全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性(精)

全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特

性

[ 10-11-01 14:00:00 ] 编辑：studa20

作者：丰炳峰，董晨，关

凤军

【摘要】目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充

质干细胞(MSC) 的方法，研究MSC的生物学特性。方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSC，体外培养和连续传代, 在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化；利

用四唑盐比色（MTT）法测定MSC的生长曲线；流式细胞仪（FCM）鉴定MSC膜

抗原。结果原代分离的MSC在接种后48 h贴壁,细胞形态为椭圆形、多角形及短梭形,12天时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化。细胞传代后2天内处于潜伏期, 3天后进入生长期,7天后进入平台期。FCM 检测CD45、CD90阳性率分别为19.60%、95.38%。结论贴壁培养法能有效分离

纯化大鼠MSC,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSC的一般生

物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。

【关键词】间充质干细胞;骨髓;贴壁法分离培养

Abstract:Objective To establish a simple and effective method

of isolation, purification and cultivation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) in vitro, and explore their biological characteristics.Methods MSC were isolated and purified for culture

in vitro and serial passage by the attachment culture method. The morphological changes of the MSC were continuously observed under the inverted microscope. The cell growth curve was measured by MTT method, and membrane antigens were detected with flow cytometry

(FCM).Results The MSC in primary culture which were adhered to plastic surface within 48 h after displacement took the oval, asteroid, short and fusiform shapes. 12 days after culture in DMEM-

F12 medium containing 10% FBS, the cells reached 90% confluence in single layers, taking a long and fusiform shape. Further purification was achieved by expansion at serial passages. MSC were in latency for 2 days, converted into growth period on the 3rd day and entered the stationary phase on the 7 th day. FCM results indicated that the positive rate of CD45 and CD90 was 19.60% and 95.38%,

respectively.Conclusion The attachment culture method can be effectively used to isolate and purify rat MSC. The cultured MSC are stable in growth with active proliferation and share the general biological characteristics of MSC, which will further make them ideal seed cells for tissue engineering.

Key words: mesenchymal stem cells; bone marrow; attachment culture

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC) 是骨髓内除造血干细胞外另一种具有多向分化潜能的成体干细胞，在特定的条件下能分化为多种组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、肌腱、脂肪细胞、成纤维细胞及神经星状细胞等，且具有极强的自我修复能力。加之其具有获取简便、对供体损伤小、增殖力强、来源广泛、免疫原性弱［1］、自体移植不发生排斥反应［2］、不涉及伦理等特点，成为研究的热点。本实验通过分离培养、鉴定大鼠MSC，研究其生物学特性，从而为MSC的体外定向分化及作为种子细胞进一步应用于组织工程和再生医学提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM-F12培养基(Gibco公司),优级胎牛血清(杭州四季青有限公司) ，蛋白酶(Sigma公司),倒置显微镜(Nikon公司)，细胞培养箱(Sanyo 公司)。实验动物为雄性SD大鼠, 3周龄, 100～150 g, 清洁级(徐州医学院实验动物中心提供)。FITC 标记CD45、CD90抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 MSC的分离纯化及培养将大鼠脱臼处死后用碘伏浸泡5 min,无菌条件下分离出大鼠股骨和胫骨,离体的骨骼放入灭菌PBS缓冲液中冲洗。剪去干骺端, 暴露骨髓腔,无菌注射器抽取未添加肝素的含10% FBS、100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM-F12培养基反复冲洗骨髓腔,直至腔内所有骨髓血冲净。接种于含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基, 置于37℃、体积分数

5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱内培养。3天首次换液, 以后每3天换液1次, 7～14天细胞生长融合达80%以上,以0.25%胰蛋白酶消化后按1∶3 的比例传代培养。倒置显微镜下逐日观察细胞形态。

1.2.2 MSC生长曲线的测定原代培养细胞达80%以上融合后,D-Hank 液冲洗,胰酶消化传代,并标记为P1。取生长状态良好的第3代细胞,胰酶消化后,按1×107/L接种于96孔培养板中,每孔培养液为100 μl。每24 h取上述各代细胞各3孔,MTT比色法测各孔光密度值(D490值) ,连续测8天,以时间为横坐标、D490值为纵坐标绘制各代细胞的生长曲线。具体操作:测定前每孔加入MTT 溶液20 μl,37℃孵育4 h,尽量吸掉上清液, 每孔加入150 μl DMSO,室温振荡10 min,选择490 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔的D490值,求其平均值。以时间为横坐标、光密度(D)为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.3 MSC细胞表面分子鉴定取P3代生长良好的MSC,以0.25%胰酶消化细胞,按1×109/L重悬细胞, PBS洗涤1次，重悬细胞并分2管,分别加入100 μl CD45、CD90，避光孵育30 min。1000 r/min离心5 min沉淀细胞,倒去上清液，加500 μl PBS进行流式细胞术(FCM)分析。

2 结果

2.1 MSC的分离培养、扩增结果将分离的未离心的MSC悬液直接接种培养24 h后,发现培养瓶内有大量悬浮细胞,主要为圆形红细胞。72 h行首次半量换液后仍不易观察MSC的贴壁情况,将首次换液的吸出液在新培养瓶内加培养液继续培养,均经过2～3次换液后,漂浮的不贴壁细胞大部分随换液除去,可见较多的贴壁细胞, 散在生长,分布不均,少部分呈集落状或单个细胞存在,胞体呈长梭形,两端有长突起,胞质内颗粒较多,折光性差,核不清楚。贴壁细胞前1～2天生长缓慢,约3天后明显增殖,细胞形态更加清晰,核明显可见,并有1～2个核仁（图1A）。在第7天时,形成明显克隆，在10～14天时,血细胞随换液全部清除,贴壁细胞形态比较一致,已基本贴满培养孔板底部,呈漩涡状或辐射状排列,细胞变得扁平,胞体狭长,核呈椭圆形（图1B）,进行第1次传代培养。传3代后培养的MSC(图1C) 形态上更加趋于一致,为成纤维细胞样,无原代存有的圆形或类圆形细胞,增殖速度较原代细胞快,形态无明显变化,每隔3天换液1次,5～7天传代1次。部分细胞传代10次后, 就变得宽大扁平，增殖速度减慢。

图1 MSC的形态学特点（倒置相差显微镜,×100）（略）

A. 原代3天MSC贴壁生长;

B. 原代14天MSC长满瓶底90%以上;

C.第3代MSC

2.2 大鼠骨髓MSC生长规律 MSC传代7代以前增殖速度较快,传代细胞一般7天左右能达到80%以上融合。细胞传代后1～2天为滞留期,3天后达对数生长期,第6天进入平台期。MSC体外培养生长曲线见图2。

图2 MSC 体外培养生长曲线（略）

2.3 MSC细胞表面分子鉴定 P3代大鼠骨髓MSC培养6天，经FCM检测,CD45、CD90阳性率分别为19.60%、95.38%。