实验五 小鼠骨髓细胞微核试验
实验五小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞的采集与处理
小鼠麻醉
将小鼠麻醉，并固定在 操作台上。
暴露骨髓
用消毒手术刀切开小鼠 的腿骨，暴露骨髓腔。
采集骨髓细胞
用注射器吸取生理盐水， 冲洗骨髓腔，收集骨髓
细胞。
细胞处理
将采集的骨髓细胞进行 洗涤、离心、分离等处 理，得到所需的细胞样
本。
骨髓细胞的培养与观察
细胞培养
将处理后的骨髓细胞接种在细胞 培养皿中，加入适量的细胞培养 基，在适宜的温度和湿度条件下 进行培养。
率之间存在正相关关系。
本实验为进一步研究致突变物的 致突变作用提供了有力证据，有 助于深入了解致突变物的致癌机
制。
对实验结果的理解与讨论
本实验结果表明，致突变物能够诱导小 鼠骨髓细胞微核的形成，这可能是致突 变物导致基因突变和细胞恶性转化的重 要机制之一。
实验结果还提示，致突变物的致突变作用可 能与其在体内的代谢活化有关，因此需要进 一步研究致突变物的代谢活化过程及其与微 核形成之间的关系。
实验五小鼠骨髓细胞 微核试验
目录
CONTENTS
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果分析 • 结论与讨论
01 实验目的
了解微核试验的原理
微核试验是一种用于检测染色体畸变和DNA损伤的细胞遗传 学方法。它通过观察细胞中微核（微小的细胞核）的数量， 来评估细胞受到的遗传损伤程度。
染色体结构畸变
分析实验组和对照组的染色体结构畸变类型，如断裂、倒位、重 复等。
染色体数目畸变
观察染色体数目畸变情况，包括非整倍体、多倍体等。
畸变类型与实验条件关系
探讨不同实验条件下染色体畸变类型的差异及其与实验条件的关系。
实验结果与预期结果的比较
小鼠骨髓细胞微核试验
注意事项
Giemsa染液pH6.8是细胞染色质量的重要 保证； 推制良好的骨髓涂片是本试验的关键步骤； 正确区分PCE细胞、NCE细胞及白细胞； 正确区分微核与染料颗粒。
材料
试剂：甲醇、冰乙酸、吉姆萨（Giemsa） 染液、小牛血清、磷酸盐缓冲液pH6.8， 环磷酰胺。 器材：晾片架、1ml注射器及针头、载波 1ml 片及推片、显微镜（具油镜头），细胞计 数器。 动物：小鼠，体重24-28g，雄鼠。
试验方法
1、给药：将小鼠称重随机分成二组，一 组为生理盐水组（腹腔注射0.2ml/10g.W)， 一组为环磷酰胺组（腹腔注射 1mg/10g.W)。 2、涂片：给药24h后用颈椎脱臼处死小鼠， 取出股骨，用滤纸擦净，纵形剪去1/4-1/3， 用针头挑出骨髓，放在已滴好一小滴小牛 血清的载波片上（血清宜滴在载玻片的一 端），用眼科镊头将骨髓团充分分散，推 片，在空气中晾干。
小鼠骨髓细胞微核试验 Micronucleus Test for Bone Marrow Cell in Mouse
西南大学药学院
目的
学习小鼠骨髓多染红细胞（ PCE）微核测 定方法，了解环磷酰胺对骨髓细胞染色体 的损伤作用
原理
微核是指细胞中主核之外的颗粒，染色与细胞核 一致，相当于细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或杏 仁状。微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响 而在细胞有丝分裂时滞留在细胞核外的遗传物质， 因而微核试验能检测药物或其它物质诱导产生的 染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传 学终点。 微核试验可用多种细胞，但在有核细胞中难于与 正常核的分叶及核突出物区分，故常计数PCE中 的微核，因为红细胞在成熟之前最后一次分离后 数小时将主核排出而微核被保留下来。
骨髓细胞微核试验
骨髓细胞微核试验(保健食品)1.实验动物小鼠是微核试验的常规动物，也可选用大鼠。
通常用7周~12周龄，体重25g~30g的小鼠或体重150 g~200 g的大鼠。
每组用两种性别的动物至少各5只。
动物购买后适应环境至少3天。
2．剂量及分组受试物应设三个剂量组，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量，一般可取1/2LD50，低剂量组应不表现出毒性，分别取1/4LD50和1/8LD50作为中、低剂量。
急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）动物无死亡而求不出LD50时，高剂量组则按以下顺序：a) 10g/kg体重; b)人的可能摄入量的100倍;或c) 一次最大灌胃剂量进行设计，再下设中、低剂量组。
另设溶剂对照组和阳性对照组。
阳性对照物可用环磷酰胺40mg/kg体重经口或腹腔注射(首选经口)给予。
3．操作步骤3.1 受试物配制一般用蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素等配成乳化液或悬浊液。
受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液(或悬浊液、乳浊液等)保存具有稳定性。
3.2 实验动物的处理经口灌胃。
根据细胞周期和不同物质的作用特点，可先做预试，确定取材时间。
常用30h给受试物法。
即两次给受试物间隔24h，第二次给受试物后6h，颈椎脱臼处死动物。
3.3 标本制备取胸骨或股骨,用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀,常规涂片,或用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片,涂片自然干燥后甲醇固定5~10min。
当日固定后保存。
将固定好的涂片放入Gleams应用液中，染色10~15 min，立即用pH6.8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水冲洗、晾干。
写好标签，阴凉干燥处保存。
3.4 阅片选择细胞完整、分散均匀、着色适当的区域,在油镜下观察。
以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准。
本法系观察嗜多染红细胞的微核。
用Giemsa染色法，嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈粉红色。
小鼠骨髓细胞微核试验
动物骨髓细胞染色体畸变分析
目的和意义:
1、学习动物骨髓细胞染色体标本的制作 2、了解动物体内染毒及染色体畸变类型
染色体畸变：
指染色体的结构改变，它是指遗传物质大的 改变，一般可用光学显微镜检查适当细胞 有丝分裂中期的染色体来发现
染色体畸变分析： 指观察染色体形态结构和数目改变，又称为 细胞遗传学实验
注意事项： 1、剪胸骨时通过剪断两边的肋骨来把整块 胸骨取下来，以防不小心把胸骨剪断 2、挤出骨髓处的肌肉要剔除干净 3、滴到玻片上的小牛血清不要太多，涂时 要涂匀，以便推片 4、染色前可以先看一下整体涂片情况，细 胞分散度是否良好 5、关键步骤是制作良好的骨髓涂片以及优 良的染色
流程图
处死小鼠，取胸骨
图 1：正常精母细胞（× 1000 ） 图 2 ：精母细胞染色体环（× 1000 图 3 ：精母细胞链状四价体（× 1000 ） 图 4 ：精母细胞染色体数目减少（× 1000 ）
注意事项：
低渗是本实验的关键，控制好低渗时 间，做出分散良好的染色体标本，关系到 实验结果的准确性
流程图
处死小鼠，取股骨 取骨髓，离心
结果分析与评价
结果： 以每只动物为观察单位，每只动物观察100个中 期分裂相，计算其畸变细胞率 分析与评价： 1 阴性和阳性对照组的畸变率应与所用动物 的种属及有关资料相符 2 试验结果可以用多种统计方法处理，所得 结果应该是相同的 3 各实验组即便细胞率与阴性对照组相比较， 应该有显著性差异，还应有剂量反应关系
注：在主核排除时，微核仍保留在细胞中
操作步骤：
一 染毒：
染毒途径：腹腔注射环磷酰胺，染毒二次， 0、24小时各染毒一次，6h后取样 染毒剂量：50mg/kg
[整理版]小鼠骨髓多染红细胞微核试验
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小鼠骨髓多染红细胞微核实验目的和意义微核试验用于检测受试物在哺乳动物所引起的染色体或原红细胞有丝分裂器损伤，以确定该受试物有无诱变性。
通过本次实验学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞微核测定方法。
原理正常细胞的有丝分裂的分裂中期，染色体均匀地排列在赤道板附近，到分裂后期便分成两份，分别向两极移动，并在末期分别形成两个子细胞的核。
如果由于某种化学物质的作用而使分裂期的细胞染色体受到损伤，在中期就会观察到染色体断裂，在进入分裂后期时，这种断片落后于向两极移动的染色体而滞留在赤道板附近，当其它染色体分别形成子细胞核时，这些落后的断片便独立形成微核，如果纺锤体功能受损，也可产生微核。
由上可见，微核的出现和染色体畸变有密切相关性，同时微核的观察是在细胞的间期，不必分析中期相，这比分析染色体畸变要方便一些。
进行骨髓细胞微核分析一般观察红细胞，记数嗜多染红细脑中微核出现率。
器材与试剂1、器材载玻片、推片、血细胞计数器、滴管、注射器、解剖剪、镊子、止血钳、晾片架、滤纸、电吹风机、染色缸、研钵、恒温水浴箱、光学生物显微镜（或荧光显微镜）。
2、试剂小牛血清；甲醇；吉姆萨储备液：将1g 吉姆萨倒入研钵内，加入少许甘油混合研细，分次倒入剩余的甘油至66ml，转移到烧杯内（或试剂瓶内）。
放入55~60℃水浴中并不断搅动至2h。
取出冷却后加入60ml甲醇，混匀后置室温，2~3周后过滤，保存于棕色瓶内备用（存放时间越长染色效果越好）。
吉姆萨染色液：实验前取吉姆萨储备液与磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1 : 9混匀。
磷酸盐缓冲液（pH 6.8）阳性对照物：环磷酰胺。
操作步骤一、试验动物及处理1、动物的选择：选用小鼠，每组10只动物，雌雄各半。
小鼠体重在18~20g，7~12w。
2、染毒途径：采用腹腔注射给药。
3、剂量选择：环磷酰胺按50mg/kg剂量染毒，同时设立阴性对照（空白对照）。
4、染毒次数和取样时间：采用30h给药法，即两次给药间隔24h，在第二次给药后6h处死动物采集骨髓。
小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞微核试验是一种用于检测物质对小鼠骨髓细胞基因毒性的方法。
骨髓细
胞微核是正常细胞中小核细胞数量的标志。
在受到某些化学物质的影响后，骨髓细胞可以
形成异常小鼠骨髓微核和形态不规则的细胞，这是指指出该物质可能是致癌物或基因毒物，因此，这种试验可以用于评估某种物质对人类健康的风险。
在小鼠骨髓微核试验中，通常将小鼠的骨髓细胞放置在培养基中进行培养，然后将待
检物质加入培养中。
待检物质可能是化学物质、辐射或生物质等。
随后，经过一定时间后，分离的细胞会被染色并进行显微镜检查，以确定细胞数量和微核的数量。
通过小鼠骨髓细胞微核试验得出的结果可以帮助研究人员判断待检物质是否是基因毒
物和可能是致癌物，是否影响细胞的正常生长和健康。
因此，小鼠骨髓细胞微核试验已成
为一种广泛使用的实验室技术，以评估物质的潜在致癌性和毒性。
总之，小鼠骨髓细胞微核试验是一种快速且有效的实验室技术，用于评估化学物质、
辐射等物质对人类健康的影响和风险。
虽然该方法需要一定的经验和技能，但它已被广泛
使用于实验室中，并成为确定制定公众卫生政策的重要工具之一。
小鼠骨髓细胞微核试验.
五、作业
1. 观察并记数细胞微核率； 2. 用统计学软件SPSS统计结果。Biblioteka 三、实验材料小鼠骨髓
四、实验步骤
1. 实验前6小时用对苯二酚80mg/kg注射于小鼠腹腔内， 处死动物，用0.85%的生理盐水吹出股骨骨髓，离心1000 转/分5分钟，除上清液，滴入少量小牛血清混匀后涂片。 2. 固定：放入甲醇和冰醋酸固定液中固定5-10分钟； 3. 染色：直接在Gimsa染液中染色10分钟，然后冲洗； 用滤纸擦干载片背面的水分，再用滤纸轻轻吸干载片上面 的水分，取出盖上盖片； 4. 观察：嗜多染红细胞呈灰兰色，成熟红细胞呈桔红色， 每只动物计数1000-2000个嗜多染红细胞，微核率为千分 之2.58+0.41。
小鼠骨髓细胞微核试验
一、实验目的
1． 观察诱变物质产生的微核； 2． 了解微核测定的方法与意义，计算微核 率。
二、实验原理
微核（Micronuclei）是真核类生物细胞中的一种异常结构， 往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。在细胞间 期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主 核1/3 以下。 已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈 正相关，这一点和染色体畸变一样。所以，可用间期的微 核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。 目前国内外不少部门已经把微核测试用于辐射损伤，辐射 防护，化学诱变剂，新药实验，染色体遗传疾病及癌症前 期诊断等各方面。
骨髓细胞微核试验
骨髓细胞微核试验(保健食品)1.实验动物小鼠是微核试验的常规动物，也可选用大鼠。
通常用7周~12周龄，体重25g~30g的小鼠或体重150 g~200 g的大鼠。
每组用两种性别的动物至少各5只。
动物购买后适应环境至少3天。
2．剂量及分组受试物应设三个剂量组，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量，一般可取1/2LD50，低剂量组应不表现出毒性，分别取1/4LD50和1/8LD50作为中、低剂量。
急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）动物无死亡而求不出LD50时，高剂量组则按以下顺序：a) 10g/kg体重; b)人的可能摄入量的100倍;或c) 一次最大灌胃剂量进行设计，再下设中、低剂量组。
另设溶剂对照组和阳性对照组。
阳性对照物可用环磷酰胺40mg/kg体重经口或腹腔注射(首选经口)给予。
3．操作步骤3.1 受试物配制一般用蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素等配成乳化液或悬浊液。
受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液(或悬浊液、乳浊液等)保存具有稳定性。
3.2 实验动物的处理经口灌胃。
根据细胞周期和不同物质的作用特点，可先做预试，确定取材时间。
常用30h给受试物法。
即两次给受试物间隔24h，第二次给受试物后6h，颈椎脱臼处死动物。
3.3 标本制备取胸骨或股骨,用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀,常规涂片,或用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片,涂片自然干燥后甲醇固定5~10min。
当日固定后保存。
将固定好的涂片放入Gleams应用液中，染色10~15 min，立即用pH6.8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水冲洗、晾干。
写好标签，阴凉干燥处保存。
3.4 阅片选择细胞完整、分散均匀、着色适当的区域,在油镜下观察。
以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准。
本法系观察嗜多染红细胞的微核。
用Giemsa染色法，嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈粉红色。
实验四.小鼠骨髓细胞微核试验
院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠实验四：小鼠骨髓细胞微核试验1、实验目的通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞（PCE）的微核出现率，间接反映骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试动物是否具有致突变作用。
主要用于测试干扰细胞有丝分裂的物质。
2、实验原理微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。
红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出，但微核仍保留于PCE细胞中，因此可通过计数PCE细胞中的微核来判断受试物的致突变作用。
3、实验材料3.1实验动物7～12周龄健康小鼠，体重20~30g，10只，雌雄各半。
3.2试剂小牛血清（灭活）；甲醇；姬姆萨染色液：磷酸盐缓冲液（pH6.8）：丝裂霉素C。
3.3器材生物显微镜、恒温水浴箱、解剖剪、镊子、止血钳、注射器、灌胃针头、载玻片、玻璃染色缸、塑料吸瓶、吸管、乳钵、干净纱布、滤纸等。
4、操作步骤4.1试剂的配制4.1.1小牛血清（灭活）小牛血清滤菌后置于56℃恒温水浴保温30 min进行灭活。
4.1.2磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1/15mol/L磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠(Na2HPO4) 9.47 g溶于1000ml蒸馏水中;1/15mol/L磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾(KH2PO4) 9.07g溶于1000ml蒸馏水中;1/15mol/L磷酸氢二钠溶液50ml与1/15mol/L磷酸二氢钾溶液50ml混合即可。
4.1.3姬姆萨染色液将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至375 ml，待完全溶解后，再加入125ml甘油，混合均匀。
置37℃恒温箱中保温48h。
保温期间振摇数次，促使染料的充分溶解。
取出过滤，即为姬姆萨储备液，两周后可使用。
实验前取姬姆萨储备液与磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1 : 9混匀，即可。
4.2实验动物的处理步骤如下:（1）给药根据急性LD50，选用使动物出现中毒，但不引起动物死亡的剂量，受试小鼠腹腔注射丝裂霉素C1.5～2mg/kg（2）骨髓细胞液的制备在给与受试物6h后，小鼠脱颈椎处死，打开胸腔，沿着胸骨柄与肋骨交界处剪断，剥掉附着其上的肌肉，用滤纸擦干血污（3）PCE及微核的观察涂片在洁净的玻片一端滴小牛血清1滴，横向剪开胸骨，暴露骨髓腔，然后用止血钳挤出骨髓液至血清中，混匀，推片（长度约2～3cm），在空气中晾干（一般以两节胸骨髓液涂一张片子为宜）固定将干燥的涂片置甲醇液中固定5～10min，取出晾干染色固定好的涂片放入姬姆萨应用液中染色15～30min，蒸馏水冲洗，干燥镜检先在低倍镜下观察，选择分布均匀，染色较好的视野，然后换到油镜下观察计数。
兽药小鼠骨髓细胞微核试验指导原则
兽药小鼠骨髓细胞微核试验指导原则
一、概述
（一）定义与目的
微核试验是通过测量微核率来评价染色体损伤的一种细胞遗传学方法。微核 是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然滞留在 细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后，单独形成一 个或几个规则的次核，包含在细胞的胞质中，由于比核小得多故称微核。这种情 况的出现往往是受到染色体断裂剂作用的结果。另外，也可能在受到纺锤体毒物 的作用时，主核没有能够形成，代之以一组小核。此时小核往往比一般典型的微 核稍大。
小鼠骨髓中嗜多染红细胞（PCE）微核实验简介
小鼠骨髓中嗜多染红细胞（PCE）微核实验简介小鼠骨髓中嗜多染红细胞（PCE）微核实验简介微核（micronucleus），与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质中，比主核小，故称微核。
故微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
实验目的1.学习和掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核测定方法2.了解细胞染色体损伤情况，掌握检测断裂剂和部分非整倍体致突变剂的测定方法3.进一步熟练制片和镜检操作器材与试剂1.器材手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、载玻片、玻璃染色缸、定时钟、晾片架、显微镜（带油镜）、注射器及针头、干净纱布、乳头吸管、玻璃铅笔、电吹风机2.试剂甲醇、Giemsa储备液、磷酸盐缓冲液（PH6.8）环磷酰胺操作步骤1.试验动物及处理（1）动物选择：一般选用大小鼠，小鼠最常用，18-20g，每组10只，雌雄各半。
（2）染毒途径：根据研究目的或受试物性质不同，原则上可尽量采用人类接触受试物的途径：通常采用灌胃法和腹腔注射。
（3）染毒次数：多次染毒法（每天染毒一次，连续4天，第五天取样）或两次染毒法（处死前30h+处死前6h）（4）剂量及对照选择据受试物的LD50，以1/2LD50为最高剂量组，下设3-4个剂量组。
同时设立阳性（环磷酰胺）和阴性对照（溶剂组）2.骨髓细胞制片和涂片：最后一次染毒后，在确定时间脱颈椎处死动物，迅速剪取其胸骨，剔去肌肉，用干净纱布擦拭，剪去每节骨骺端，用小型弯止血钳挤出骨髓液，点在载玻片一端预先滴好的一滴小牛血清中。
混匀后推片。
长度为2-3cm。
3.固定：将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇固定15min,取出晾干。
4.染色：Giemsa应用液染色15min.冲洗染色液，晾干。
5.观察计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分布均匀、疏密适度、形态完整、染色良好的区域，再在油镜下按一定顺序进行PCE和微核计数。
小鼠骨髓微核实验骨髓细胞悬液制备的基本实验流程
小鼠骨髓微核实验骨髓细胞悬液制备的基本实验流程1.测试动物和治疗（1）动物的选择：常用的实验动物是大型和小鼠。
小鼠是使用最广泛的，需要18至20克体重和7至12周龄的体重。
每组中的小鼠数量为10只，雌雄各占一半。
（2）中毒途径：根据研究目的或所测试化学毒物的性质，可选择口服，经皮，呼吸和注射途径。
但原则上，应采用与人接触化学毒物相同的方式。
（3）中毒频率和采样时间：研究已经证实，化学毒物需要在目标器官中积累到一定浓度才能产生诱变作用。
不同化学毒物诱导的微核的峰值时间也不同。
波动范围可达24?72h。
这就要求在接触化学毒物后建立不同的采样时间点。
考虑到上述两个原因，建议使用多种曝光方法。
其中，四次曝光更方便合理。
也就是说，每天一次，连续4天，第5天采样。
这样，样品可以覆盖24?72h 的峰，并且如果峰延迟至96h，则不会错过。
（4）剂量选择：被测化学毒物的最大剂量应为最大耐受量，但溶解度极限除外。
如果是叶子，应设定3至5个或更多剂量组。
剂量范围应正确且连续。
腹腔注射环磷酰胺（50?100mg / kg）或丝裂霉素C（10mg / kg）一次即可。
或2次。
静脉注射使用等体积的溶剂。
2.骨髓液的制备和涂片在最后一次暴露测试动物后，在确定的时间通过颈脱位或麻醉处死它们。
将四肢固定在解剖板上，用头发浸透腹部的中线，切开胸腹部，除去胸骨，并清洗血液。
，去除肌肉，切断骨the，使用小的弯曲止血钳在干净的玻璃载玻片上挤入骨髓，并滴加小牛血清，混合均匀，然后推动载玻片。
或者，在处死动物后，用手术剪刀除去股骨，除去肌肉，用生理盐水洗净血液和碎肉，切掉分离的骨physi，并使用带针的2ml注射器吸小牛血清。
插入骨髓腔，将颗粒冲洗到离心管中，然后使用移液管吹动微观肿块以校正均匀性。
以1000r / min的速度离心10分钟，弃去多余的上清液，并与沉淀物混合约0.5ml。
用滴管吸出并将一滴滴在干净的玻璃载玻片上，然后推动载玻片。
厦门大学-实验五.小鼠骨髓细胞微核试验(讲义)
1小鼠骨髓细胞微核试验(Bone marrow cell micronucleus test)⏹指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，大小相当于细胞直径的1/20~1/5，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。
2微核(micronucleus ，MN)细胞核微核⏹细胞有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片/环，也可以是纺锤体受损而丢失的整个染色体。
⏹它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微核。
⏹一般认为微核是细胞受到染色体断裂剂或纺锤体毒物作用的结果。
3微核(micronucleus ，MN)小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验⏹嗜多染红细胞(polychromatic erythrocyte ，PCE)细胞质内仍含有核糖体的未成熟红细胞。
4⏹正染红细胞(normochromatic erythrocyte ，NCE)核糖体已消失的成熟红细胞。
为何选择PCE (polychromatic erythrocytes)⏹PCE ：指在红细胞成熟之前，最后一次分离后数小时将主核排出的细胞，而微核仍保留在细胞质中。
⏹微核可以出现在多种细胞，但在有核细胞中难与正常核的分叶及核突出物区别。
5为何选择PCE ？⏹PCE ：Giemsa 染色呈灰蓝色(胞质内含核糖体)⏹NCE(正染红细胞/成熟红细胞，normochromatic erythrocyte ，NCE))：淡桔红色⏹骨髓中PCE 数量充足，微核容易辨认，且微核自发率低，因此，成为微核试验的首选细胞群。
6一.实验目的和意义⏹1.了解小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验的实验原理及毒理学意义。
⏹2. 掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核测定方法。
7二.实验原理⏹微核试验检测外源化学物诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
小鼠骨髓细胞微核试验
四、
操作步骤
1． 动物一般选用 7~12 周的、体重 20~30g 的小鼠，也可选用体重 150~200g 的大鼠。 每个剂量组至少用两种性别的动物各 5 只。 若需多次采样， 则每组的动物数需增加， 每个采样时间至少有 8 性质 （尤其是溶解度、 水溶性或脂溶性） ， 确定溶剂。 一般采用水或食用植物油，不容者可用淀粉制成混悬液。 一般在受试物的 1/2~1/30LD50 范围内选择 3~4 个剂量组。 也可采用急性毒性试验中出现中毒 而不致死的剂量作为染毒最高剂量组，以畜禽的可能摄入量作为最低剂量组，中间插入 1~2 个剂量组。同时设对照组，即空白对照、溶剂对照和阳性对照。阳性对照组用环磷酰胺生理 盐水溶液一次腹腔注射 30~50mg/kg，或以环磷酰胺水溶液 80~120mg/kg，经口染毒两次， 间隔 24h。 3．染毒途径根据受试物的性质及畜禽接触方式不同，可分别选用灌胃、腹腔注射、皮 下或肌肉注射等染毒途径。 4．染毒方法一般采用 2 次染毒方法，两次间隔 24h。 5．制片 （1）骨髓细胞液的制备在第二次给予受试物 6h 后，小鼠脱颈椎处死。取下小鼠两侧股 骨，剔去肌肉，用滤纸或纱布擦去血污和肌肉，减去股骨两端。用配有 6 号针头 1ml 注射器 吸取小牛血清约 0.05ml 冲洗骨髓腔数次，将冲洗物滴在载玻片上。 （2） 涂片将玻片上的冲洗物调匀后， 推片若干张。 迅速干燥， 可在酒精灯上短时烘烤。 （3）固定将干燥的涂片置甲醇液中固定 5~10min，取出晾干。当日不染色的涂片亦应 固定后保存。 （4）染色固定好的涂片用 1:10 的吉姆萨-磷酸缓冲液（pH6.4）染色 15~30min。用蒸馏 水冲洗，干燥，待检。 为了便于诊断，可选用吖啶橙染色法。固定好的涂片放入 0.24mmol/L 吖啶橙磷酸缓冲 液内，染色 2~3min。用 Ph6.8 磷酸缓冲液冲洗 3 次，每次 1~2min。晾干后在荧光显微镜下 观察，如微核带红色荧光，可再冲洗数分钟，直至发黄绿色荧光。在染色、干燥过程中均应 避光，以防荧光减弱或消失。 （5）封片染色干燥后的涂片，若需长时间保存，可放入二甲苯透明 6min，取出后趁湿 滴上适量中性树脂胶， 盖上盖玻片， 平置。 待干后却可收入盒内备检。 若在短时内进行观察， 涂片不需制成涂片。 （6）镜检先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞完整、分布均匀和染色良好的区域，再 以油镜检查计数。 可用细胞形态是否完好， 作为判断制片优劣的标准。 嗜多染红细胞 （PCE） 呈灰蓝色，成熟的正染红细胞（NCE）呈粉红色。 每只动物需计数 1000 个嗜多染红细胞， 并计算含微核的嗜多染红细胞数， 列入表实 6-1。 在一个嗜多染红细胞中出现两个或多个微核，仍按一个为细胞计算。微核率按下式计算，并 以千分率表示。 微核率列入表实 6-2。 另外， 在计数 PCE 时， 计数见到的 NCE 数， 求出 PCE/NCE 的比值。 嗜多染红细胞微核率=有微核的嗜多染红细胞总数/检查嗜多染红细胞数× 100% 表示 6-1 出现微核的嗜多染红细胞数统计 性别 空白对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 阳性对照组
小鼠微核试验
可取胸骨或股骨的骨髓。 固定 将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇溶液固定 15 min， 取出晾干。不能及时染色的涂片也应固定后保 存。 染色 将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的 Gemsa 应用液染色 10 ～ 15 min， 然后冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上 晾干。 观察计数
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
• 国际环境致突变物致癌物防护委员会(ICPEMC)
于1983年提出致突变试验的遗传学终点分为5类: ①DNA完整性的改变(形成加合物、断裂、交联)； ②DNA重排或交换；③DNA碱基序列改变；④染 色体完整性改变；⑤染色体分离改变。 其中③实 际上指基因突变；④指染色体畸变。
--------------------------------------------------------------------------------------试验名称 DNA DNA重排 DNA碱基 染色体完整 染色体分离 完整性 或交换 序列改变 性改变 改变 ------------------------------------------------------------------------------------细胞遗传学试验 1 2 微核试验 1 2 显性致死试验 1 2 体外姐妹染色单体 交换试验(SCE) 2 1 可遗传易位试验 1 细菌回复突变试验 1 哺乳动物细胞突变试验 1 果蝇伴性隐性致死试验 1 转基因动物检测系统 1 DNA测序及分子杂交 检测技术 1 小鼠特定基因座突变试验 1 酵母重组试验 1 2 1 细菌DNA修复试验 体外UDS试验 1 单细胞凝胶电泳技术 1 DNA加合物检测技术 1 ------------------------------------------------------------------------------------
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通过本次实验, 通过本次实验,学习和掌握小鼠骨髓 多染红细胞(PCE)微核的测定方法 的测定方法， 多染红细胞(PCE)微核的测定方法，了解 环磷酰胺对骨髓细胞染色体的损伤作用。 环磷酰胺对骨髓细胞染色体的损伤作用。
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6. 注意事项
1.良好的骨髓涂片及良好的染色， 1.良好的骨髓涂片及良好的染色，是本实 良好的骨髓涂片及良好的染色 验的关键步骤。 验的关键步骤。 2.熟悉并正确区分跟中骨髓细胞 熟悉并正确区分跟中骨髓细胞。 2.熟悉并正确区分跟中骨髓细胞。
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4. 实验步骤
与沉淀物混匀后， 与沉淀物混匀后，用滴管吸取并滴一滴在清洁的 载玻片上推片。 载玻片上推片。阳性及阴性对照组按上述方法同 时进行处理。 时进行处理。
三、固定
将推好晾干的骨髓片放人染色缸中， 将推好晾干的骨髓片放人染色缸中，用甲醇溶 液固定15min 取出晾干。 15min， 液固定15min，取出晾干。不能及时染色的涂片 也应固定后保存。 也应固定后保存。
2. 实验原理
微核试验是用于染色体损伤和干扰细 微核试验是用于染色体损伤和干扰细 胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。 胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。 微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗 微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗 大小相当于细胞直径的1/20 1/5， 1/20～ 粒，大小相当于细胞直径的1/20～1/5， 呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致， 呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致， 在间期细胞中可以出现一个或多个。一般 在间期细胞中可以出现一个或多个。 认为微核是细胞内染色体断裂 细胞内染色体断裂或 认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受 影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核 影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核 外的遗传物质 遗传物质。 外的遗传物质。
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5. 结果分析
本试验中只计数PCE中的微核，微核率以千分 本试验中只计数PCE中的微核， PCE中的微核 率表示。每只动物为一观察单位。每组的雌、 率表示。每只动物为一观察单位。每组的雌、雄 动物分别计算微核PCE的均值。 PCE的均值 动物分别计算微核PCE的均值。雌、雄动物之间 无明显的性别差异时可合并计算结果， 无明显的性别差异时可合并计算结果，否则应分 别进行计算；正常的PCE NCE比值约为1(正常范 PCE／ 比值约为1( 别进行计算；正常的PCE／NCE比值约为1(正常范 围为0.6 1.2)。如比值<0.1 则表示PCE 0.6～ <0.1， PCE形成 围为0.6～1.2)。如比值<0.1，则表示PCE形成 受到严重抑制，受试化学毒物的剂量过大， 受到严重抑制，受试化学毒物的剂量过大，试验 结果不可靠。 结果不可靠。阴性对照组和阳性对照组的微核发 生率， 生率，应与试验所用动物种属及品系的文献报道 结果或者是与研究的历史数据相一致。 结果或者是与研究的历史数据相一致。
食品专业
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系：生化环院
任课老师： 任课老师：吴雨龙 任课班级：09食品、 09食品 任课班级：09食品、行09食品 食品
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1. 实验目的
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4. 实验步骤
二、骨髓液的制备和涂片
试验动物最后一次染毒后，按确定的时间用颈 试验动物最后一次染毒后，按确定的时间用颈 椎脱臼或麻醉的方法将其处死， 的方法将其处死 椎脱臼或麻醉的方法将其处死，四肢固定于解剖 将腹中线被毛浸湿，剖开胸腹部，取下胸骨， 板，将腹中线被毛浸湿，剖开胸腹部，取下胸骨， 擦净血污，剔去肌肉，剪去股骨两端， 擦净血污，剔去肌肉，剪去股骨两端，用小型弯 止血钳将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片 将骨髓挤于 止血钳将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片 上，混合均匀后推片。也可在动物处死后，迅速 混合均匀后推片。也可在动物处死后， 用手术剪将其两腿股骨取下，剔去肌肉， 用手术剪将其两腿股骨取下，剔去肌肉，用生理 盐水洗去血污和碎肉，剪去股骨两端， 盐水洗去血污和碎肉，剪去股骨两端，用带针头 2ml注射器吸取小牛血清，插人骨髓腔内， 注射器吸取小牛血清 的2ml注射器吸取小牛血清，插人骨髓腔内，将骨 髓冲人离心管， 髓冲人离心管，然后用吸管吹打骨髓团块使其均 1000r／min离心10min，弃去多余的上清液， 离心10min 匀，以1000r／min离心10min，弃去多余的上清液， 留下约0.5ml 留下约0.5ml
四、染色
将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的Giemsa应 将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的Giemsa应 Giemsa 用液(Giemsa储备液l份加pH6.8的磷酸盐缓冲液9 (Giemsa储备液 pH6.8的磷酸盐缓冲液 用液(Giemsa储备液l份加pH6.8的磷酸盐缓冲液9 染色10 15min，然后冲洗掉玻片上的染色液， 10份)染色10-15min，然后冲洗掉玻片上的染色液， 置晾片架上晾干。 置晾片架上晾干。
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4. 实验步骤
五、观察计数
先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀， 先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀，染色 低倍镜下进行观察 较好的区域，再在油镜下观察计数，PCE细胞呈 油镜下观察计数 较好的区域，再在油镜下观察计数，PCE细胞呈 灰蓝色，正染红细胞(NCE)呈橘黄色。 (NCE)呈橘黄色 灰蓝色，正染红细胞(NCE)呈橘黄色。细胞中含 有的微核多数呈圆形，边缘光滑整齐， 有的微核多数呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与 核质一致，呈紫红色或蓝紫色。 核质一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可出 现一个或多个微核。计数1000 PCE中含微核的 1000个 现一个或多个微核。计数1000个PCE中含微核的 PCE数，并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。 PCE数 并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。 200个细胞中PCE 的比值
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2. 实验原理
所以， 所以，微核试验能检测化学毒物或物理因 素诱导产生的染色体完整性改变 染色体完整性改变和 素诱导产生的染色体完整性改变和染色体 分离改变这两种遗传学终点 这两种遗传学终点。 分离改变这两种遗传学终点。 微核可以出现在多种细胞 多种细胞中 微核可以出现在多种细胞中，但在有 核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物 相区别。由于红细胞在成熟之前最后一次 相区别。由于红细胞在成熟之前最后一次 红细胞 分离后数小时可将主核排出 而仍保留微 主核排出， 分离后数小时可将主核排出，而仍保留微 核于PCE细胞中 因此通常计数PCE细胞 PCE细胞 计数PCE细胞中 核于PCE细胞中，因此通常计数PCE细胞中 的微核。 的微核。
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3. 实验材料
实验动物： 实验动物：
体重18-22g小鼠，雌雄对半。 体重18-22g小鼠，雌雄对半。 18 小鼠
实验器材： 实验器材：
手术剪、晾片架、眼科剪、眼科镊、 手术剪、晾片架、眼科剪、眼科镊、 显微镜、饲养笼等。 显微镜、饲养笼等。
实验试剂： 实验试剂：
甲醇、冰醋酸、吉姆萨染液、 甲醇、冰醋酸、吉姆萨染液、小牛 血清、生理盐水、环磷酰胺。 血清、生理盐水、环磷酰胺。
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4. 实验步骤
一、试验动物及处理
1.动物选择：一般常用的试验动物为大、小鼠。 1.动物选择：一般常用的试验动物为大、小鼠。 动物选择 以小鼠使用最为广泛，要求体重18 20g， 18～ 以小鼠使用最为广泛，要求体重18～20g，7-12 周龄。每组小鼠数量10 10只 雌雄各半。 周龄。每组小鼠数量10只，雌雄各半。 2.染毒途径 染毒途径： 2.染毒途径：根据研究目的或受试化学毒物性 质的不同，可分别选用经口、经皮、 质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道 及注射等染毒途径。 及注射等染毒途径。但原则上应尽可能采用与 人体接触化学毒物相同的途径。 人体接触化学毒物相同的途径。 3.染毒次数及取样时间 染毒次数及取样时间： 3.染毒次数及取样时间：研究证实化学毒物需 在靶器官内蓄积至一定的浓度才具有致突变作 用。不同化学毒物诱发微核出现的高峰时间也 不尽相同。波动范围可以达到24 72h。 24～ 不尽相同。波动范围可以达到24～72h。这就要