小鼠骨髓多染红细胞微核试验

小鼠骨髓多染红细胞微核试验

实验原理

微核是由细胞分裂末期滞留的染色体片段或整条迟滞的染色体在分裂间期的子代细胞浆内形成的游离团块物质。微核实验作为细胞遗传损伤的标志之一，可用于染色体断裂剂和纺锤体损伤剂的检测。当骨髓成红细胞发展成为红细胞时，主核排除，成为多染红细胞，这些细胞保持其碱性约24小时，然后成为正染红细胞，并进入外周血中。在主核排出时，已形成的微核可留在胞浆中。由于这些细胞没有主核，便于观察微核。观察并计数多染红细胞中的微核，可反映染色体断裂和纺锤体损伤情况。本次试验的检测终点为染色体损伤。

一、实验动物

健康的成年ICR小鼠50只，体重18-22g，每组10只，雌雄各半，随机分组。

二、试剂与其器材

40%工业久效磷，环磷酰胺，PH6.8的小牛血清，甲醇，PH6.8的磷酸缓冲液，Giemsa 染液；注射器、小鼠灌胃针头、动物秤、剪刀、镊子、纱布、载玻片、染色盘、染色架、固定用染色缸、显微镜。

三、试验方法

1.实验动物：采用配伍组设计法对小鼠进行分组。每组10只，共5组。

2.剂量分组：设置阳性对照及阴性对照组。阳性对照物采用120mg/kg环磷酰胺，阴性对照物采用蒸馏水。此外设计三个剂量组，分别为高中低剂量组。通常取受试物LD50的1/2,1/4,1/8等剂量。剂量分别为1

3.2mg/kg，6.6mg/kg，3.3mg/kg。

3.染毒途径：经口灌胃染毒。

4.染毒次数及骨髓采样时间：一次染毒，24小时后取样测定。

5.取材：按照上述步骤染毒24小时后，颈椎脱臼处死动物，仔细剥离并取下一侧后肢股骨。用纱布擦净碎肉，减去股骨两端，露出骨髓腔，用注射器吸取少量小牛血清冲洗骨髓腔数次，冲洗物滴在玻片上。

6.制片：蘸取骨髓液，推片3张，干燥后取其中较好的两张用甲醇固定5分钟。

7.染色：用1:9的Giemsa-磷酸缓冲液（PH6.8）染色约10-15分钟，自来水冲洗后，自然干燥。

8.镜检：每只小鼠选择一张染色最成功的片子，在低倍镜下观察染色及分散情况。再在油镜下计数200个红细胞，计算多染红细胞在总红细胞中的比例，作为细胞毒性的指标。

每例样本计数1000个多染红细胞，记录有微核的细胞数。一个细胞中有几个微核时，仍以一个微核细胞计数。对微核细胞率的差别进行显著性检验，并研究是否有剂量反应关系。

200个红细胞中多染红细胞记录表：

微核细胞数记录表：

小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率

组别剂量动物数受检细胞数含微核细胞数微核率P值(mg/kg体重) (只) (个) (个) (‰)

受

试

阴性对照

阳性对照(mg/kg体重)