别加入不同培养器中，同时设置对照组。
3.在一定时间后，将细胞样本离心并进行固定处理。
4.制备玻璃干片，并使用吉姆萨染色法染色。
5.在显微镜下观察细胞核中的微核数量，并记录下来。
4. 数据分析根据实验结果，我们可以得出以下结论：1.不同浓度的化学物质对骨髓细胞核中微核数量产生了影响。
随着化学物质浓度的增加，微核数量呈现出明显的上升趋势。
2.与对照组相比较，实验组细胞核中微核数量明显增加，表明该化学物质具有一定的遗传毒性作用。
5. 结果讨论本次实验结果表明该化学物质具有一定的遗传毒性作用。
微核是染色体损伤的指示器之一，其数量的增加可能意味着染色体断裂、染色体片段丢失或整个染色体的缺失。
这些染色体损伤与遗传突变和癌症等疾病的发生相关。
基于实验结果，我们建议：1.避免长时间接触该化学物质，特别是高浓度的暴露。
2.在工作场所进行必要的防护措施，如佩戴防护口罩、手套和工作服等。
3.进一步深入研究该化学物质的毒性机制和致突变潜能，以便更好地评估其对人体健康的风险。
6. 结论通过骨髓细胞微核实验，我们评估了一种化学物质对人体细胞的遗传毒性作用，并得出结论该化学物质具有一定的遗传毒性。
兽药小鼠骨髓细胞微核试验指导原则
为了确保小鼠骨髓细胞微核试验结果的真实性、可靠性和可追溯性，根据新 兽药研究的规律，结合国内兽药毒理学评价的实际情况制定了本指导原则。
（二）适用范围
本指导原则适用于兽用化学药品、中兽药、消毒剂及饲料药物添加剂的哺乳 动物体细胞遗传毒性检测。
二、试验设计
（一）材料与方法
1.实验动物 SPF小鼠，7～12周龄，体重25～30g，100只左右，雌、雄各半。 2.试剂 （1）致突变阳性对照物 环磷酰胺，分析纯以上，含量不低于98.5%。
（2）其他试剂 甲醇：分析纯； 甘油：分析纯； 磷酸二氢钾：分析纯； 磷酸氢二钠：分析纯； 姬姆萨（Giemsa）染料：分析纯； 小牛血清：分析纯。 过滤除菌后放入56℃恒温水浴中保温1h进行灭活。储存于4℃冰箱或冰盒里 备用。 （3）Giemsa 贮备液配制 称取Giemsa染料3.80g于研钵中，加入375 mL甲醇（分析纯）一起研磨，待 完全溶解后再加入125 mL甘油。移入试剂瓶内，置37℃恒温箱保温48h，其间振 摇数次, 两周后过滤可用。 （4）1/15mo1/L 磷酸盐缓冲液（pH6.8）配制 分别称取磷酸二氢钾（KH2PO4）9.08g和磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O） 23.88g，加蒸馏水980mL溶解，用酸度计调整pH至6.8，转入1000mL容量瓶，用 蒸馏水定容至1000mL。 （5）Giemsa 工作液配制 取1份Giemsa贮备液与6份1/15mo1/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）混合即成，临用 时配制。 3.仪器设备 （1）台式离心机 （2）生物显微镜（带 100×油镜头） （3）恒温水浴（温控误差士 0.5℃） （4）细胞计数器 （5）解剖器械、载玻片、注射器、灌胃针头等实验室常用仪器设备
实验三小鼠骨髓细胞微核试验
实验三小鼠骨髓细胞微核试验实验三：小鼠骨髓细胞微核试验一、实验目的本实验旨在通过观察小鼠骨髓细胞微核率的变化，了解并评估骨髓细胞受到的损伤程度，为进一步研究生物样品中的毒性物质及其潜在危害提供依据。
二、实验原理微核试验是一种检测染色体畸变的快速、敏感的方法，常用于评价各种因素对机体的遗传毒性。
微核是由染色体的片段或整个染色体在细胞分裂后期或末期未能进入子代细胞核而形成的，因此微核率的高低可反映细胞染色体受损的程度。
骨髓细胞微核试验常用于检测体内外接触毒物的程度及检测药物的遗传毒性。
三、实验步骤1.选取健康的成年小鼠，进行试验前处理，包括脱毛、称重等。
2.对小鼠进行腹腔注射或口服给予不同剂量的待测毒物。
3.分别于24小时、48小时和72小时三个时间段采集小鼠骨髓细胞，制备骨髓细胞涂片。
4.对涂片进行染色处理，以便观察和计数。
5.在显微镜下观察每个涂片，记录微核数并计算微核率。
6.统计分析数据，对比不同剂量组与对照组的微核率差异。
7.根据实验结果，评估待测毒物的遗传毒性及对骨髓细胞的损伤程度。
四、实验结果与数据分析经过对小鼠骨髓细胞微核率的观察和计数，我们得到了不同剂量组与对照组的微核率数据。
通过对比分析，我们发现随着待测毒物剂量的增加，小鼠骨髓细胞的微核率也逐渐升高。
这表明待测毒物具有明显的遗传毒性，能够导致骨髓细胞的损伤。
为了更直观地展示实验结果，我们可以使用柱状图或折线图来表示不同剂量组与对照组之间的微核率差异。
通过观察图表，可以清楚地看到随着毒物剂量的增加，微核率也逐渐升高。
这进一步证实了待测毒物的遗传毒性和对骨髓细胞的损伤作用。
五、实验结论通过本实验，我们得出以下结论：1.待测毒物具有明显的遗传毒性，能够导致小鼠骨髓细胞的损伤。
2.随着待测毒物剂量的增加，小鼠骨髓细胞的微核率也逐渐升高。
3.实验结果提示，待测毒物可能对机体产生一定的危害作用，需要进一步研究其对人体健康的潜在影响。
4.微核试验作为一种快速、敏感的检测方法，可用于评估生物样品中的毒性物质及其潜在危害。
毒理学 实验三、微核试验
两次染毒：第一次染毒后24小时进行第二次染毒， 6小时后取样；
多次染毒：每天染毒1次，连续染毒5天， 末次染毒后24小时取样。
7
2．骨髓液的制备和涂片
处死：颈椎脱臼法 处理： 取股骨，去掉血污和肌肉，用弯止血钳将骨髓
挤于预先滴有生理盐水的清洁载玻片上，混合均匀后推片
微核试验是观察受试倍体诱变剂(染色体损伤)。 传统的微核试验是体内试验, 常用细胞小鼠骨髓多染红细胞(PCE)
3
微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常 核的分叶及核突出物相区别。由于红细胞在成熟之前最后一 次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，
实验三、小鼠骨髓细胞微核试验
1
微核(Micronucleus)的概念
微核的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单 体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色 体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单 独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质 内，因比主核小，故称微核。
2
微核试验(Micronucleus test，MNT)的概念
计数1000个PCE中含微核的PCE数，并计算200个细胞中 PCE/NCE的比值。
10
6. 结果分析与评价
• 本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。 • PCE／NCE为评价细胞毒性的指标。 • 正常的PCE/NCE比值为1（0.6-1.2），
如果＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制； 如果＜0.05，则表示受试物剂量过大，结果不可靠。
8
3．固定：
将推好晾干的骨髓片放进染色缸中，甲醇固定15分钟， 取出晾干。
4．染色(建成试剂盒Giemsa染液)
小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞微核试验是一种用于检测物质对小鼠骨髓细胞基因毒性的方法。
骨髓细
胞微核是正常细胞中小核细胞数量的标志。
在受到某些化学物质的影响后，骨髓细胞可以
形成异常小鼠骨髓微核和形态不规则的细胞，这是指指出该物质可能是致癌物或基因毒物，因此，这种试验可以用于评估某种物质对人类健康的风险。
在小鼠骨髓微核试验中，通常将小鼠的骨髓细胞放置在培养基中进行培养，然后将待
检物质加入培养中。
待检物质可能是化学物质、辐射或生物质等。
随后，经过一定时间后，分离的细胞会被染色并进行显微镜检查，以确定细胞数量和微核的数量。
通过小鼠骨髓细胞微核试验得出的结果可以帮助研究人员判断待检物质是否是基因毒
物和可能是致癌物，是否影响细胞的正常生长和健康。
因此，小鼠骨髓细胞微核试验已成
为一种广泛使用的实验室技术，以评估物质的潜在致癌性和毒性。
总之，小鼠骨髓细胞微核试验是一种快速且有效的实验室技术，用于评估化学物质、
辐射等物质对人类健康的影响和风险。
虽然该方法需要一定的经验和技能，但它已被广泛
使用于实验室中，并成为确定制定公众卫生政策的重要工具之一。
骨髓细胞微核试验
骨髓细胞微核试验(保健食品)1.实验动物小鼠是微核试验的常规动物，也可选用大鼠。
通常用7周~12周龄，体重25g~30g的小鼠或体重150 g~200 g的大鼠。
每组用两种性别的动物至少各5只。
动物购买后适应环境至少3天。
2．剂量及分组受试物应设三个剂量组，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量，一般可取1/2LD50，低剂量组应不表现出毒性，分别取1/4LD50和1/8LD50作为中、低剂量。
急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）动物无死亡而求不出LD50时，高剂量组则按以下顺序：a) 10g/kg体重; b)人的可能摄入量的100倍;或c) 一次最大灌胃剂量进行设计，再下设中、低剂量组。
另设溶剂对照组和阳性对照组。
阳性对照物可用环磷酰胺40mg/kg体重经口或腹腔注射(首选经口)给予。
3．操作步骤3.1 受试物配制一般用蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素等配成乳化液或悬浊液。
受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液(或悬浊液、乳浊液等)保存具有稳定性。
3.2 实验动物的处理经口灌胃。
根据细胞周期和不同物质的作用特点，可先做预试，确定取材时间。
常用30h给受试物法。
即两次给受试物间隔24h，第二次给受试物后6h，颈椎脱臼处死动物。
3.3 标本制备取胸骨或股骨,用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀,常规涂片,或用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片,涂片自然干燥后甲醇固定5~10min。
当日固定后保存。
将固定好的涂片放入Gleams应用液中，染色10~15 min，立即用pH6.8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水冲洗、晾干。
写好标签，阴凉干燥处保存。
3.4 阅片选择细胞完整、分散均匀、着色适当的区域,在油镜下观察。
以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准。
本法系观察嗜多染红细胞的微核。
用Giemsa染色法，嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈粉红色。
实验四.小鼠骨髓细胞微核试验
院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠实验四：小鼠骨髓细胞微核试验1、实验目的通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞（PCE）的微核出现率，间接反映骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试动物是否具有致突变作用。
主要用于测试干扰细胞有丝分裂的物质。
2、实验原理微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。
红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出，但微核仍保留于PCE细胞中，因此可通过计数PCE细胞中的微核来判断受试物的致突变作用。
3、实验材料3.1实验动物7～12周龄健康小鼠，体重20~30g，10只，雌雄各半。
3.2试剂小牛血清（灭活）；甲醇；姬姆萨染色液：磷酸盐缓冲液（pH6.8）：丝裂霉素C。
3.3器材生物显微镜、恒温水浴箱、解剖剪、镊子、止血钳、注射器、灌胃针头、载玻片、玻璃染色缸、塑料吸瓶、吸管、乳钵、干净纱布、滤纸等。
4、操作步骤4.1试剂的配制4.1.1小牛血清（灭活）小牛血清滤菌后置于56℃恒温水浴保温30 min进行灭活。
4.1.2磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1/15mol/L磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠(Na2HPO4) 9.47 g溶于1000ml蒸馏水中;1/15mol/L磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾(KH2PO4) 9.07g溶于1000ml蒸馏水中;1/15mol/L磷酸氢二钠溶液50ml与1/15mol/L磷酸二氢钾溶液50ml混合即可。
4.1.3姬姆萨染色液将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至375 ml，待完全溶解后，再加入125ml甘油，混合均匀。
置37℃恒温箱中保温48h。
保温期间振摇数次，促使染料的充分溶解。
取出过滤，即为姬姆萨储备液，两周后可使用。
实验前取姬姆萨储备液与磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1 : 9混匀，即可。
4.2实验动物的处理步骤如下:（1）给药根据急性LD50，选用使动物出现中毒，但不引起动物死亡的剂量，受试小鼠腹腔注射丝裂霉素C1.5～2mg/kg（2）骨髓细胞液的制备在给与受试物6h后，小鼠脱颈椎处死，打开胸腔，沿着胸骨柄与肋骨交界处剪断，剥掉附着其上的肌肉，用滤纸擦干血污（3）PCE及微核的观察涂片在洁净的玻片一端滴小牛血清1滴，横向剪开胸骨，暴露骨髓腔，然后用止血钳挤出骨髓液至血清中，混匀，推片（长度约2～3cm），在空气中晾干（一般以两节胸骨髓液涂一张片子为宜）固定将干燥的涂片置甲醇液中固定5～10min，取出晾干染色固定好的涂片放入姬姆萨应用液中染色15～30min，蒸馏水冲洗，干燥镜检先在低倍镜下观察，选择分布均匀，染色较好的视野，然后换到油镜下观察计数。
兽药小鼠骨髓细胞微核试验指导原则
兽药小鼠骨髓细胞微核试验指导原则
一、概述
（一）定义与目的
微核试验是通过测量微核率来评价染色体损伤的一种细胞遗传学方法。微核 是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然滞留在 细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后，单独形成一 个或几个规则的次核，包含在细胞的胞质中，由于比核小得多故称微核。这种情 况的出现往往是受到染色体断裂剂作用的结果。另外，也可能在受到纺锤体毒物 的作用时，主核没有能够形成，代之以一组小核。此时小核往往比一般典型的微 核稍大。
骨髓细胞微核实验报告
骨髓细胞微核实验报告骨髓细胞微核实验是一项常用的毒理学检测方法，可以有效地评价某种物质对DNA损伤的影响，具有重要的毒性评价价值。
本文将对骨髓细胞微核实验进行详细的介绍和解读，为相关研究人员提供指导。
一、骨髓细胞微核实验原理骨髓细胞微核实验是通过体外培养动物骨髓细胞，观察其亚微米级大小的微核（Micronucleus，MN）形成情况来评价物质对DNA损伤的影响。
在骨髓细胞分裂时，如果染色体发生异常分离或断裂，就会产生一个或多个亚微米级的小核结构，称为微核。
微核中包含未被分离的染色体片段或全染色体，它们将被保留在新细胞核内，从而形成有两个或多个核的细胞。
形成微核的细胞与正常细胞相比，DNA的稳定性已经受到了不同程度的损伤。
因此，骨髓细胞微核实验通过检测细胞中微核的数量和形态，可以初步判断某种物质对DNA的损伤程度，进而评价其毒性。
二、骨髓细胞微核实验步骤1. 骨髓细胞培养：将动物骨髓细胞取出，利用适当的培养基进行体外培养。
通常可以采用罗氏61#或麦戈文液等培养基，具体选择应根据实验需要确定。
2. 处理检测物质：将待检测物质加入到骨髓细胞培养基中，通常需要设立不同的浓度梯度，以便观察物质对骨髓细胞DNA损伤的剂量效应。
3. 细胞收集：培养一定时间后，用适当的方法收集细胞，可选择离心法或离心浓缩法等，通常可在离心时加入适当的溶解剂溶解红细胞。
4. 细胞扩增：将收集到的细胞加入到分装好的培养皿中，加入细胞生长因子，推动细胞继续增殖。
5. 制片染色：取适当量的细胞悬液，制作染色片并染色。
一般情况下，常用的染色方法包括单盐酸染色、儿茶酚蓝染色和吉姆萨染色等。
6. 观察分析：观察所制的染色片，采用恒定镜观察和计数，并对微核数量和形态进行统计分析。
为了获得稳定可靠的数据，一个实验通常需要做多组重复测定。
三、常见问题解答1. 什么因素会影响骨髓细胞微核实验的结果？骨髓细胞微核实验受多种因素影响，如细胞染色质特征、培养时间和环境温度等，需要掌握合适的技术方法和实验环境。
实验17 小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞微核试验金一和大連理工大学環境与生命学院微核形成机理微核实验原理微核是染色体断裂或纺锤丝受损, 在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。
RBC在成熟之前最后一次细胞分裂后，主核排出细胞外，微核仍滞留在PCE细胞中。
因此，可以根据PCE细胞中微核出现率，观察环境污染物对染色体完整性和染色体分离改变的影响，判定其有无遗传毒性。
实验目的1.掌握小鼠骨髓细胞微核试验方法2.掌握骨髓多染红细胞（PCE）中微核的观察方法实验器材1.手术刀2.手术剪3.无齿镊4.小型弯止血钳5.干净纱布6.带橡皮头吸管7.台式离心机8.刻度离心管9.电吹风机10.玻璃蜡笔11.2ml注射器及针头12.载玻片及推片13.定时钟14.带油镜头显微镜15.细胞计数器16.玻璃染色缸17.晾片架主要试剂甲醇（分析纯）生理盐水小牛血清pH6.8的磷酸盐缓冲液分别取1/15 mol/L的磷酸二氢钾溶液50.40ml和1/15 mol/L的磷酸氢二钠溶液49.60ml，两者混合均匀。
阳性对照物环磷酰胺或丝裂霉素C实验操作步骤•染毒次数连续 4 次染毒取样时间最后一次染毒后，经过24h，取骨髓制作骨髓涂片骨髓涂片的固定、染色和封片微核观察和细胞计数骨髓细胞染色方法取胸骨剪去骨骺端擦净血污，剔去肌肉小牛血清Giemsa 应用液10~15min 甲醇中，固定15min 混匀、推片冲洗、晾干晾干冲洗、晾干细胞计数嗜多染红细胞和微核微核率计算方法结果分析与评价阳性判断实验组中至少一个剂量组微核阳性率显著大于对照组，并具有重现性和剂量-反应关系。
阴性结果试验剂量不够、采样时间不合适、细胞计数量不足、实验动物自发微核率高等原因，均可以造成实验结果阴性。
当实验设计符合标准，试验剂量足够大，其他染毒方式的微核试验结果仍为阴性时，可认为受试物微核试验阴性。
注意事项1. 实验所用的器具必须洁净，小牛血清无污染。
2. 骨髓涂片上，细胞疏密程度要合适，细胞之间互不重叠。
小鼠骨髓细胞微核试验讲解学习
五、操作步骤
染色 涂片充分晾干后 染色：1. 平置涂片于染色架上，滴加试剂一5滴，
迅速均匀盖满涂片，染色1.5 min 2. 不要丢弃试剂一，直接滴加试剂二10滴， 轻轻均匀摇晃涂片使染液均匀覆盖涂片，染色8 min 3. 水洗涂片30s, 待干后镜检
五、操作步骤
观察 显微镜的使用 低倍镜：细胞群 高倍镜：分布均匀、染色良好 油镜：细胞形态、微核
五、操作步骤
本次实验染毒处理： 环磷酰胺
剂量：0.8mg/10g 每次染毒(腹腔注射） 次数：多次染毒法（4次）----最佳浓度及作用时间
五、操作步骤
骨髓液制备 ↓
涂片 ↓
染色 ↓
观察与计数
五、操作步骤
骨髓液制备及涂片 猝死：颈椎脱臼、麻醉 取组织：胸骨、股骨 获取骨髓液：在胎牛血清中迅速制取骨髓液 涂片：均匀
检测能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤 体联结损伤的化学物（DNA断裂剂和非整倍 体诱变剂）。
辐射损伤、化学诱变剂、新药试验、染色体遗 传疾病及癌症前期诊断等各方面。
四、器材及试剂
器材：手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱 布、带橡皮头吸管、晾片架、玻璃蜡笔、玻璃染 色缸、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜、 细胞计数器
二、实验原理
微核成因 染色体或染色单体的无着丝点断片 纺锤丝受损而丢失的整个染色体
细胞分裂后期遗留在胞质中，单独形成规则的次核
植物细胞微核实验（蚕豆根尖） 淋巴细胞微核实验 双核微核实验 小鼠骨髓微核实验
嗜多染红细胞（PCE）
嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞，由幼年发 展为成熟红细胞的一个阶段
到严重抑制，实验结果不可靠
2. 微核率：含有微核的嗜多染红细胞数，以千分率（‰）表 示
厦门大学-实验五.小鼠骨髓细胞微核试验(讲义)
1小鼠骨髓细胞微核试验(Bone marrow cell micronucleus test)⏹指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，大小相当于细胞直径的1/20~1/5，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。
2微核(micronucleus ，MN)细胞核微核⏹细胞有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片/环，也可以是纺锤体受损而丢失的整个染色体。
⏹它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微核。
⏹一般认为微核是细胞受到染色体断裂剂或纺锤体毒物作用的结果。
3微核(micronucleus ，MN)小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验⏹嗜多染红细胞(polychromatic erythrocyte ，PCE)细胞质内仍含有核糖体的未成熟红细胞。
4⏹正染红细胞(normochromatic erythrocyte ，NCE)核糖体已消失的成熟红细胞。
为何选择PCE (polychromatic erythrocytes)⏹PCE ：指在红细胞成熟之前，最后一次分离后数小时将主核排出的细胞，而微核仍保留在细胞质中。
⏹微核可以出现在多种细胞，但在有核细胞中难与正常核的分叶及核突出物区别。
5为何选择PCE ？⏹PCE ：Giemsa 染色呈灰蓝色(胞质内含核糖体)⏹NCE(正染红细胞/成熟红细胞，normochromatic erythrocyte ，NCE))：淡桔红色⏹骨髓中PCE 数量充足，微核容易辨认，且微核自发率低，因此，成为微核试验的首选细胞群。
6一.实验目的和意义⏹1.了解小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验的实验原理及毒理学意义。
⏹2. 掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核测定方法。
7二.实验原理⏹微核试验检测外源化学物诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
小鼠骨髓细胞微核试验
四、
操作步骤
1． 动物一般选用 7~12 周的、体重 20~30g 的小鼠，也可选用体重 150~200g 的大鼠。 每个剂量组至少用两种性别的动物各 5 只。 若需多次采样， 则每组的动物数需增加， 每个采样时间至少有 8 性质 （尤其是溶解度、 水溶性或脂溶性） ， 确定溶剂。 一般采用水或食用植物油，不容者可用淀粉制成混悬液。 一般在受试物的 1/2~1/30LD50 范围内选择 3~4 个剂量组。 也可采用急性毒性试验中出现中毒 而不致死的剂量作为染毒最高剂量组，以畜禽的可能摄入量作为最低剂量组，中间插入 1~2 个剂量组。同时设对照组，即空白对照、溶剂对照和阳性对照。阳性对照组用环磷酰胺生理 盐水溶液一次腹腔注射 30~50mg/kg，或以环磷酰胺水溶液 80~120mg/kg，经口染毒两次， 间隔 24h。 3．染毒途径根据受试物的性质及畜禽接触方式不同，可分别选用灌胃、腹腔注射、皮 下或肌肉注射等染毒途径。 4．染毒方法一般采用 2 次染毒方法，两次间隔 24h。 5．制片 （1）骨髓细胞液的制备在第二次给予受试物 6h 后，小鼠脱颈椎处死。取下小鼠两侧股 骨，剔去肌肉，用滤纸或纱布擦去血污和肌肉，减去股骨两端。用配有 6 号针头 1ml 注射器 吸取小牛血清约 0.05ml 冲洗骨髓腔数次，将冲洗物滴在载玻片上。 （2） 涂片将玻片上的冲洗物调匀后， 推片若干张。 迅速干燥， 可在酒精灯上短时烘烤。 （3）固定将干燥的涂片置甲醇液中固定 5~10min，取出晾干。当日不染色的涂片亦应 固定后保存。 （4）染色固定好的涂片用 1:10 的吉姆萨-磷酸缓冲液（pH6.4）染色 15~30min。用蒸馏 水冲洗，干燥，待检。 为了便于诊断，可选用吖啶橙染色法。固定好的涂片放入 0.24mmol/L 吖啶橙磷酸缓冲 液内，染色 2~3min。用 Ph6.8 磷酸缓冲液冲洗 3 次，每次 1~2min。晾干后在荧光显微镜下 观察，如微核带红色荧光，可再冲洗数分钟，直至发黄绿色荧光。在染色、干燥过程中均应 避光，以防荧光减弱或消失。 （5）封片染色干燥后的涂片，若需长时间保存，可放入二甲苯透明 6min，取出后趁湿 滴上适量中性树脂胶， 盖上盖玻片， 平置。 待干后却可收入盒内备检。 若在短时内进行观察， 涂片不需制成涂片。 （6）镜检先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞完整、分布均匀和染色良好的区域，再 以油镜检查计数。 可用细胞形态是否完好， 作为判断制片优劣的标准。 嗜多染红细胞 （PCE） 呈灰蓝色，成熟的正染红细胞（NCE）呈粉红色。 每只动物需计数 1000 个嗜多染红细胞， 并计算含微核的嗜多染红细胞数， 列入表实 6-1。 在一个嗜多染红细胞中出现两个或多个微核，仍按一个为细胞计算。微核率按下式计算，并 以千分率表示。 微核率列入表实 6-2。 另外， 在计数 PCE 时， 计数见到的 NCE 数， 求出 PCE/NCE 的比值。 嗜多染红细胞微核率=有微核的嗜多染红细胞总数/检查嗜多染红细胞数× 100% 表示 6-1 出现微核的嗜多染红细胞数统计 性别 空白对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 阳性对照组
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
骨髓细胞微核试验(保健食品)
1.实验动物
小鼠是微核试验的常规动物，也可选用大鼠。
通常用7周~12周龄，体重25g~30g的小鼠或体重150 g~200 g的大鼠。
每组用两种性别的动物至少各5只。
动物购买后适应环境至少3天。
2．剂量及分组
受试物应设三个剂量组，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量，一般可取1/2LD50，低剂量组应不表现出毒性，分别取1/4LD50和1/8LD50
作为中、低剂量。
急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）动物无死亡而求不出LD50时，高剂量组则按以下顺序：a) 10g/kg体重; b)人的可能摄入量的100倍;或c) 一次最大灌胃剂量进行设计，再下设中、低剂量组。
另设溶剂对照组和阳性对照组。
阳性对照物可用环磷酰胺40mg/kg体重经口或腹腔注射(首选经口)给予。
3．操作步骤
3.1 受试物配制
一般用蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素等配成乳化液或悬浊液。
受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液(或悬浊液、乳浊液等)保存具有稳定性。
3.2 实验动物的处理
经口灌胃。
根据细胞周期和不同物质的作用特点，可先做预试，确定取材时间。
常用30h给受试物法。
即两次给受试物间隔24h，第二次给受试物后6h，颈椎脱臼处死动物。
3.3 标本制备
取胸骨或股骨,用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀,常规涂片,或用小牛血
清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片,涂片自然干燥后甲醇固定5~10min。
当日固定后保存。
将固定好的涂片放入Gleams应用液中，染色10~15 min，立即用pH6.8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水冲洗、晾干。
写好标签，阴凉干燥处保存。
3.4 阅片
选择细胞完整、分散均匀、着色适当的区域,在油镜下观察。
以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准。
本法系观察嗜多染红细胞的微核。
用Giemsa染色法，嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈粉红色。
典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致,呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的1/20~1/5。
用双盲法阅片。
每只动物计数1000个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率以千分率表示。
观察嗜多染红细胞与成熟红细胞(PCE/RBC)比值，可作为细胞毒性指标之一。
一般计数200个嗜多染红细胞。
受试物组未成熟红细胞占红细胞总数的比例不应少于对照组的20%。
4. 数据处理
一般采用卡方检验、泊松分布或双侧t检验等统计方法进行数据处理，并按动物性别分别统计。
5. 结果判定
试验组与对照组相比，试验结果微核率有明显的剂量反应关系并有统计学意义时，即可确认为阳性结果。
若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验。
结
果能重复者可确定为阳性。
一般阴性对照组的微核率<5‰，供参考。
但应有本试验室所用实验动物的自发微核率作参考。