小鼠骨髓间充质干细胞使用说明
小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。
MSC 具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。
虽然MSC临床应用广泛，但许多关键问题如免疫调控的具体机制等并未解决。
小鼠是重要的实验动物之一，广泛用于基础实验研究。
在体外成功分离培养MSC，并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能调控机制的前提。
目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。
然而全骨髓贴壁法获得的细胞往往含有不少造血细胞；骨片消化法需要进行胶原酶消化，步骤多且消化时问不好控制；流式或磁珠法虽然获得细胞较纯，但程序复杂，花费高且获得的细胞相对少。
骨髓MSC的分离目前常用的方法有全骨髓贴壁法、骨片消化法和流式细胞术或磁珠分选法。
全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
然而该方法获得的MSC往往含有较多基质细胞和造血细胞污染。
我们的结果也显示，全骨髓贴壁法原代培养的细胞有75％为CD45阳性的细胞，传至第3代，MSC中仍有5％的CD45阳性细胞，即造血细胞。
骨片消化法，是先将骨髓冲干净，将股骨和胫骨剪碎，然后进行胶原酶消化。
虽然该方法获的MSC纯度较高，但是程序复杂，且不同鼠龄骨片胶原酶消化时间不同，不容易掌握。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有研究者利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化旧191；虽然这些方法可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性；而且实验条件要求高，需要骨髓量大，加之耗费较大和技术难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
本研究采用骨髓加骨片法分离小鼠MSC，即将股骨和胫骨肌肉去干净后，不需冲骨髓，不需消。
小鼠骨髓基质干细胞的培养
1.2.5弃掉上述离心好的细胞液上清，加入5ml的α-MEM 培养基，加胎牛血清，，再加入12mlhank液，并用吸管反复吹打后再次离心1000转，5分钟
1.2.6弃上清，加样抢取0.1ml于小离心管中，再加入0.7ml（相当于7倍稀释）的Trypan染料，在相差显微镜下将盖玻片盖好在计数池上开始计数，剩余细胞悬液加入培养瓶中在适宜环境下进行接种培养
小鼠骨髓基质干细胞的培养
学号122010000178，2010级硕士同仁医院，严森
骨髓基质干细胞( marrow st romal stem cell,MSC)是一种来源于骨髓的成体干细胞, 本实验通 过小鼠骨髓基质干细胞的培养及对其进行体外细胞特性的研究。
目的: 取小鼠股骨骨髓进行骨髓基质干细胞的原代培养,通过相差显微镜、 光镜及扫描电镜观察, 了解骨髓基质干细胞的生长情况及其特点。练习血细胞计数器的使用方法 1 材料与方法
1.2.3取 1 月龄小白鼠 1只,雌雄不限,体重约20g, 断颈脱臼处死, 无菌条件下暴露股骨, 在培养皿中去除皮肤，附带的肌肉和骨膜,切断股骨,切断上肢，并将每一肢上下剪下两个小口便于冲洗，剥离四肢时用hanks 液进行冲洗,
1.2.3分次取12mlhanks液于10ml注射器中，分别灌洗四肢骨髓，一肢骨髓用去3ml，反复上下冲洗，用空的大离心管(20ml)收集冲洗液，并将冲洗液收集好后加盖离心，1000转，5分钟
可见细胞数目：四大个细胞总数/4*稀释倍数*104
2.结果：四个大格是50个细胞的，计算的结果：8.75×105/ml个，
3.注意事项：
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
间充质干细胞
间充质干细胞通过大动脉内皮细胞时表现稳定的粘合性，表面分布不均、分散性及跨迁移的特征即；趋化因子与切力效应作者：Giselle Chamberlain, Helen Smith, G. Ed Rainger, Jim Middleton 摘要间充质干细胞具有抗炎症，抑制免疫力的性质，或许在如动脉硬化这样的疾病治疗中发挥作用。
间充质干细胞能够进入炎症细胞，然而为了在临床上运用，人们需要阐明他们迁移机制。
本研究探究了鼠类间充质干细胞与其迁移到小鼠动脉内皮细胞的相互关系，以及趋化因子，剪切压力的效应。
通过生理流动条件实验研究鼠类间充质干细胞与MAEC 的相互作用，鼠类间充质干细胞在连续流动条件下没有表现出相互作用。
然而，当流动停止十分钟，再开始，鼠类间充质干细胞慢慢的附着在内皮细胞表面，延展成良好的微绒毛过程（丝足）。
然后他们以不同方向散布在伸展的丝足。
CXCL9显著提高了鼠类间充质干细胞的附着、表面非均匀分散及扩散的比例，剪切压力明显刺激了后两者。
间充质干细胞通过鼠类动脉内皮细胞过程中，CXCL9, CXCL16, CCL20 和CCL25 明显增强了跨内皮迁移。
小鼠间充质干细胞的跨迁移抑制受体CXCR3，CXCR6, CCR6 和CCR9. 本研究促进了对间充质干细胞内皮跨迁移，趋化因子、剪切压力的效应的了解，这与如动脉硬化的炎症息息相关。
介绍间充质干细胞分化成许多不同的细胞谱系的能力，如同他们抗炎及免疫方面的特征，都没有伦理上的争议；培养相对容易使得间充质干细胞在许多炎症与损伤的治疗中成为一种理想的干细胞来源[1]。
间充质干细胞能够在动脉硬化的抗炎治疗中发挥作用，有报道用培养的间充质干细胞治疗心肌梗塞[2–4]；同样，在像中风，脊椎损伤[5,6]、脑脊髓炎[7]、辐射损伤[8]、皮肤损伤[9]和移植物抗宿主疾病情况[10]，间充质干细胞发挥潜在作用。
虽然在治疗像非愈合骨折这样的特点疾病下[11]，间充质干细胞定向移动发挥作用，但是它也与间充质干细胞周身侵泡配合问题有关，如钙化与组织损伤[12]。
小鼠骨髓间充质干细胞培养
小鼠骨髓间充质干细胞培养目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
实验准备：1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。
2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器操作步骤1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5�2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。
以后每两天换液1次，并观察细胞形态。
待细胞长至80%-85%时传代（1传2）2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。
传代后细胞生长迅速。
采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。
原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。
本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。
一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。
2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。
3.胎牛血清：用于细胞培养。
4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。
5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。
6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。
二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。
2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。
离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。
3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。
4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。
5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。
2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。
传代后的细胞继续培养至所需细胞量。
3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。
4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。
四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。
2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。
3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。
间充质干细胞分离及培养方案
取小鼠（C57）两只，脱颈（大镊子卡住颈部）窒息而死，75%酒精在平皿中完全浸泡10分钟
无菌条件下脱皮，取出双侧股骨，胫骨，弘骨，除去肌肉和骨膜
用含1%双抗（青霉素+链霉素）的Hanks’液冲洗三次（无菌操作）
用剪刀剪去股骨，胫骨，弘骨的骨骺端，露出骨髓腔（无菌操作）
0.5毫升的重悬细胞液+4.5毫升4%的冰乙酸（对细胞液10倍稀释，分解红细胞），进行细胞计数，根据细胞数再确定稀释倍数
以1x107的浓度进行接种与培养瓶（塑料，带透气），37℃，5%CO2培养，48小时后换液，之后每两天换液一次
用不含双抗的M199培养基5毫升冲出骨髓，再吸取培养液继续冲洗，直至骨髓腔发白为止（无菌操作）
用纱布（两层纱布）在漏斗中进行细胞液的过滤，过滤到100毫小瓶子中（无菌操作）
将细胞液分到10毫升的离心管，1000转离心10分钟（无菌操作）
10毫升的M199培养基（不含双抗）对离心后的细胞进行重悬，吹打细胞时要轻（无菌操作）
分离小鼠骨髓间充质干细胞的方法
分离小鼠骨髓间充质干细胞的方法一、分离方法说明及图例A.Ⅰ.取新鲜抗凝血液或脐带血与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；Ⅱ.取新鲜抗凝骨髓，加入一份细胞洗涤液（Cat#：2010X1118），混匀后以400g（约1500转/分）离心5分钟，弃去上清。
沉淀与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；B.加入为步骤A中所得混合液1/2体积的全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）混匀20℃-30℃自然沉降20-30分钟，吸取上清备用；C.向步骤B中所得上清液中加入为其一倍以上体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）混匀，以500g（约1800转/分）离心15分钟（半径15cm水平转子），弃去上清保留沉淀细胞；D.向细胞沉淀中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）调整细胞浓度为2×108—1×109个/ml，小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2:1）；（本实验采用天津灏洋TBD生物实验室的分离液）E.以400g（约1500转/分）离心20分钟（半径15cm水平转子）；第三层；为透明分离液层。
第四层；为极少数红细胞层。
收集第二层细胞放入约为其5-10倍体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）中，充分混匀后以500g（约1800转/分）离心1 5分钟。
沉淀经反复洗涤2次既得所需干细胞。
F.为获得纯度更高的干细胞，在步骤E中离心完成后可吸取第二层干细胞层再与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混匀，20℃-30℃自然沉降20-30分钟，收集上清加入细胞洗涤液500g（约1800转/分）离心15分钟。
小鼠骨髓间充质干细胞原代培养
1、材料
成年小白鼠4只 胎牛血清（杭州四季清公司） L-DMEM (Hyclone赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司 ） 胰蛋白酶（Sigma公司） PBS（NaCl 8g,KCl 0.2g,NaHPO4·12H2O 2.88g,KH2PO4 0.2g,三蒸水1000ml) Percoll细胞分离液（Percoll原液：三蒸水:NaCl 2.6:1.9:0.5) 青霉素、链霉素（100U/ml青霉素，100µg/ml链霉素） 8%NaHCO3溶液（8gNaHCO3,100ml超纯水）
小鼠骨髓间充质干细胞的原代培 养
一、立题依据1、小鼠骨髓间质干细胞原代培养的意义 有利于迚行骨髓间充质干细胞的生物学特性的研究
为下一步的传代培养创造条件
可以直接应用于临床实践，是研究骨髓间充质干细胞作用 的前提
2、骨髓间充质干细胞原代培养的方法
贴壁培养筛选法 密度梯度离心法
结果一
第1次换液后5～7 d可见由几十个到数百个细胞组成的集落，细胞形 梭态呈形、三角形或星形 （图1C、D）
结果一
原代细胞培养10 d左右，细 胞快速增殖，每个集落中的 细胞不断增殖呈长梭形放射 状排列（图1E）
培养2周左右，每个小集落形 成约数百致上千个细胞的大 集落，集落交界处出现重叠 、融合 （图1F)
讨论
• 有时在相同的培养条件下，有极少数标本较难扩增骨髓MSCs，可能不冲洗骨 髓腔的操作有关。骨髓MSCs具有黏附贴塑料瓶壁的特性，在实验中用玻璃瓶 也能培养扩增。在原代培养物中，除了呈成纤维细胞样的MSCs外，还混杂着
一些其他细胞，可以根据这些污染细胞生物学特性将其除去。血清的浓度并
非越高越好，相反，高浓度血清由于含有大量促迚细胞分化的因子，已引起 细胞分化，从而使细胞过早出现老化，反而丌利于干细胞生长，一般以5%～
骨髓间充质干细胞干预对急性肾损伤鼠肾脏中细胞因子的影响
对模型 小鼠 肾损 伤微 环境 中细胞 因子水平的影响 ， 并探 讨其在 肾损 害修 复 中的作 用。方 法 ： 用 Ｐ ｒ Ｕ密度梯度 离心法分 采 ｅｃ ｏ
离出 Ｃ ７ Ｌ ６小鼠的骨髓 间充质干细胞（ ５Ｂ ／ ｍＭｓ ｓ。雄性 Ｃ ７ Ｌ ６小鼠 ４ Ｃ） ５Ｂ ／ ５只 ， 分为正常对照组 （５只） ＩＲ组 （５只 、 闭 １ 、／ １ 夹 双侧 肾蒂 ３ ｎ开放 ）ＩＲ＋ｍ Ｃ ０ｍｉ 、／ ＭＳ ｓ组（５只、 １ 夹闭双侧 肾蒂 ３ ｎ开放 的 同时尾静 脉注射 ｍＭｓ ｓ。于建模 后 １ｄ ２ｄ ０ｍｉ Ｃ） 、 、 ３ｄ ７ｄ １ 、 、４ｄ分别处死部 分小鼠（ 每次每组均处死 ３只） 留取动脉血及 肾组 织， ， 检测血尿 素氮（ Ｕ 及肌 酐（ｃ） Ｂ Ｎ） Ｓｒ水平 ， 制作
・
３０ ・ １
医结合 肾病杂志 ２ １ 年 ４ ００ 月第 ｌ 卷第 １
ｊ ｃ 预对 急性 肾损 伤 鼠 肾脏 中细胞 因子 的影 响
刘楠 梅① 田 军① 程 劲① 胡 大勇① 张金元① △
（ 摘 要 ］ 目的 ： 建立缺血再灌注（ ） 导的急性 肾损伤 小鼠模型 ， Ｉ 诱 探讨外 源性地给予骨髓间充质 干细胞 （ Ｃ ） ＭＳ ｓ干预
ｔｅ ｏ ｔ ｌ ｒｕ （ ５ ， ｅＩＲ ｇｏ ｐ １ ，ａ ｐｎ ｉｔｒ ｎｌ ｅ ｉｅ ｎ ｅ ｏ ｅｉ ｔｒ ０ｍｉ ｔ ） ｔｅＩ ＋ｍ ｈ ｎｒ ｏｐ １ ）ｔ ／ ｒｕ （５ ｃ ｉ ｂｌ ｅａ ｒ ａ ｐｄ ｌ ａｄｔ ｎｒ ｐｎｎ ａ ｅ ｎ ｅ ，ｈ ｃ ｏｇ ｈ ｌ ｇ ａ ｌ ｅ ｃｓ ｍ ｈ ｅ ｇ ｆ ３ ｕｓ
ＬＩ Ｎａ ｍｅ ， Ｉ Ｕ ｎ ｉ Ｔ ＡＮ ｄ ｎ， ｕ ＣＨＥＮＧ ｉ ｅ ｌ Ｊ ｎ，ｔａ
小鼠脐间带充质干细胞培养方法
小鼠脐间带充质干细胞培养方法引言充质干细胞（me se nc h ym al st em ce ll s，M SC s）是一类具有多向分化潜能的多能干细胞，具有广泛的应用前景。
在生物医学领域，小鼠脐间带充质干细胞是一种重要的来源之一。
本文将介绍小鼠脐间带充质干细胞的培养方法，帮助研究人员更好地利用这一珍贵的细胞资源。
原料与试剂准备1.小鼠脐带组织2.DM EM/F12培养基3.胎牛血清（F BS）4.细胞培养袋5.1×PB S缓冲液步骤1.小鼠脐带的处理（1）准备一个无菌操作台，并在工作区上喷洒酒精消毒剂，手套等工具也需要经过灭菌处理。
（2）取出小鼠脐带组织，置于无菌的1×P BS缓冲液中，用剪刀剪碎细胞片段。
（3）将小鼠脐带组织片段转移到细胞培养袋中。
（4）加入适量的DME M/F12培养基，保证组织片段被完全浸润。
（5）将细胞培养袋密封，并置于37°C恒温培养箱中，进行消化和悬浮培养，时间约为4-6小时。
2.细胞的收获和培养（1）将消化后的细胞悬液通过100μm的细胞滤网过滤，去除大颗粒残渣。
（2）将滤液离心，去除上清液，沉淀的细胞用DM EM/F12培养基洗涤。
（3）将洗涤后的细胞沉淀用适量的D MEM/F12培养基重新悬浮。
（4）将细胞悬液转移到细胞培养瓶中，每瓶加入适量的培养基和10%的F BS。
（5）将细胞培养瓶放置于37°C恒温培养箱中，进行培养。
（6）每2-3天更换一次培养基，保持细胞的健康生长。
3.细胞的传代与冻存（1）当细胞达到80-90%的密度时，将培养瓶内的细胞用1×P BS缓冲液洗涤。
（2）用胰酶对细胞进行消化，停止细胞的生长。
（3）加入适量的DME M/F12培养基，将细胞悬液转移到新的细胞培养瓶中。
（4）将细胞培养瓶放置于恒温培养箱中继续培养。
4.脐带间充质干细胞的鉴定（1）使用流式细胞仪对培养的小鼠脐带间充质干细胞进行免疫鉴定。
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
间充质干细胞的使用流程
间充质干细胞的使用流程引言间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种多能干细胞，在医学领域中具有广泛的应用前景。
随着对MSCs的研究的不断深入，科学家们逐渐掌握了MSCs的使用流程。
本文将详细介绍间充质干细胞的使用流程，以便读者对该流程有一个全面的了解。
正文1.样本采集和处理–从适当的供体中采集间充质干细胞的样本，例如骨髓、脐带血、脂肪组织等。
–样本采集后需要进行一系列的处理步骤，包括消毒、离心和去除红细胞等，以保证获得纯净的间充质干细胞。
2.细胞培养和扩增–将处理过的间充质干细胞放入培养皿中，并加入适当的培养基。
–培养皿需要放置在恒温恒湿的培养箱中，提供适宜的温度和湿度。
–定期更换培养基，以提供营养物质和确保细胞的健康生长。
–细胞培养通常需要数天到数周的时间，细胞数量会逐渐增加。
3.细胞鉴定和筛选–对培养的间充质干细胞进行鉴定和筛选，以保证其质量和纯度。
–常用的鉴定方法包括流式细胞术、免疫荧光染色等，可以检测细胞的表面标记物和特定的分子。
–筛选时需要排除可能含有附着细胞、坏死细胞或其他细胞类型的样品。
4.细胞存储和冻存–对于细胞的长期保存和备用，必须进行细胞存储和冻存。
–使用液氮罐等低温储存设备，将间充质干细胞冻存于液氮中，通常在-196摄氏度。
–冻存细胞需要特殊的冻存液和方法，以确保细胞的生存率和功能。
5.向患者输注间充质干细胞–在进行间充质干细胞的输注前，需要严格的安全筛查和评估。
–给予患者间充质干细胞通常采用静脉输注的方式，可以通过导管直接注入患者体内。
–输注后需要进行监测和观察，以确保患者的安全和疗效。
结论间充质干细胞的使用流程是一个复杂而严谨的过程，需要专业的实验室条件和设备。
通过对间充质干细胞的采集、培养、鉴定、存储和输注等环节的科学操作，可以为临床治疗提供有效的细胞资源。
然而，随着科学技术的不断发展，间充质干细胞的使用流程也在不断完善和改进，未来还有更多的创新和突破等待探索和发现。
小鼠密质骨间充质干细胞的分离、培养及鉴定
Ｙｕ ａ ｎ Ｙａ ｈ ｏ ｎ ｇ ，Ｚ ｈ ｏ ｕ Ｃｈ ｕ ｎ ｆ ａ ｎ ｇ ，Ｌｕ Ｚ ｈ ｉ ｙ ｏ ｎ ｇ ，Ｗ ａ ｎ ｇ Ｘｉ ａ ｏ ｌ ｉ ，Ｙａ ｎ ｇ Ｚ ｈ ｕ ｏ ｓ ｈ ｕ ｎ ，Ｌｉ Ｄｏ ｎ ｇ ｓ ｈ ｅ ｎ ｇ △
Ｃ ＨＩ ＮＥＳ Ｅ Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＡＮＡＴＯ ＭＹ Ｖｏ １ ． ３ ６ Ｎｏ ． ６ ２ ０ １ ３
解剖学杂志
２ ０细胞 的分 离 、 培 养及 鉴 定
袁雅 红 周春 芳 卢智 勇 王 小莉 杨 卓顺 李 东升 △
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ Ｏ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ：Ｔ ｏ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ａ ｎ ｅ ｆ ｆ ｉ ｃ ｉ ｅ ｎ ｔ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｆ ｏ ｒ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｏ ｆ ｍｅ ｓ ｅ ｎ ｃ ｈ ｙ ｍａ ｌ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ（ ＭＳ Ｃ ）ｆ ｒ ｏ ｍ ｍｏ ｕ ｓ ｅ
骨 中成 功分 离培养得到 ＭＳ Ｃ， 且 高效 易行 。
关键词 密质骨 ；间充质 干细胞 ； 小 鼠；细胞培养
Ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ，ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ａ ｎ ｄ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｍｅ ｓ ｅ ｎ ｃ ｈｙ ｍａ ｌ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ ｍｏ ｕ ｓ ｅ ｃ ｏ ｍｐ ａ ｃ ｔ ｂ ｏ ｎ ｅ
（ 湖北 医药学 院 ， １附属太和医院胚胎干细胞研究 湖北省重点实验室 ，２附属 十堰 市人 民医院消化 内科 ，十堰 ４ ４ ２ ０ ０ ０ ）
摘 要 目的 ： 建立一种易操作 的 、 高效 的小 鼠间充 质干 细胞 （ ｍＭＳ Ｃ） 的分离 培养方 法 ， 并 对其 表面标 志和多 向分化潜 能进 行鉴定 ， 为 ｍＭＳ Ｃ的获取提供了新的实验依据 。方法 ： 选取 ２ ～３周 龄 Ｃ ５ ７ Ｂ Ｌ ／ ６小 鼠， 取 出双侧股 骨 、 胫骨， 冲 出其 内骨髓
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小鼠骨髓间充质干细胞
小鼠骨髓间充质干细胞产品说明：
为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的小鼠骨髓间充质干细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
注意事项：
1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。
培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。
4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。
5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。
小鼠骨髓间充质干细胞产品简介：
产品名称：小鼠骨髓间充质干细胞
组织来源：正常小鼠骨髓
产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶
小鼠骨髓间充质干细胞简介：
小鼠骨髓基质系统内存在的骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stemcells，BM-MSCs）是一种除造血干细胞以外的、具有多向分化潜能的干细胞，可以向骨、软骨、肌组织、皮肤、脂肪、神经等多种组织分化，因此可以作为组织工程中的种子细胞。
本公司生产的小鼠骨髓间充质干细胞采用冲洗骨髓，密度梯度离心，骨髓基质细胞专一性选择培养筛选获得，经检验细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
小鼠骨髓间充质干细胞培养基信息： DMEM/F12、FBS、Penicillin、Streptomycin 等
小鼠骨髓间充质干细胞使用方法：
细胞培1. 取出25cm2 培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO
2
养箱中静置2-3小时，以稳定细胞状态。
2. 待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。
3. 细胞传代
1) 吸出25cm2培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；
2) 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1mL至培养瓶中，37℃温浴1~2min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；3) 用吸管轻轻吹打混匀，按1:2或1:3等适当的比例进行接种传代，然后补充
细胞培养箱中培养；
新鲜的完全培养基至5mL，放入37℃，5% CO
2
4) 待细胞完全贴壁后，培养观察。
之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。
小鼠骨髓间充质干细胞注意事项：
1. 培养基于4℃条件下可保存3-6个月。
2. 在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作。
3. 传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态。
4. 该细胞只可用于科研。
备注：由于实验所用试剂与操作环境的不同，以上方法供各实验室参考。
小鼠骨髓间充质干细胞其他相关小鼠原代细胞：
小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞
小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞
小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞
小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞
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小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
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小鼠肺动脉成纤维细胞小鼠成骨细胞
小鼠肺大静脉内皮细胞小鼠关节软骨细胞
小鼠气管和支气管上皮细胞小鼠胎儿表皮角质形成层细胞
小鼠胰岛细胞小鼠成年表皮角质形成层细胞
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小鼠肠微血管细胞小鼠骨髓间充质干细胞
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小鼠子宫内膜上皮细胞小鼠睾丸支持细胞
小鼠卵巢颗粒细胞小鼠心肌微血管内皮细胞小鼠子宫颈上皮细胞小鼠真皮微血管上皮细胞小鼠子宫平滑肌细胞小鼠胚胎成纤维细胞
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小鼠卵巢成纤维细胞小鼠骨髓来源内皮祖细胞小鼠肾实质细胞小鼠椎间盘髓核细胞
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小鼠膀胱平滑肌细胞小鼠肾成纤维细胞
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小鼠肾小管上皮细胞小鼠肾管状上皮细胞
小鼠肾小球内皮细胞小鼠心肌细胞
小鼠前列腺上皮细胞小鼠心肌成纤维细胞
小鼠肾上皮细胞小鼠主动脉内皮细胞
小鼠膀胱成纤维细胞小鼠主动脉平滑肌细胞
小鼠血管外膜成纤维细胞。