小鼠骨髓多染红细胞微核试验
小鼠骨髓细胞微核试验
注意事项
Giemsa染液pH6.8是细胞染色质量的重要 保证； 推制良好的骨髓涂片是本试验的关键步骤； 正确区分PCE细胞、NCE细胞及白细胞； 正确区分微核与染料颗粒。
材料
试剂：甲醇、冰乙酸、吉姆萨（Giemsa） 染液、小牛血清、磷酸盐缓冲液pH6.8， 环磷酰胺。 器材：晾片架、1ml注射器及针头、载波 1ml 片及推片、显微镜（具油镜头），细胞计 数器。 动物：小鼠，体重24-28g，雄鼠。
试验方法
1、给药：将小鼠称重随机分成二组，一 组为生理盐水组（腹腔注射0.2ml/10g.W)， 一组为环磷酰胺组（腹腔注射 1mg/10g.W)。 2、涂片：给药24h后用颈椎脱臼处死小鼠， 取出股骨，用滤纸擦净，纵形剪去1/4-1/3， 用针头挑出骨髓，放在已滴好一小滴小牛 血清的载波片上（血清宜滴在载玻片的一 端），用眼科镊头将骨髓团充分分散，推 片，在空气中晾干。
小鼠骨髓细胞微核试验 Micronucleus Test for Bone Marrow Cell in Mouse
西南大学药学院
目的
学习小鼠骨髓多染红细胞（ PCE）微核测 定方法，了解环磷酰胺对骨髓细胞染色体 的损伤作用
原理
微核是指细胞中主核之外的颗粒，染色与细胞核 一致，相当于细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或杏 仁状。微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响 而在细胞有丝分裂时滞留在细胞核外的遗传物质， 因而微核试验能检测药物或其它物质诱导产生的 染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传 学终点。 微核试验可用多种细胞，但在有核细胞中难于与 正常核的分叶及核突出物区分，故常计数PCE中 的微核，因为红细胞在成熟之前最后一次分离后 数小时将主核排出而微核被保留下来。
小鼠骨髓多染红细胞微核试验(氟化钠)
若微核发生在雌雄间有明显差异时，需按照性别分别进行统计分 析。 PCE/(PCE+NCE)不低于对照值的20%
PCE/NCE为评价细胞毒性的指标，受试组PCE/NCE值与阴性对照组比较有统 计学意义表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。 正常的PCE/NCE比值为1（0.6-1.2），如果＜0.1，则表示PCE形成受到严重 抑制；如果＜0.05，则表示受试物剂量过大，结果不可靠。
小鼠骨髓多染红细胞微核实验中
3. 微核可出现于多种细胞中，但在有核细胞中难以与正常核的分 叶及核突出物区分，故常计数PCE细胞中的微核，因为成红细 胞发展为红细胞时，主核排出，成为PCE，这些细胞保持其嗜 碱性约24小时，然后成为NCE,并进入外周血。 4. 在主核排出时，已形成的微核可留在胞浆中。因此，这些在细 胞中没有主核，便于观察。观察并计数多染红细胞中的微核， 可反映染色体断裂和纺锤体损伤情况。本试验的测试终点为染 色体损伤。
?再计数200个红细胞记录pce在总红细胞pcence中的比例作为对细胞毒性的指标多染红细胞pce正染红细胞nce微粒浅兰色胞浆呈颗粒状油画淡红色胞浆呈均质状水彩画圆形或椭圆形边缘光滑染色与有核细胞的核一致紫红色大小约为红细胞的12015文档仅供参考不能作为科学依据请勿模仿
小鼠骨髓多染红细胞微核试验
• 本次实习采用一次染毒， 24小时后取样测定
操作步骤
24小时后 染毒 取材 制片 染色 镜检
取骨
擦净血污、剔去肌肉
பைடு நூலகம்
pH=6.4 Giemsa染色液染色10-15min
冲洗、晾干
剪去骨骺端 小 牛 pH=6.4 血 清 甲醇中固定2min 吹 干 混匀、推片 镜检、细胞计数
镜检
细胞生物实验：微核实验
实验器材
离心机，显微镜，擦镜纸，二甲 苯，香柏油，手术剪，手术镊子， 刻度离心管，1ml注射器，Giemsa 染色液，75%酒精纱布块，甲醇， 生理盐水。
实验内容和方法
1.骨髓细胞液制备：取小鼠股骨，剔
Hale Waihona Puke 净肌肉制备骨髓细胞悬液。 2.离心：1000r/min离心5分钟。 3.涂片 4.甲醇固定5分钟 5.染色：Giemsa染液中染色10分钟。 6.显微镜观察
作业与思考
1.画一个具有微核的嗜多染红细胞。 2.计算出平均微核率，并与自发微核
率（1~3‰）比较，说明微核增加的 原因。
小鼠骨髓嗜多染红细胞 微核试验
实验目的
通过对用已知诱变剂（环磷酰胺） 处理的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的 测定，初步掌握微核试验的方法和制片 技术。
实验原理
微核是染色体断裂后由遗留下来 的无着丝粒片断演化而来的次核，其 直径通常为红细胞的1/20~1/5，在骨髓 和外周血液的各类型细胞中均可见到， 但在有核细胞中，微核常难以与核叶 相鉴别，而在嗜多染红细胞中，因主 核已排除，若有微核发生则非常容易 辨认。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核自 发率很低（1~3‰），但在致变剂 的作 用下，微核发生率可明显增高，因而 微核试验是检测致畸因子的有效的手 段。
小鼠骨髓中嗜多染红细胞(PCE)微核实验简介-推荐下载
小鼠骨髓中嗜多染红细胞（PCE）微核实验简介微核（micronucleus），与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质中，比主核小，故称微核。
故微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
实验目的1.学习和掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核测定方法2.了解细胞染色体损伤情况，掌握检测断裂剂和部分非整倍体致突变剂的测定方法3.进一步熟练制片和镜检操作器材与试剂1.器材手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、载玻片、玻璃染色缸、定时钟、晾片架、显微镜（带油镜）、注射器及针头、干净纱布、乳头吸管、玻璃铅笔、电吹风机2.试剂甲醇、Giemsa储备液、磷酸盐缓冲液（PH6.8）环磷酰胺操作步骤1.试验动物及处理（1）动物选择：一般选用大小鼠，小鼠最常用，18-20g，每组10只，雌雄各半。
（2）染毒途径：根据研究目的或受试物性质不同，原则上可尽量采用人类接触受试物的途径：通常采用灌胃法和腹腔注射。
（3）染毒次数：多次染毒法（每天染毒一次，连续4天，第五天取样）或两次染毒法（处死前30h+处死前6h）（4）剂量及对照选择据受试物的LD50，以1/2LD50为最高剂量组，下设3-4个剂量组。
同时设立阳性（环磷酰胺）和阴性对照（溶剂组）2.骨髓细胞制片和涂片：最后一次染毒后，在确定时间脱颈椎处死动物，迅速剪取其胸骨，剔去肌肉，用干净纱布擦拭，剪去每节骨骺端，用小型弯止血钳挤出骨髓液，点在载玻片一端预先滴好的一滴小牛血清中。
混匀后推片。
长度为2-3cm。
3.固定：将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇固定15min,取出晾干。
4.染色：Giemsa应用液染色15min.冲洗染色液，晾干。
5.观察计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分布均匀、疏密适度、形态完整、染色良好的区域，再在油镜下按一定顺序进行PCE和微核计数。
3.小鼠骨髓细胞微核试验
Giemsa染色时网织红细胞呈蓝灰色，称为多染红细胞；而成熟红细 胞染色呈橘红色，称为正染红细胞。
三.实验步骤 1.染毒：昆明种小鼠，环磷酰胺100mg/kg腹腔注射。 2.骨髓液制备和涂片：颈椎脱臼处死动物。解剖后取胸骨或股骨， 去除肌肉，剪去骨骺，将骨髓挤出或冲洗出，滴于载玻片推片。 3.固定：晾干后甲醇固定15秒，取出晾干。 4.染色：晾干后以新鲜配制的Giemsa染液染色5-10分钟，自来水冲 洗，晾干。 5.观察计数：低倍镜选择分布均匀、染色较好的区域，油镜下观察 计数。含有微核的PCE/1000个PCE；PCE/NCE。
实验三 小鼠骨髓多染红细胞微核试验
重庆医科大学实验教学管理中心 公共卫生实验原理 3.掌握镜下辨认微核的技术
二.实验原理： 细胞分裂过程中在染色体断裂剂或纺锤体毒物作用下，细胞染色体 断裂产生不含着丝粒的断片，或者整条染色体遗失在细胞质中，形 成微核。 染色与主核一致，大小相当于细胞直径的1/20-1/5，圆形或椭圆 形，一个或多个。 在多种细胞中出现。 在红细胞成熟前组后一次分裂后数小时主核排除而微核保留。
红细胞发育过程： 骨髓多能干细胞→定向干细胞→原红细胞→早幼红细胞→中幼红细 胞→晚幼红细胞→网织红细胞→成熟红细胞 从原红细胞到晚幼红细胞需分裂3-4次。形成晚幼红细胞后即不再 分裂，在发育过程中主核排出形成网织红细胞。网织红细胞含有少 量RNA，甲酚蓝染色成蓝色丝网状。网织红细胞进一步发育，RNA消 失成为成熟红细胞。
四.结果分析与评价 1.PCE/NCE比值约为1（0.6-1.2）。比值小于0.1表明PCE生成严重 受抑制，染毒剂量过大。 2.用统计方法分析结果。 五.实验成功的关键 1.制作良好的骨髓涂片 2.优质的染色
(x)小鼠骨髓嗜多染红细胞微
结果评价
♦ 正常小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率为千
分之五以下，超过千分之五为异常 。
实验步骤（制片）
♦ (4)固定 放在甲醇液中固定5~1Omin，如
当日不染色，也需固定后保存。 ♦ (5)染色 在Giema应用液中染色10~l5min， 最后用蒸馏水冲洗。
观察计数
♦ 选择细胞分散均匀、形态完整、染色良好的区
域，在油镜下按一定顺序进行嗜多染红细胞 (PCE)及微核计数。嗜多染红细胞呈灰蓝色， 而成熟红细胞呈桔红色。PCE中微核的嗜色性 与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。典型的微核 呈圆形，边缘光滑、整齐，其直径通常为红细 胞的1/20~1/5。偶尔也可呈椭圆形、肾形、马 蹄形及环形。PCE中微核多数为一个，也可能 有两个或两个以上的微核，此时仍按一个有微 核的PCE计算。每只动物计数200O个PCE，观察 含有微核的PCE数，微核率以千分率表示。
实验原理
♦ 骨髓中PCE数量充足，微核容易辨认，
而且微核自发率低。由于这些优点，骨 髓的PCE细胞成为骨髓微核试验的首选 细胞群。故一般检查嗜多染红细胞中微 核的多少来鉴别是否异常;
试剂和材料
♦ 主要试剂 ♦ 胎牛血清 ♦ 材料： ♦ 小平皿、滤纸、载玻
片、离心机、显微镜 ♦ 成年小鼠，体重1822克。
实验步骤（制片）
♦ (2)离心 以10OOrpm离心5min，用毛细吸
管吸去上清液。如沉淀物较多，可留下 少许血清，否则应吸去全部上清液。最 后，用毛细吸管尖端把沉淀物混匀。 ♦ (3)涂片 吸取一小滴混悬液滴于玻片的 一端，按常规血涂片法涂片，约2·3cm长 度，在空气中晾干(若立即染色，可在酒 精灯上稍加烘烤)。
实验步骤
♦灌药 ♦制片
实验步骤（灌药）
小鼠骨髓细胞微核试验
（三）固定、染色 推片晾干 加6~10滴染液盖满玻片30秒 加水10~15滴混匀 染色6~8分钟 洗去 染液
（五）观察结果 1.先在低倍镜下选择分布均匀，染色的区域 2.在油镜下观察计数。
3.计数 300~600个PCE中含微核的 PCE数， 并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。 （PCE细胞呈灰蓝色，正染红细胞呈桔黄色）
3.实验试剂：甲苯、环磷酰胺、小牛血清、 生理盐水、快速染液等。
四、操作步骤
（一）试验动物及处理
1.动物选择：小鼠，体重18～20g，7～12周龄。每 组小鼠数量4只。
2.染毒途径：经口染毒。 3.染毒次数：每天染毒一次，连续4天，第5天取样。 4.剂量选择：1/2 LD50为最高剂量。甲苯灌胃 0.06ml/20g、0.03ml/20g、0.02ml/20g。 5.对照组：阳性对照组环磷酸胺（60mg/kg）腹腔注 射一次。阴性对照组使用等体积的溶剂。
六、注意事项
该试验的关键步骤是制作良好的骨髓涂片 及优质的染色。
（微核多呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核 质一致，呈紫红色或蓝紫色。）
五、结果分析与评价
微核率以千分率表示。每只动物为一观察单 位。 正常的PCE／NCE比值约为1（正常范围为 0.6～1.2）。 阳性对照组微核发生率一般大于千分之五， 且与阴性对照组比较有统计学意义。 阳性结果：受试物至少一个剂量组与对照组 比较有统计学意义，且有剂量反应关系。
小鼠骨髓Hale Waihona Puke 胞微核试验公共卫生学院 冯昶
一、目 的
学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞 （PCE）微核测定方法
二、原 理
1.微核的形态： 2.观察、检测对象： 3.微核试验的意义：
小鼠骨髓微核试验
首都医科大学
毒理学基础
（五）结果分析与评价
正常的PCE/NCE比值约为1（正常范围0.6 ~
1.2）；PCE/NCE＜0.1，
阴性对照组和阳性对照组的微核发生率 多种统计学方法（Poinsson分布、二项分布、
x2检验等）均有人应用
首都医科大学
毒理学基础
（五）结果分析与评价
注意：本实验的关键步骤是制作良好的骨 髓涂片及优质的染色。
姆萨染色呈灰蓝色；成熟红细胞（NCE）的核糖体已
消失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充 足，微核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓 中嗜多染红细胞成为微核试验的首选剂
器材： 手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、 干净纱布、带橡皮头吸管、晾片架、玻璃蜡笔、玻 璃染色缸、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微 镜、细胞计数器 试剂：甲醇（分析纯）、甘油（分析纯）、小牛血 清、生理盐水、Giemsa贮备液、磷酸盐缓冲液（ pH6.8） 阳性对照物：环磷酰胺或丝裂霉素C
正染红细胞 嗜多染红细胞及微核
首都医科大学
毒理学基础
正染红细胞
嗜多染红细胞及微核
首都医科大学
毒理学基础
首都医科大学
毒理学基础
首都医科大学
毒理学基础
染色太浅
首都医科大学
毒理学基础
（五）结果分析与评价
微核率指含有微核的嗜多染红细胞数，以千 分率（‰）表示 若一个嗜多染红细胞中出现两个或两个以上 微核，仍按一个有微核细胞计数
毒理学基础
实习二 小鼠骨髓细胞微核试验
卫生毒理与卫生化学系
2013.10.22
首都医科大学
毒理学基础
（一）目的
学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞（PCE）微 核测定方法。
最新实验八小白鼠骨髓嗜多染红细胞微核检测方法-药学医学精品资料
一、实验目的
1、熟悉微核实验的基本原理和方法 2、理解微核实验的意义
二、实验原理及意义
细胞在受到射线或有害化学物质的作用后， 可产生除细胞核以外的次级核，因其化学 成分与细胞主核相同，且体积很小，故称 微核。 本实验用环磷酰胺作诱导剂，促使小白鼠 骨髓细胞中染色体断裂，产生微核 。 由于微核的产生与染色体和DNA损伤有较 大关系，故常将微核的检出率作为DNA损 伤的一种指标。
三、实验方法与步骤
1、染毒：提前两天小鼠腹腔注射环磷酰胺， 剂量分别为：250mg/kg体重 ， 100mg/kg体 重，空白对照组。 2、取材：取两腿股骨，用注射器吸取1ml灭 活小牛血清，将针头插入骨髓腔上段冲洗， 用离心管接收冲洗液，两根股骨的骨髓冲 洗在一支离心管中。即成骨髓细胞悬液。
3．离心 ：1000r/min离心5min，弃大部分上 清液，留少许液体，用毛细吸管将细胞团 块轻轻吹打均匀，即成骨髓细胞悬液。 4、涂片： 混匀后的液体滴1滴于载玻片上， 血常规涂片法涂片，每个同学涂一张，自 然干燥。 5、固定： 玻片标本置于甲醇溶液中固定 5min～10min，晾干 6．染色： Giemsa原液用磷酸缓冲液按1∶10 的比例稀释，染色10min。自来水细胞分散均匀、 形态完整、染色良好的区域，再转到油镜 下，观察嗜多染红细胞的微核。典型的微 核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，偶尔 呈肾形、马蹄形或环形，嗜色性与主核一 致，直径通常为主核的1/20~1/5。
每个同学观察并计数100个嗜多染红细 胞中的微核细胞，以小组为单位，统计数 据，得出微核细胞的千分率，并将结果写 成实验报告交老师。 微核计数以“细胞”为单位，即1个细胞中 出现2个或2个以上微核时，只按“1”计算
实验17 小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞微核试验金一和大連理工大学環境与生命学院微核形成机理微核实验原理微核是染色体断裂或纺锤丝受损, 在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。
RBC在成熟之前最后一次细胞分裂后，主核排出细胞外，微核仍滞留在PCE细胞中。
因此，可以根据PCE细胞中微核出现率，观察环境污染物对染色体完整性和染色体分离改变的影响，判定其有无遗传毒性。
实验目的1.掌握小鼠骨髓细胞微核试验方法2.掌握骨髓多染红细胞（PCE）中微核的观察方法实验器材1.手术刀2.手术剪3.无齿镊4.小型弯止血钳5.干净纱布6.带橡皮头吸管7.台式离心机8.刻度离心管9.电吹风机10.玻璃蜡笔11.2ml注射器及针头12.载玻片及推片13.定时钟14.带油镜头显微镜15.细胞计数器16.玻璃染色缸17.晾片架主要试剂甲醇（分析纯）生理盐水小牛血清pH6.8的磷酸盐缓冲液分别取1/15 mol/L的磷酸二氢钾溶液50.40ml和1/15 mol/L的磷酸氢二钠溶液49.60ml，两者混合均匀。
阳性对照物环磷酰胺或丝裂霉素C实验操作步骤•染毒次数连续 4 次染毒取样时间最后一次染毒后，经过24h，取骨髓制作骨髓涂片骨髓涂片的固定、染色和封片微核观察和细胞计数骨髓细胞染色方法取胸骨剪去骨骺端擦净血污，剔去肌肉小牛血清Giemsa 应用液10~15min 甲醇中，固定15min 混匀、推片冲洗、晾干晾干冲洗、晾干细胞计数嗜多染红细胞和微核微核率计算方法结果分析与评价阳性判断实验组中至少一个剂量组微核阳性率显著大于对照组，并具有重现性和剂量-反应关系。
阴性结果试验剂量不够、采样时间不合适、细胞计数量不足、实验动物自发微核率高等原因，均可以造成实验结果阴性。
当实验设计符合标准，试验剂量足够大，其他染毒方式的微核试验结果仍为阴性时，可认为受试物微核试验阴性。
注意事项1. 实验所用的器具必须洁净，小牛血清无污染。
2. 骨髓涂片上，细胞疏密程度要合适，细胞之间互不重叠。
小鼠骨髓中嗜多染红细胞(PCE)微核实验简介
小鼠骨髓中嗜多染红细胞（PCE）微核实验简介微核（micronucleus），与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质中，比主核小，故称微核。
故微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
实验目的1.学习和掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核测定方法2.了解细胞染色体损伤情况，掌握检测断裂剂和部分非整倍体致突变剂的测定方法3.进一步熟练制片和镜检操作器材与试剂1.器材手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、载玻片、玻璃染色缸、定时钟、晾片架、显微镜（带油镜）、注射器及针头、干净纱布、乳头吸管、玻璃铅笔、电吹风机2.试剂甲醇、Giemsa储备液、磷酸盐缓冲液（PH6.8）环磷酰胺操作步骤1.试验动物及处理（1）动物选择：一般选用大小鼠，小鼠最常用，18-20g，每组10只，雌雄各半。
（2）染毒途径：根据研究目的或受试物性质不同，原则上可尽量采用人类接触受试物的途径：通常采用灌胃法和腹腔注射。
（3）染毒次数：多次染毒法（每天染毒一次，连续4天，第五天取样）或两次染毒法（处死前30h+处死前6h）（4）剂量及对照选择据受试物的LD50，以1/2LD50为最高剂量组，下设3-4个剂量组。
同时设立阳性（环磷酰胺）和阴性对照（溶剂组）2.骨髓细胞制片和涂片：最后一次染毒后，在确定时间脱颈椎处死动物，迅速剪取其胸骨，剔去肌肉，用干净纱布擦拭，剪去每节骨骺端，用小型弯止血钳挤出骨髓液，点在载玻片一端预先滴好的一滴小牛血清中。
混匀后推片。
长度为2-3cm。
3.固定：将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇固定15min,取出晾干。
4.染色：Giemsa应用液染色15min.冲洗染色液，晾干。
5.观察计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分布均匀、疏密适度、形态完整、染色良好的区域，再在油镜下按一定顺序进行PCE和微核计数。
厦门大学-实验五.小鼠骨髓细胞微核试验(讲义)
1小鼠骨髓细胞微核试验(Bone marrow cell micronucleus test)⏹指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，大小相当于细胞直径的1/20~1/5，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。
2微核(micronucleus ，MN)细胞核微核⏹细胞有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片/环，也可以是纺锤体受损而丢失的整个染色体。
⏹它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微核。
⏹一般认为微核是细胞受到染色体断裂剂或纺锤体毒物作用的结果。
3微核(micronucleus ，MN)小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验⏹嗜多染红细胞(polychromatic erythrocyte ，PCE)细胞质内仍含有核糖体的未成熟红细胞。
4⏹正染红细胞(normochromatic erythrocyte ，NCE)核糖体已消失的成熟红细胞。
为何选择PCE (polychromatic erythrocytes)⏹PCE ：指在红细胞成熟之前，最后一次分离后数小时将主核排出的细胞，而微核仍保留在细胞质中。
⏹微核可以出现在多种细胞，但在有核细胞中难与正常核的分叶及核突出物区别。
5为何选择PCE ？⏹PCE ：Giemsa 染色呈灰蓝色(胞质内含核糖体)⏹NCE(正染红细胞/成熟红细胞，normochromatic erythrocyte ，NCE))：淡桔红色⏹骨髓中PCE 数量充足，微核容易辨认，且微核自发率低，因此，成为微核试验的首选细胞群。
6一.实验目的和意义⏹1.了解小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验的实验原理及毒理学意义。
⏹2. 掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核测定方法。
7二.实验原理⏹微核试验检测外源化学物诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
小鼠骨髓细胞微核试验
四、
操作步骤
1． 动物一般选用 7~12 周的、体重 20~30g 的小鼠，也可选用体重 150~200g 的大鼠。 每个剂量组至少用两种性别的动物各 5 只。 若需多次采样， 则每组的动物数需增加， 每个采样时间至少有 8 性质 （尤其是溶解度、 水溶性或脂溶性） ， 确定溶剂。 一般采用水或食用植物油，不容者可用淀粉制成混悬液。 一般在受试物的 1/2~1/30LD50 范围内选择 3~4 个剂量组。 也可采用急性毒性试验中出现中毒 而不致死的剂量作为染毒最高剂量组，以畜禽的可能摄入量作为最低剂量组，中间插入 1~2 个剂量组。同时设对照组，即空白对照、溶剂对照和阳性对照。阳性对照组用环磷酰胺生理 盐水溶液一次腹腔注射 30~50mg/kg，或以环磷酰胺水溶液 80~120mg/kg，经口染毒两次， 间隔 24h。 3．染毒途径根据受试物的性质及畜禽接触方式不同，可分别选用灌胃、腹腔注射、皮 下或肌肉注射等染毒途径。 4．染毒方法一般采用 2 次染毒方法，两次间隔 24h。 5．制片 （1）骨髓细胞液的制备在第二次给予受试物 6h 后，小鼠脱颈椎处死。取下小鼠两侧股 骨，剔去肌肉，用滤纸或纱布擦去血污和肌肉，减去股骨两端。用配有 6 号针头 1ml 注射器 吸取小牛血清约 0.05ml 冲洗骨髓腔数次，将冲洗物滴在载玻片上。 （2） 涂片将玻片上的冲洗物调匀后， 推片若干张。 迅速干燥， 可在酒精灯上短时烘烤。 （3）固定将干燥的涂片置甲醇液中固定 5~10min，取出晾干。当日不染色的涂片亦应 固定后保存。 （4）染色固定好的涂片用 1:10 的吉姆萨-磷酸缓冲液（pH6.4）染色 15~30min。用蒸馏 水冲洗，干燥，待检。 为了便于诊断，可选用吖啶橙染色法。固定好的涂片放入 0.24mmol/L 吖啶橙磷酸缓冲 液内，染色 2~3min。用 Ph6.8 磷酸缓冲液冲洗 3 次，每次 1~2min。晾干后在荧光显微镜下 观察，如微核带红色荧光，可再冲洗数分钟，直至发黄绿色荧光。在染色、干燥过程中均应 避光，以防荧光减弱或消失。 （5）封片染色干燥后的涂片，若需长时间保存，可放入二甲苯透明 6min，取出后趁湿 滴上适量中性树脂胶， 盖上盖玻片， 平置。 待干后却可收入盒内备检。 若在短时内进行观察， 涂片不需制成涂片。 （6）镜检先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞完整、分布均匀和染色良好的区域，再 以油镜检查计数。 可用细胞形态是否完好， 作为判断制片优劣的标准。 嗜多染红细胞 （PCE） 呈灰蓝色，成熟的正染红细胞（NCE）呈粉红色。 每只动物需计数 1000 个嗜多染红细胞， 并计算含微核的嗜多染红细胞数， 列入表实 6-1。 在一个嗜多染红细胞中出现两个或多个微核，仍按一个为细胞计算。微核率按下式计算，并 以千分率表示。 微核率列入表实 6-2。 另外， 在计数 PCE 时， 计数见到的 NCE 数， 求出 PCE/NCE 的比值。 嗜多染红细胞微核率=有微核的嗜多染红细胞总数/检查嗜多染红细胞数× 100% 表示 6-1 出现微核的嗜多染红细胞数统计 性别 空白对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 阳性对照组
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小鼠骨髓多染红细胞微核试验
实验原理
微核是由细胞分裂末期滞留的染色体片段或整条迟滞的染色体在分裂间期的子代细胞浆内形成的游离团块物质。
微核实验作为细胞遗传损伤的标志之一，可用于染色体断裂剂和纺锤体损伤剂的检测。
当骨髓成红细胞发展成为红细胞时，主核排除，成为多染红细胞，这些细胞保持其碱性约24小时，然后成为正染红细胞，并进入外周血中。
在主核排出时，已形成的微核可留在胞浆中。
由于这些细胞没有主核，便于观察微核。
观察并计数多染红细胞中的微核，可反映染色体断裂和纺锤体损伤情况。
本次试验的检测终点为染色体损伤。
一、实验动物
健康的成年ICR小鼠50只，体重18-22g，每组10只，雌雄各半，随机分组。
二、试剂与其器材
40%工业久效磷，环磷酰胺，PH6.8的小牛血清，甲醇，PH6.8的磷酸缓冲液，Giemsa 染液；注射器、小鼠灌胃针头、动物秤、剪刀、镊子、纱布、载玻片、染色盘、染色架、固定用染色缸、显微镜。
三、试验方法
1.实验动物：采用配伍组设计法对小鼠进行分组。
每组10只，共5组。
2.剂量分组：设置阳性对照及阴性对照组。
阳性对照物采用120mg/kg环磷酰胺，阴性对照物采用蒸馏水。
此外设计三个剂量组，分别为高中低剂量组。
通常取受试物LD50的1/2,1/4,1/8等剂量。
剂量分别为1
3.2mg/kg，6.6mg/kg，3.3mg/kg。
3.染毒途径：经口灌胃染毒。
4.染毒次数及骨髓采样时间：一次染毒，24小时后取样测定。
5.取材：按照上述步骤染毒24小时后，颈椎脱臼处死动物，仔细剥离并取下一侧后肢股骨。
用纱布擦净碎肉，减去股骨两端，露出骨髓腔，用注射器吸取少量小牛血清冲洗骨髓腔数次，冲洗物滴在玻片上。
6.制片：蘸取骨髓液，推片3张，干燥后取其中较好的两张用甲醇固定5分钟。
7.染色：用1:9的Giemsa-磷酸缓冲液（PH6.8）染色约10-15分钟，自来水冲洗后，自然干燥。
8.镜检：每只小鼠选择一张染色最成功的片子，在低倍镜下观察染色及分散情况。
再在油镜下计数200个红细胞，计算多染红细胞在总红细胞中的比例，作为细胞毒性的指标。
每例样本计数1000个多染红细胞，记录有微核的细胞数。
一个细胞中有几个微核时，仍以一个微核细胞计数。
对微核细胞率的差别进行显著性检验，并研究是否有剂量反应关系。
200个红细胞中多染红细胞记录表：
微核细胞数记录表：
小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率
组别剂量动物数受检细胞数含微核细胞数微核率P值(mg/kg体重) (只) (个) (个) (‰)
受
试
阴性对照
阳性对照(mg/kg体重)。