小鼠骨髓间充质干细胞原代培养概要
间充质干细胞的传代课件
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细胞分裂的维持
总结词
细胞分裂是维持细胞数量的关键，通过维持适宜的生长因子浓度，可以促进间充质干细胞的分裂与增 殖。
详细描述
在传代培养过程中，需要确保生长因子的浓度适宜，如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长 因子（EGF）等，以促进细胞的分裂与增殖。同时，还需注意避免细胞过度生长和密度过大导致的细 胞凋亡。
传代培养的定义
传代培养是指将细胞从原代或早期代次培养物中分离出来，继续在体外培养条件 下生长和增殖的过程。
在间充质干细胞的传代培养中，通常使用胰酶处理细胞，使其从贴壁状态脱离， 然后进行分瓶培养。
传代培养的必要性
随着细胞在体外培养时间的延长，细胞会逐渐衰老和分化， 导致其功能和表型发生变化。为了维持细胞的特性和功能， 需要定期进行传代培养。
通过传代培养，可以获得大量细胞用于实验研究、药物筛选 和临床治疗等应用。
传代培养的过程
胰酶处理
将胰酶加入细胞培养液中，轻 轻摇晃培养瓶，使胰酶均匀覆 盖细胞表面。
离心和洗涤
将细胞悬浮液离心，去除上清 液，并用生理盐水洗涤细胞。
准备培养瓶和培养基
选择适当的培养瓶和培养基， 并进行消毒和预处理。
分离细胞
06
实验操作注意事项
实验环境与设备
实验室温度
设备与器材
保持恒定的室温，避免温度波动影响 细胞生长。
确保使用无菌、高质量的实验器材， 如细胞培养皿、培养瓶、移液管等。
实验室湿度
维持适宜的湿度，以防止细胞脱水或 过度湿润。
实验操作规程与安全防护
操作规程
遵循标准的细胞培养操作规程， 包括细胞传代、细胞计数、细胞
02
小鼠骨髓基质干细胞的培养
1.2.5弃掉上述离心好的细胞液上清，加入5ml的α-MEM 培养基，加胎牛血清，，再加入12mlhank液，并用吸管反复吹打后再次离心1000转，5分钟
1.2.6弃上清，加样抢取0.1ml于小离心管中，再加入0.7ml（相当于7倍稀释）的Trypan染料，在相差显微镜下将盖玻片盖好在计数池上开始计数，剩余细胞悬液加入培养瓶中在适宜环境下进行接种培养
小鼠骨髓基质干细胞的培养
学号122010000178，2010级硕士同仁医院，严森
骨髓基质干细胞( marrow st romal stem cell,MSC)是一种来源于骨髓的成体干细胞, 本实验通 过小鼠骨髓基质干细胞的培养及对其进行体外细胞特性的研究。
目的: 取小鼠股骨骨髓进行骨髓基质干细胞的原代培养,通过相差显微镜、 光镜及扫描电镜观察, 了解骨髓基质干细胞的生长情况及其特点。练习血细胞计数器的使用方法 1 材料与方法
1.2.3取 1 月龄小白鼠 1只,雌雄不限,体重约20g, 断颈脱臼处死, 无菌条件下暴露股骨, 在培养皿中去除皮肤，附带的肌肉和骨膜,切断股骨,切断上肢，并将每一肢上下剪下两个小口便于冲洗，剥离四肢时用hanks 液进行冲洗,
1.2.3分次取12mlhanks液于10ml注射器中，分别灌洗四肢骨髓，一肢骨髓用去3ml，反复上下冲洗，用空的大离心管(20ml)收集冲洗液，并将冲洗液收集好后加盖离心，1000转，5分钟
可见细胞数目：四大个细胞总数/4*稀释倍数*104
2.结果：四个大格是50个细胞的，计算的结果：8.75×105/ml个，
3.注意事项：
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
骨髓间充质细胞共培养
骨髓间充质细胞共培养
骨髓间充质细胞（BMSCs）是一种多能干细胞，具有广泛的分化潜能和免疫调节作用。
BMSCs可以通过共培养的方式与其他细胞相互作用，从而影响它们的生长、分化和功能。
共培养是指将两种或更多种不同类型的细胞放在同一培养皿中，让它们相互作用。
BMSCs与其他细胞的共培养可以通过直接接触或间接接触的方式进行。
直接接触是指BMSCs与其他细胞直接接触，而间接接触是指BMSCs释放的细胞因子通过介质传递到其他细胞中。
BMSCs与其他细胞的共培养可以产生多种效应。
首先，BMSCs可以促进其他细胞的增殖和分化。
例如，BMSCs与神经元的共培养可以促进神经元的生长和分化，从而有助于神经再生和修复。
其次，BMSCs可以调节其他细胞的免疫反应。
BMSCs可以通过释放细胞因子来抑制其他细胞的免疫反应，从而减轻炎症和自身免疫性疾病等疾病的症状。
此外，BMSCs还可以促进其他细胞的代谢和功能。
例如，BMSCs与心肌细胞的共培养可以促进心肌细胞的代谢和收缩功能，从而有助于心脏功能的恢复。
BMSCs与其他细胞的共培养是一种重要的细胞学研究方法，可以用于研究细胞间相互作用的机制，以及开发新的细胞治疗方法。
未来，我们可以进一步探索BMSCs与其他细胞的共培养的机制和效应，以期为临床治疗提供更有效的细胞治疗策略。
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
骨髓间充质干细胞MSCs培养方案
骨髓间充质干细胞培养方法大鼠骨髓间充质干细胞培养方法仪器和材料磁力搅拌器电子天平水浴振荡器pH计真空泵离心机血球计数板1 x 100ml量筒1 x 1L 容量瓶1 x 500ml玻璃烧杯2 x 500ml 带盖无菌玻璃瓶1 x 100ml 带盖无菌玻璃瓶1 x 0.22um 无菌滤膜2 x 100mm 无菌培养皿4 x T25 无菌培养瓶4 x 15ml 无菌离心管2 x 转子2 x 5ml 无菌移液管1ml 无菌枪头封口膜脱脂棉3 x 手术剪2 x 直头镊子1 x 骨钳2 x 手术刀（刀柄+刀片）1 x 100ml 塑料烧杯（盛废液）2 x 100ml 玻璃烧杯低糖DMEM培养基粉末胎牛血清PBS双抗75%酒精SOLUTION PREPARATION溶液制备所有的水溶液均用二蒸水配制。
∙先将试剂在烧杯中用少量二蒸水溶解，然后补加至最终体积。
∙用容量瓶配制溶液。
原代培养：密度梯度离心法1)取鼠龄3-4w，体重70-120g的SD大鼠3-4只（雌雄不限）；2)将SD大鼠颈椎脱臼处死，浸入盛有约300-500ml 75%酒精的1000ml烧杯中浸泡5min；3)用镊子取出后用脱脂棉擦掉多余酒精，置于培养皿内，用手术剪剪开大腿内侧皮肤和肌肉，分离出股骨和胫骨，沿肌肉白线处清除其周围的肌肉，在培养皿中用5-10ml 75%酒精浸泡5min后移入超净工作台中；4)用镊子夹住大鼠股骨和胫骨放置于无菌的培养皿上方，依次用3-5ml PBS和无血清培养基冲洗2~3次后，移入另一无菌培养皿中。
用镊子和骨钳固定股骨，分别用10mL 注射器在骨两端钻孔；5)用5ml（或1ml）注射器吸取培养基从骨一端孔处插入，从上至下缓慢冲洗骨髓腔，用下方的无菌培养皿收集骨髓悬液，重复此过程2~3次；6)在15ml离心管中加入5mL Ficoll分离液，再将骨髓悬液沿管壁缓缓加入其上，注意一定要轻缓，不能让骨髓悬液与分离液相混合，调整骨髓悬液与分离液的体积比为2：1；7)将离心管以2000rpm离心20min，离心后管内物质分为三层，用吸管小心吸取中间的白膜层置于一个新的离心管内；8)在此离心管中加5ml培养基，吹打成单细胞悬液，1000rpm离心5min，离心后用吸管吸去上清液并去掉，加入完全培养基，并轻轻吹散细胞10~20次，制成细胞悬液；9)以5×106cell/ml的细胞密度接种于T25培养瓶中（培养瓶中培养基终体积为5ml）, 置于CO2培养箱中培养，48h后用吸管吸出全部培养液并去掉，添加新鲜培养液，以后每隔三天全量换液一次。
骨髓间充质干细胞的培养及生物学特性
Ｌ Ｕ ＪＡ ｉ ｔｌ Ｉ Ｉ ｑ ａ ｅ （ ｄ ｎ ｎ ｄｃｌ ｎ ｅｓｙ Ｍｕａｊ ｇＣ ｉａ Ｍｕ ａｊ ｇＭｅｉａ Ｕ ｉ ｒｉ ， ｄｎｉ ｈｎ ｉ ｖ ｔ ｎ １７ １ ） ５ ０ １
［ ｂｔ ｃ］ Ｏ ｊｃｖ ：ａｂｎ ｍ／ Ｗｍ ｓｎｈｍ ｌｔ ｌ （ Ｍ Ｃ ） ｅ ｏ ｔ ｄ ｕｕ ｄ ｎ ｒｅｔｉ ｅ ｉ ｔｔ ｏ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂｅｔｅＲ ｔ ｏｅ ｓＯ ｅ ｃｙ ａｓ ｍｃ ｌ Ｂ Ｓ ｓ ｗｒ ｉｌｅ ａ ｌｒ ｄｒｏｎ ｓｇ ｅｈ ｂ － ｉ Ｔ ｅ ｅ ｅｓ ｅｓ ａ ｄ ｎ ｃ ｔｅ ｉ ｏ ｖ ｔａ ｅ ｉ
ｌｇ ｃ ｈ ｒ ｃｅ ｉｔ ｓ ａ ｄ ｏ ｅ ｒ ｄ ｍｉａ ｔｔｒ ｅ ｅｌ ｆ ｒ ｔ ｓ ｅ ｅ ｇ ｎ ｅ ｉ ｇ ａ ｄ ｇ ｎ ｎ ｉｅ ｒ ｇ Ｍ ｅ ｈ ｄ ： ＭＳ ｓ ｗ ｒ ｕ ｔ ｒｄ ｏ ｉ ａ ｃ ａ ａ ｔｒ ｉ ｎ ｆ ｒ ｐ ｅ ｏ ｎ ａ ｇ ｔｃ ｌ ｏ ｉ ｕ ｎ ｉ ｅ ｒｎ ｎ ｅ ｅ ｅ ｇｎ ｅ ｉ ． ｌ ｓｃ ｎ ｓ ｓ ｎ ｔ ｏ ｓ Ｂ Ｃ ｅｅ ｃ ｌｕｅ
骨 髓 间充 质 干细胞 的培 养及 生ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 学特 性
刘嘉祺 林
（ 牡丹江 医学院
峰
李孟全
牡丹江 １７ １ ） ５ ０ １
黑龙江
【 摘 要】 目的： 分离、 培养大鼠骨髓间充质干细胞（ Ｍ Ｃ）探讨其生物学特性， Ｂ Ｓｓ， 为组织工程和基 因工程提供优势靶细胞。
方法 ： 骨髓 细胞贴壁 法进行 Ｂ Ｓ ｓ 全 Ｍ Ｃ 的原代培养 ， 倒置相差显微镜 观察 细胞 形 态， 流式 细胞 仪检 测 Ｂ Ｓｓ 面抗原 ， Ｔ 法 ＭＣ表 Ｍ ｒ 检测 Ｂ Ｓｓ 殖能力， ＭＣ增 并绘制生长 曲线。结果 ： 原代培养 ２ｈ ４ 后看见 少量贴壁细胞 ， 为小圆形 ，ｄ 可见梭 形类似 成纤维 初起 ３后 细胞 ， 涡样 生长， ３— 代细胞均一性 良好 ， 代 以后 细胞逐渐有 宽大梭形样 变， 呈漩 传 ６ ｌ ０ 增殖减慢 ， 偶有 细胞漂 浮、 亡。流 式 死 细胞仪检测传 ３ 代细胞 Ｃ ２ 表达率为 ９％ ，Ｄ４几乎无表达 。生长曲线显示 ， ３６ Ｂ Ｓ ｓ Ｄ９ ２ Ｃ３ 传 、 代 Ｍ Ｃ 有较 强的增殖 能力， 中传 其 ６代细胞更为明显 ， １ 传 ０代细胞的增殖能力较 前有所减弱。 结论 ： 成功从 大鼠骨髓组织分离、 培养 Ｂ Ｓｓ纯度 高， Ｍ Ｃ， 生物学特性 符合正常干细胞生长规律 ， 组织工程和基 因工程理 想的靶 细胞 。 是
小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的核受体Rev-erbα及Rorα
小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的核受体Rev-erbα及Rorα林富伟;徐晓梅;崔琰;谢乙加;赵青【摘要】BACKGROUND: The orphan nuclear receptors Rev-erbα and Rorα play important roles in lipid metabolism and glucose metabolism. But it is unclear whether they are involved in bone metabolism. OBJECTIVE: To observe the expression of Rev-erbα and Rorα during the osteoblastogenesis process of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). METHODS: BMSCs were isolated and purified from C57BL/6 mice by the whole bone marrow adherence method followed by morphology observations and then BMSCs were induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes. We detected their differentiation abilities using oil red O staining and alizarin red staining, respectively. Real-time PCR and western blot assay were conducted to detect the mRNA and protein levels of Rev-erbα and Rorα in BMSCs cultured in the osteogenic medium for 0, 7, 14 days. RESULTS AND CONCLUSION: BMSCs fromC57BL/6 mice were mainly spindle-shaped and exhibited the swirl-like pattern of growth. Following induction, oil red O staining and alizarin red staining produced a positive reaction in these cells. Rev-erbα expression at both gene and protein levels decreased at 0, 7, 14 days after osteogenic induction, while Rorα expression increased at both gene and pro tein levels. These findings indicate that Rev-erbα and Rorα may participate in the osteoblastogenesis of BMSCs.%背景:孤儿核受体Rev-erbα及Rorα已经被广泛证实与糖代谢、脂肪代谢等密切相关,但与骨代谢的关系尚不明确.目的:探讨孤儿核受体Rev-erbα及Rorα在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用.方法:采用全骨髓贴壁法分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察和成脂、成骨诱导分化,采用油红O染色,茜素红染色对其分化能力进行鉴定.在骨髓间充质干细胞成骨诱导分化第0,7，14天,采用Real Time PCR及Western Blot分别检测孤儿核受体Rev-erbα及Rorα的mRNA及蛋白表达变化.结果与结论:①骨髓间充质干细胞形态以梭形为主,呈典型的漩涡样生长.油红O染色及茜素红染色呈阳性;②在成骨诱导的第0,7,14天,Rev-erbα的mRNA及蛋白表达均呈下降趋势,而Rorα的mRNA及蛋白表达均呈上升趋势,提示Rev-erbα及Rorα在骨髓间充质干细胞成骨诱导过程中可能发挥了一定的作用.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2018(022)017【总页数】6页(P2625-2630)【关键词】干细胞;骨髓间充质干细胞;成骨分化;核受体;Rev-erbα;Rorα【作者】林富伟;徐晓梅;崔琰;谢乙加;赵青【作者单位】西南医科大学附属口腔医院正畸科,口颌面修复重建与再生实验室,四川省泸州市 646000;西南医科大学附属口腔医院正畸科,口颌面修复重建与再生实验室,四川省泸州市 646000;西南医科大学公共卫生学院,四川省泸州市 646000;西南医科大学附属口腔医院正畸科,口颌面修复重建与再生实验室,四川省泸州市646000;口腔疾病研究国家重点实验室,国家口腔疾病临床研究中心,四川大学华西口腔医院正畸科,四川省成都市 610041【正文语种】中文【中图分类】R394.2文章快速阅读：文题释义：Rev-erbα：又名Nr1D1，是孤儿核受体超家族中的一员，Rev-erbα基因位于人类第17号染色体上。
小鼠骨髓间充质干细胞使用说明
小鼠骨髓间充质干细胞小鼠骨髓间充质干细胞产品说明：为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的小鼠骨髓间充质干细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。
培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。
4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。
5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。
小鼠骨髓间充质干细胞产品简介：产品名称：小鼠骨髓间充质干细胞组织来源：正常小鼠骨髓产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶小鼠骨髓间充质干细胞简介：小鼠骨髓基质系统内存在的骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stemcells，BM-MSCs）是一种除造血干细胞以外的、具有多向分化潜能的干细胞，可以向骨、软骨、肌组织、皮肤、脂肪、神经等多种组织分化，因此可以作为组织工程中的种子细胞。
本公司生产的小鼠骨髓间充质干细胞采用冲洗骨髓，密度梯度离心，骨髓基质细胞专一性选择培养筛选获得，经检验细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
骨髓间充质干细胞培养方法大全
一、四种方法简介及优缺点：骨髓间充质干细胞主要有4种体外分离方法：贴壁筛选法，密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。
贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的培养MSCS的方法。
贴壁分离培养法分离的MSCS能在体外培养条件下生长良好、可连续传代，体外培养扩增能力较强，其缺点是细胞纯度较低。
此方法简便，冲出骨髓直接培养，然后利用骨髓MSCS 贴壁生长特性，更换培养液逐步去处漂浮生长的造血系细胞即可获得较纯化的MSCS；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质，可促进MSCS 贴壁生长，因此全骨髓贴壁法更为可取。
密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。
梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同，使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，再进行贴壁培养，从而达到分离、纯化MSCS的目的。
Pittenger等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到95%。
常用的分离方法免疫磁珠法，是利用免疫学的技术分离MSCS，分离细胞的纯度高。
Phinney 用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来，提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法，但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记;而且，这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响，造成MSCS损伤，出现增殖缓慢等问题，这些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用。
因此，如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞和细胞群仍需要继续探索。
分离细疫磁珠分离和流式细胞仪筛选的方法，不仅对细胞活性影响较大，而且操作复杂，价格昂贵。
然而，这些纯化间充质干细胞的方法比较复杂，一般仅限于在各自的实验室应用。
二、具体实验流程1. 免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞：1 实验动物Sd大鼠2 试剂和仪器BSA、荧光标记小鼠抗体x、PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱。
小鼠骨髓间充质干细胞原代培养
1、材料
成年小白鼠4只 胎牛血清（杭州四季清公司） L-DMEM (Hyclone赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司 ） 胰蛋白酶（Sigma公司） PBS（NaCl 8g,KCl 0.2g,NaHPO4·12H2O 2.88g,KH2PO4 0.2g,三蒸水1000ml) Percoll细胞分离液（Percoll原液：三蒸水:NaCl 2.6:1.9:0.5) 青霉素、链霉素（100U/ml青霉素，100µg/ml链霉素） 8%NaHCO3溶液（8gNaHCO3,100ml超纯水）
小鼠骨髓间充质干细胞的原代培 养
一、立题依据1、小鼠骨髓间质干细胞原代培养的意义 有利于迚行骨髓间充质干细胞的生物学特性的研究
为下一步的传代培养创造条件
可以直接应用于临床实践，是研究骨髓间充质干细胞作用 的前提
2、骨髓间充质干细胞原代培养的方法
贴壁培养筛选法 密度梯度离心法
结果一
第1次换液后5～7 d可见由几十个到数百个细胞组成的集落，细胞形 梭态呈形、三角形或星形 （图1C、D）
结果一
原代细胞培养10 d左右，细 胞快速增殖，每个集落中的 细胞不断增殖呈长梭形放射 状排列（图1E）
培养2周左右，每个小集落形 成约数百致上千个细胞的大 集落，集落交界处出现重叠 、融合 （图1F)
讨论
• 有时在相同的培养条件下，有极少数标本较难扩增骨髓MSCs，可能不冲洗骨 髓腔的操作有关。骨髓MSCs具有黏附贴塑料瓶壁的特性，在实验中用玻璃瓶 也能培养扩增。在原代培养物中，除了呈成纤维细胞样的MSCs外，还混杂着
一些其他细胞，可以根据这些污染细胞生物学特性将其除去。血清的浓度并
非越高越好，相反，高浓度血清由于含有大量促迚细胞分化的因子，已引起 细胞分化，从而使细胞过早出现老化，反而丌利于干细胞生长，一般以5%～
小鼠脐间带充质干细胞培养方法
小鼠脐间带充质干细胞培养方法引言充质干细胞（me se nc h ym al st em ce ll s，M SC s）是一类具有多向分化潜能的多能干细胞，具有广泛的应用前景。
在生物医学领域，小鼠脐间带充质干细胞是一种重要的来源之一。
本文将介绍小鼠脐间带充质干细胞的培养方法，帮助研究人员更好地利用这一珍贵的细胞资源。
原料与试剂准备1.小鼠脐带组织2.DM EM/F12培养基3.胎牛血清（F BS）4.细胞培养袋5.1×PB S缓冲液步骤1.小鼠脐带的处理（1）准备一个无菌操作台，并在工作区上喷洒酒精消毒剂，手套等工具也需要经过灭菌处理。
（2）取出小鼠脐带组织，置于无菌的1×P BS缓冲液中，用剪刀剪碎细胞片段。
（3）将小鼠脐带组织片段转移到细胞培养袋中。
（4）加入适量的DME M/F12培养基，保证组织片段被完全浸润。
（5）将细胞培养袋密封，并置于37°C恒温培养箱中，进行消化和悬浮培养，时间约为4-6小时。
2.细胞的收获和培养（1）将消化后的细胞悬液通过100μm的细胞滤网过滤，去除大颗粒残渣。
（2）将滤液离心，去除上清液，沉淀的细胞用DM EM/F12培养基洗涤。
（3）将洗涤后的细胞沉淀用适量的D MEM/F12培养基重新悬浮。
（4）将细胞悬液转移到细胞培养瓶中，每瓶加入适量的培养基和10%的F BS。
（5）将细胞培养瓶放置于37°C恒温培养箱中，进行培养。
（6）每2-3天更换一次培养基，保持细胞的健康生长。
3.细胞的传代与冻存（1）当细胞达到80-90%的密度时，将培养瓶内的细胞用1×P BS缓冲液洗涤。
（2）用胰酶对细胞进行消化，停止细胞的生长。
（3）加入适量的DME M/F12培养基，将细胞悬液转移到新的细胞培养瓶中。
（4）将细胞培养瓶放置于恒温培养箱中继续培养。
4.脐带间充质干细胞的鉴定（1）使用流式细胞仪对培养的小鼠脐带间充质干细胞进行免疫鉴定。
小鼠骨髓间充质干细胞对白血病细胞增殖的影响的开题报告
小鼠骨髓间充质干细胞对白血病细胞增殖的影响的开题报告一、研究背景和意义骨髓间充质干细胞 (Mesenchymal stem cells, MSCs) 是一种多能干细胞，具有成纤维细胞、滋养细胞和结缔组织细胞等多种形态和功能，可在体内分化成骨、软骨、脂肪等不同类型的细胞。
MSCs 可以通过其对免疫细胞的调节作用，对治疗癌症、自体免疫疾病、移植排斥反应等疾病具有潜在的临床应用价值。
白血病是一种由骨髓内异常增生的白细胞引起的恶性肿瘤性疾病。
白血病患者的骨髓内干细胞数量减少，不能有效地分化成正常的血细胞，而且白血病细胞可以通过调节骨髓间质细胞增殖、分化及其它细胞的生长、分化等机制来促进其增殖和传播。
因此，研究 MSCs 对白血病细胞增殖的影响，有助于探索其治疗白血病的作用机制，提高其临床应用价值。
二、研究目的本研究旨在探究小鼠骨髓间充质干细胞对白血病细胞增殖的影响，并初步探讨其作用机制。
三、研究内容和方法1. 实验材料和设备小鼠骨髓间充质干细胞系 (BMSCs)、小鼠白血病细胞系 (L1210)、无菌试剂、细胞培养物等2. 建立共培养体系将 BMSCs 和 L1210 细胞共培养，设对照组和干细胞处理组。
采用MTT 比色法、流式细胞术等方法，检测白血病细胞增殖情况和干细胞的调节作用。
3. 检测各类相关因子水平采用 ELISA 法检测培养上清液中白细胞介素-6、白细胞介素-8、转化生长因子β1、血小板衍生生长因子等因子的表达水平，初步探索干细胞作用机制。
四、实验预期结果和意义预期研究可以初步揭示 MSCs 对白血病细胞的调节作用和可能的作用机制，为 MSCs 的进一步临床应用提供基础实验研究支持，同时也可提高对白血病的认识，为白血病的治疗提供新的思路和方法。
小鼠间充质干细胞培养扩增后生物学特性研究(精)
小鼠间充质干细胞培养扩增后生物学特性研究作者：解琳娜, 王健民,邱慧颖, 高磊, 周虹, 龚胜兰【摘要】本研究目的是分离富集小鼠骨髓间充质干细胞（mMSC），鉴定其生物学特性和多向分化潜能。
取4-5周龄雄性C57BL/6小鼠骨髓细胞，采用全骨髓贴壁法和单克隆培养法分离、纯化和扩增mMSC；分析细胞免疫表型、生长曲线、细胞周期；进行多向分化潜能鉴定；传代培养达30代后，进行成瘤性检测。
结果表明：建立的小鼠间充质干细胞系在体外可连续传代培养达30代，细胞仍保持多向分化潜能，细胞高表达CD29、CD44、Sca??1、MHC?并瘢?中度表达CD13、CD90.2，不表达CD117、CD45、Flk??1、MHC?并蚶嗫乖?。
mMSC 体外能诱导分化成骨、脂肪、软骨细胞。
结论：全骨髓贴壁法和集落培养法富集可获得mMSC，其在体外连续传代30代以上仍能维持生物学特性稳定，具有高度的增殖和多向分化潜能，无成瘤性。
【关键词】间充质干细胞骨髓细胞培养生物学特性Enrichment and Biological Characteristicsof Murine Mesenchymal Stem Cells Abstract The study was aimed to isolate and establish mesenchymal stem cellline from adult murine bone marrow as well as to identify its biological characteristics and differentiation potential. Bone marrow cells (BMCs) were collected by flushing the femurs and tibias of4??5??week??old male C57BL/6 mice, and were inoculated at a concentration of 1×106/cm2. mMSCs were isolated, enriched and expanded by using bone marrow adherant culture and monoclonal culture. The characteristics of the cells, such as morphology, growth pattern, cell cycle, phenotype, karyotype and multipotent differentiation potential, cytogenetic stability and tumorigenesis were determined. The results indicated that the cell population consisted of spindle?? and star??shaped cells, they were highly positive for CD29, CD44, Sca??1, MHC?并?, moderate positive for CD13, CD90.2 and negative for CD117, CD45, Flk??1 and MHC?并?. mMSCs could be induced todifferentiate into adipocytes, osteoblast cells and chondrocytes. Itis concluded that mMSC can be isolted, expanded and enriched by using bone marrow adhcrent culture and monoclonal culture. No tumor formations are observed for 3 months in nude mice after subcutaneous injection. mMSCs retain their properties after at least 30 passages in culture as well as from frozen stocks. Keywords mesenchymal stem cell; bone marrow; cell culeure; biological characteristics J Exp Hematol 2007; 15(3):542-546 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）是来源于中胚层的一种成体干细胞，MSC易于富集和扩增，不涉及伦理学问题，已被越来越广泛地应用到组织工程中,是理想的种子细胞。
间充质干细胞的培养及鉴定
2、BMSCs的诱导分化 1)成脂诱导：将骨髓间充质干细胞以4×103/cm2的
接种密度培养在35 mm培养皿里，待细胞融合后 将含10% NCS的低糖DMEM生长培养液换为成脂肪 分化诱导液（高糖DMEM+10%血清+10 μg/ml胰岛 素+1 μM地塞米松+100 μM吲哚美辛+0.5 mM 3isobutyl-1-methylxanthine）培养，每隔3 d换诱导 液一次，持续诱导培养6 d。 然后用维持液（高糖 DMEM+10%胰岛素）继续培养细胞3 d。各组细胞 用PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，油红O 工作液浸染10 min，60%异丙醇洗去多余染液， PBS冲洗3次，苏木精复染3-5 min，PBS漂洗10 min。 镜下观察并摄影。
二、实验材料、试剂与器材
1 材料：100-150 g SD大鼠。
2 试剂：乙醚，75%酒精，L-DMEM 低糖培养基，胎牛血清， 小牛血清，Percoll细胞分离液，1.5M NaCl溶液，0.25% 胰 酶 ， FITC 标 记 的 羊 抗 鼠 CD29 抗 体 ， FITC 标 记 的 羊 抗 鼠 CD90抗体，FITC标记的羊抗鼠CD71抗体，PE标记的羊抗鼠 CD106抗体，FITC标记的羊抗CD45抗体，β-甘油磷酸钠， 地塞米松，维生素C，Hoechst33258，油红O，20 g/ L硝 酸钴溶液，20 g/L硫化铵，50%甘油，多聚赖氨酸（PLL）。
3 仪器：
细胞培养箱，微量移液器，倒置相差显微镜，细胞培养皿， 荧光显微镜，电子天平，pH计，离心机，超净工作台，电 热恒温鼓风干燥箱，电热恒温水槽，超声波清洗机，立式 压力蒸汽灭菌器。
三、实验原理
间充质干细胞最早发现于骨髓中，其具有高度增殖和自 我更新能力，但骨髓中MSCs的含量很低，约为0.01%。分离 间充质干细胞的方法主要有三种：①全骨髓贴壁培养法； ②密度梯度离心法；③根据间充质干细胞的表面标志，利 用流式细胞仪进行分选。在本实验中所用的是密度梯度离 心法，即利用Percoll将大部分造血细胞和单个核细胞分离、 经过体外贴壁培养换液去除悬浮生长的造血干细胞、分离 获得MSC的纯度达到90%左右。
(2007)小鼠骨髓间充质干细胞的分离与纯化培养的实验研究_仝识非
文章编号:1000-5404(2007)10-0907-04论著小鼠骨髓间充质干细胞的分离与纯化培养的实验研究仝识非1,宋治远1,姚青1,万瑛2,邹丽云2(第三军医大学:1西南医院心血管内科,重庆市介入心脏病学研究所,2基础医学部全军免疫学研究所,重庆400038)提要:目的探索小鼠骨髓间充质干细胞的体外纯化培养方法。
方法先采用直接贴壁法培养的小鼠股、胫骨髓细胞,再用免疫磁珠法分选第3代中的CD11b-细胞。
取分选纯化细胞进行形态学观察,并检测细胞在不同诱导条件下向成骨细胞及脂肪细胞的分化能力。
结果①原代及传代培养的小鼠骨髓贴壁细胞多呈梭形,部分呈不规则型,其中含有较多的CD11b+细胞;磁珠分离后的纯化细胞呈现纺锤型、星型及不规则型等多种形态,细胞质丰富,核仁明显,细胞平行排列或漩涡状生长;②成骨诱导3周后mM SC s分化为成骨细胞,茜素红S染色有橘红色磷酸盐胞外基质沉积;③随着成脂化诱导时间的延长,细胞逐渐增大,油红O染色可见胞质内大量橙红色脂肪空泡。
结论单纯的贴壁及传代培养不能纯化小鼠骨髓间充质干细胞,贴壁与免疫磁珠分离相结合才是一种有效的mM SCs体外分离和纯化方法。
关键词:间充质干细胞;小鼠;免疫磁珠;骨髓中图法分类号:R329-33;R329.24;R331.22文献标识码:ACulti vati on,retri eval and purification ofm ouseM SCsTONG Sh-i fei1,SONG Zh-i yuan1,YAO Q i n g1,WAN Y i n g2,ZOU L-i yun2(1D epa rt m en t o f Card i o l ogy,Sou t hwest H osp ital, 2Institute of I mm unology,Co ll ege o fM ed i c i ne,T h i rd M ilitary M edical U nivers it y,Chongqi ng400038,Ch i na)Abstract:Obj e c ti v e To develop ne w m ethods to cultivate,retrieve and purify m ouse m esenchy m a l ste m cells(mM SC s).M ethods Bone m arr ow w as co llected fro m2-m onth-o l d Kun m i n g m ice by flushing fe m urs and ti b iasw ith co m p l e te m ed i u m o fD M E M-LG.Ce lls w ere p lated i n a Petri d ish.A fter24hours,non-adherent cells w ere re m oved by t w o to t h ree w ashes w ith PBS,adherent ce lls w ere further cultured i n co m plete m ediu m and retrieved by trypsi n isati o n w it h0.25%trypsin fo r5m i n at37e.The treated adherent ce llsw ere cu ltiva-t ed w ith3@dil u ti o n for further generations.CD11b-nega ti v e ce lls w ere retri e ved fro m the collected adherent cells of3rd generati o n by usi n g i m m uno m agnetic m icrobeads,and continued to be cu ltured i n co mp lete m edi u m.A fter the cult u red ce lls w ere retrieved,their m orpho logy and their ab ility of osteob l a stic d ifferentiati o n and ad-ipocytic d ifferentiation w ere exa m i n ed.Results M ost of mM SCs fro m1st generation w ere o f shuttle shape, so m e of irregular shape.A fter treat m ent w it h m agnetic m icrobeads and severa l generati o ns,mM SCs w ere of spi n dle,star and irregular shape.These cells w ere of rich cy top las m a,clear nucleo l u s,and g re w i n parallel o r vortex.The cultured adherent cells fro m the first and subsequent generations had p lenty of CD11b-positi v e b loo-di n g-m ak i n g ce lls.A fter20-day osteob lastic i n duction,m M SCs d ifferenti a ted i n to bone cells,w hich sho w ed or-ange phosphate i n ex tracell u larm atrix by A lizari n red S sta i n i n g.mM SC s could d ifferen tiate i n to li p ocytes.The size of cells increased a l o ng w ith fa-t develop i n g i n ducti o n per i o d.These ce lls sho w ed m any orange fatty follicles w ith O Red O il dyeing.Conc l u si o n Pure m M SCs can not be retrieved by eit h er adheri n g m ethod or genera-ti o n cu ltivation m e t h od separately.The co m b i n ed m ethods o f adheri n g,i m m uno m agnetic m icrobeads,and seria l subcu lti v ation is effective i n vitro i n retrieve mM SCs.K ey w ords:m esenchy m a l ste m ce lls;m ouse;i m m uno m agnetic m icr obeads;m arro w基金项目:国家自然科学基金(30370585)Support ed by the Na ti o nalN at ur a l Sci ence Foundati on o f Chi na(30370585)作者简介:仝识非(1973-),男,河南省洛阳市人,博士,主治医师,主要从事心脏电生理的基础与临床方面的研究。
BMSCs成脂成骨分化实验总结
骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养以及成脂、成骨诱导分化一，C57小鼠BMSCs原代培养1，实验前准备好相关手术器械，培养器材及相关试剂PBS 平衡缓冲液、10％FBS，IMDM培养基。
2，脱颈法处死C57小鼠，在75％乙醇中浸泡5min，转移至超净工作台中，无菌条件下分离出小鼠的长骨(股骨和胫骨)，浸泡于PBS溶液中。
3，对股骨和胫骨进行深层次解剖，去除附着的肌肉组织，剪掉长骨两端的干骺端，用10％FBS，IMDM培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔发白，收集洗涤液，用移液枪轻轻吹散分离为单个细胞。
4，细胞接种于六孔板中培养，轻微摇匀，使细胞在孔中均匀分布，放置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养，培养期间不要移动六孔板，使BMSCs充分贴壁。
5，培养48h后换液，用预热的PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2次，添加新鲜培养基，之后每隔48h换液1次。
原代培养6-7d 后细胞铺满80％(图1)，可进行传代培养。
图1：BMSCs原代培养6-7d二，BMSCs成脂诱导分化BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成脂诱导培养基(IMDM中加入10%FBS，10μg/ml胰岛素，1μM 地塞米松，0.5mMIBMX，0.1mM吲哚美辛)。
3d换液1次，分化12d。
待脂滴形成后进行油红O染色，PBS缓冲液清洗3次，10％中性甲醛固定20min，再用PBS缓冲液清洗2次，油红O染液浸染30min，PBS缓冲液清洗2次，苏木素染液浸染1min，弃去染液，倒置显微镜下观察拍照。
成脂诱导分化过程中发现在诱导5d时，细胞形态开始变圆并大量脱落，部分细胞中出现细小脂滴(图2)。
图2：BMSCs成脂诱导5d三，BMSCs成骨诱导分化BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成骨诱导培养基(IMDM中加入10%FBS,5μg/ml胰岛素，0.1μM 地塞米松，0.2mM维生素C和10mMβ-甘油磷酸盐)。
骨髓间充质干细胞培养
骨髓间充质干细胞的原代分离及传代培养
❖ 10%水合氯醛麻醉大鼠，经颈椎脱臼处死，大鼠全身浸 泡于体积分数为75%乙醇消毒30 min，于超净台无菌 操作下取其双侧股骨与胫骨，PBS冲洗，剪去骨两端干骺 端，用10 mL注射器吸取LG-DMEM培养液反复冲洗骨 髓腔，收集经细胞筛过滤后的细胞悬液，以1 000 r/min离心5 min。弃上清，以 1×109 L-1的细胞浓度 接种于25 cm2塑料培养瓶，置于37℃、体积分数为 5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。24 h后全量换液， 2，5 d分别半量换液，7 d全量换液。待培养瓶中细胞分 裂增殖80%-90%汇合单层时用1.5 mL TrypsinEDTA解离细胞，当细胞充分离散时，加入5 mL的含血 清培养基终止消化，离心细胞悬液，1 000 r/min离心 5 min。弃上清，加入含体积分数为10%胎牛血清的 LG-DMEM培养基，将重悬的细胞悬液以1∶2比例进行 传代。
主要内容
1.前言 2. 实验方法 3. 结果 4. 结论
前言
❖
近来研究表明，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal
stem cells，BMSCs)不但具有来源广泛、易于获取、增殖迅速、可自体
移植、体外基因转染率高等特点，而且在不同诱导剂培养下可分别诱导分
化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞，神经细胞及肝细胞等已成为适合
骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定
❖ 取融合至90%左右生长状态良好第3代骨髓 间充质干细胞，胰蛋白酶消化、室温离心、细胞 计数，调整待测样本细胞数为1×109 L-1，分 装至各PE管中，依次加入单克隆抗体CD44、 CD29、CD90、CD45、CD34、CD11b，每 管设立同型阴性对照组(对照组中不加任何抗体)。 常温避光孵育40 min，PBS冲洗细胞，细胞重 悬，经流式细胞仪检测分析。
小鼠成纤维细胞原代培养
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养一.实验目的1．掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。
2．熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。
3．了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。
二.实验原理自17世纪下半叶Robert Hooke提出“细胞”概念直至20世纪中叶，细胞培养（Cell culture）才逐渐发展起来。
现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖，因此，细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分，而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。
细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。
如今，细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。
细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞，细胞培养分为原代培养和传代培养。
1．原代培养（primary culture）是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
原代培养是建立细胞系的第一步，其最基本的方法有两种：组织块培养法和消化培养法。
组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官，通过组织块直接长出单层细胞，该培养法是最常用的原代培养方法，其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行，培养的细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂的情况下，直接移植在培养瓶壁上，加入培养基立即进行培养的方法。
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一、立题依据
1、小鼠骨髓间充质干细胞原代培养的意义
有利于进行骨髓间充质干细胞的生物学特性的研究
为下一步的传代培养创造条件
可以直接应用于临床实践，是研究骨髓间充质干细胞作用 的前提
2、骨髓间充质干细胞原代培养的方法
贴壁培养筛选法 密度梯度离心法
3、骨髓间充质干细胞的应用前景
在适当的条件下，骨髓间充质干细胞可以分化为三个胚层来源的组织细胞 而进行细胞移植的治疗，在体外培养扩增后也可种植于生物材料上，回植 入机体修复组织损伤。 骨髓间充质干细胞在治疗组织器官退行性疾病、遗传缺陷性疾病和基因治 疗方面也展现了美好前景。
二、材料和方法
结果一
第1次换液后5～7 d可见由几十个到数百个细胞组成的集落，细胞形 梭态呈形、三角形或星形 （图1C、D）
结果一
原代细胞培养10 d左右，细 胞快速增殖，每个集落中的 细胞不断增殖呈长梭形放射 状排列（图1E）
培养2周左右，每个小集落形 成约数百致上千个细胞的大 集落，集落交界处出现重叠 、融合 （图1F)
Percoll密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细
胞
贴壁培养骨髓间充质干细胞
形态学观察
原代培养细胞
生长曲线的测定
三、结果
（一）骨髓间充质干细胞的形态学观察ห้องสมุดไป่ตู้
24 h后就见有细胞贴壁，多数细 胞呈圆形 （图1A）
72 h后首次半量换液去除未贴壁 细胞，此时贴壁的细胞为单个， 形态大部分为圆形 （图1B)
讨论
• 有时在相同的培养条件下，有极少数标本较难扩增骨髓MSCs，可能与冲洗骨 髓腔的操作有关。骨髓MSCs具有黏附贴塑料瓶壁的特性，在实验中用玻璃瓶 也能培养扩增。在原代培养物中，除了呈成纤维细胞样的MSCs外，还混杂着
一些其他细胞，可以根据这些污染细胞生物学特性将其除去。血清的浓度并
非越高越好，相反，高浓度血清由于含有大量促进细胞分化的因子，已引起 细胞分化，从而使细胞过早出现老化，反而不利于干细胞生长，一般以5%～
2、仪器
• 倒置显微镜尼康TE2000E（上海于欣仪器有限公司） • CO2恒温培养箱MC0-15A(日本三洋电机楳氏会公司)
• 超净工作台SW-CJ-2F（苏州安泰空气技术公司）
• 生物显微镜（舜宇公司）
• 低温高速离心机（Jouan公司)
• 无菌操作台，血球计数板，6孔培养板等
3、方法
骨髓的收集
图1.倒置显微镜下骨髓间充质干细胞原代培养形态观察 Fig.1 Morphology of BMSCs in primary culture under an inverted microscope (A)1d,×100;(B)3d,×100;(C)5d,×200;(D)7d,×200;(E)9d,×400;(F)13d,×400.
1、材料
成年小白鼠4只 胎牛血清（杭州四季清公司） L-DMEM (Hyclone赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司 ） 胰蛋白酶（Sigma公司） PBS（NaCl 8g,KCl 0.2g,NaHPO4·12H2O 2.88g,KH2PO4 0.2g,三蒸水1000ml) Percoll细胞分离液（Percoll原液：三蒸水:NaCl 2.6:1.9:0.5) 青霉素、链霉素（100U/ml青霉素，100µg/ml链霉素） 8%NaHCO3溶液（8gNaHCO3,100ml超纯水）
谢谢大家
10%胎牛血清最适合MSCs的生长。细胞接种密度过密，会引起细胞之间的接触
抑制；而过稀又会导致细胞分泌的因子不足从而影响细胞的生长。一般适宜 密度为（48）×104个/ml。
五 结论
本实验通过对成年小白鼠骨髓MSCs进行分离，体外培养， 同时从细胞形态和生物学特性进行观察和检测，认为采用淋 巴细胞分离液密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结 合，可以获得纯度较高和活性骨髓MSCs，具有操作简单， 快速，实用等优点，为一种较为有效的分离纯化骨髓 MSCs的方法。
结果二
（二）原代小鼠骨髓MSCs的生长曲线结果
BMSCs原代培养生长曲线（图2），生长曲线表明BMSCs的增殖能力 很强，所测细胞在开始的前4天里生长缓慢处于潜伏适应期，第5 天开始迅速增长进入对数生长期，到第9天细胞数轻度上升，第10 天达到顶点，生长速度减缓进入平台期。
四
讨论
• 分离骨髓MSCs的方法主要有四种：贴壁筛选法、密度梯度离心法、免疫磁 珠分离法、流式分选法等。我们使用密度梯度离心和贴壁筛选法相结合， 能有效地将红细胞、白细胞和间充质干细胞分离开来，同时操作简便，快 速，对细胞的活性影响较小。且此分离法简单经济，因而被广泛应用。 •据本实验培养细胞的经验，如果操作中吸取界面层细胞不小心，会混进非单 核细胞，就会大大降低细胞分离的纯度，使分离出的细胞大小不均。另外， 细胞分离操作时间延长，操作不轻柔，分离出的细胞纯度降低，都会降低细 胞的贴壁率和存活率。