小鼠骨髓间充质干细胞培养
体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原的表达
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体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞 I
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小鼠骨髓基质干细胞的培养
小鼠骨髓基质干细胞的培养学号122010000178，2010级硕士同仁医院，严森骨髓基质干细胞( marrow st romal stem cell,MSC)是一种来源于骨髓的成体干细胞, 本实验通过小鼠骨髓基质干细胞的培养及对其进行体外细胞特性的研究。
目的: 取小鼠股骨骨髓进行骨髓基质干细胞的原代培养,通过相差显微镜、光镜及扫描电镜观察, 了解骨髓基质干细胞的生长情况及其特点。
练习血细胞计数器的使用方法1 材料与方法1．1 材料，小白鼠(实验动物部提供) , 培养瓶，α-MEM 培养基5ml, 20ml空离心管，hanks 液近50ml，胎牛血清（一小离心管）0.2ml ,，双抗（青霉素+庆大霉素）0.2ml，碳酸氢钠0.2ml,10ml注射器，无菌器械包括:镊子两把(无齿镊，有齿镊，组织剪大小两把)，吸管三只（有刻度两只）酒精棉若干，酒精灯1．2 基质干细胞的培养1.2.1操作者洗手戴鞋套在通风柜中保证无菌操作，点燃酒精灯，把三只试管纸套取下，从高压灭菌的套筒中取三只吸管于试管中，并妥善放在试管架上1..2.2取0.1ml单抗于hanks液中，剩余单抗倒入α-MEM培养基中，并吸取碳酸氢钠液一滴于hanks液中，使溶液呈碱性（红色）。
1.2.3取1 月龄小白鼠1只,雌雄不限,体重约20g, 断颈脱臼处死, 无菌条件下暴露股骨, 在培养皿中去除皮肤，附带的肌肉和骨膜,切断股骨,切断上肢，并将每一肢上下剪下两个小口便于冲洗，剥离四肢时用hanks 液进行冲洗,1.2.3分次取12mlhanks液于10ml注射器中，分别灌洗四肢骨髓，一肢骨髓用去3ml，反复上下冲洗，用空的大离心管(20ml)收集冲洗液，并将冲洗液收集好后加盖离心，1000转，5分钟1.2.4弃掉上述离心好的细胞液上清，再加入12mlhank液，并用吸管反复吹打后再次离心1000转，5分钟1.2.5弃掉上述离心好的细胞液上清，加入5ml的α-MEM 培养基，加胎牛血清，，再加入12mlhank液，并用吸管反复吹打后再次离心1000转，5分钟1.2.6弃上清，加样抢取0.1ml于小离心管中，再加入0.7ml（相当于7倍稀释）的Trypan 染料，在相差显微镜下将盖玻片盖好在计数池上开始计数，剩余细胞悬液加入培养瓶中在适宜环境下进行接种培养可见细胞数目：四大个细胞总数/4*稀释倍数*1042.结果：四个大格是50个细胞的，计算的结果：8.75×105/ml个，3.注意事项：3.1无菌操作下进行，如组织材料遗落在非无菌区则弃之，3.2不要让液体漫过计数池，并且让标本在格子架上流动，计数池液体要充分，不要让碎片或者气泡进入到细胞计数池中，在格子上的细胞不用记数在内，要数在小格中的细胞，3.3小鼠处死后要迅速制作股骨标本，皮下剪开时切勿伤及腹腔，及大血管，影响标本制作3.4吹打时不要产生气泡，。
小鼠骨髓基质干细胞的培养
1.2.5弃掉上述离心好的细胞液上清，加入5ml的α-MEM 培养基，加胎牛血清，，再加入12mlhank液，并用吸管反复吹打后再次离心1000转，5分钟
1.2.6弃上清，加样抢取0.1ml于小离心管中，再加入0.7ml（相当于7倍稀释）的Trypan染料，在相差显微镜下将盖玻片盖好在计数池上开始计数，剩余细胞悬液加入培养瓶中在适宜环境下进行接种培养
小鼠骨髓基质干细胞的培养
学号122010000178，2010级硕士同仁医院，严森
骨髓基质干细胞( marrow st romal stem cell,MSC)是一种来源于骨髓的成体干细胞, 本实验通 过小鼠骨髓基质干细胞的培养及对其进行体外细胞特性的研究。
目的: 取小鼠股骨骨髓进行骨髓基质干细胞的原代培养,通过相差显微镜、 光镜及扫描电镜观察, 了解骨髓基质干细胞的生长情况及其特点。练习血细胞计数器的使用方法 1 材料与方法
1.2.3取 1 月龄小白鼠 1只,雌雄不限,体重约20g, 断颈脱臼处死, 无菌条件下暴露股骨, 在培养皿中去除皮肤，附带的肌肉和骨膜,切断股骨,切断上肢，并将每一肢上下剪下两个小口便于冲洗，剥离四肢时用hanks 液进行冲洗,
1.2.3分次取12mlhanks液于10ml注射器中，分别灌洗四肢骨髓，一肢骨髓用去3ml，反复上下冲洗，用空的大离心管(20ml)收集冲洗液，并将冲洗液收集好后加盖离心，1000转，5分钟
可见细胞数目：四大个细胞总数/4*稀释倍数*104
2.结果：四个大格是50个细胞的，计算的结果：8.75×105/ml个，
3.注意事项：
小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养和鉴定方法学探讨
２ ０ １ ３年 ４月
第１ ７卷
第４
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文章编号 ： １ ０ ０ ７ —４ ２ ８ ７ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４ —０ ６ ４ ７ —０ ４ ．
小 鼠骨 髓 间充 质 干 细胞 的体 外 分 离 培 养 和 鉴 定方 法 学 探讨
无 菌条 件 下 分 离 处 死 后 取 小 鼠双 下 肢 骨 ， 低糖 Ｄ ＭＥ Ｍ 培 养 液 冲 出骨 髓 ， 离心 ５ ａｉ ｒ ｎ ｓ ， 用５ ｍｌ 含 １ Ｏ
胎 牛 血 清 的低 糖 ＤＭＥ Ｍ 培养液重悬 细胞。加入等体积密度为 １ ． ０ ７ ３ ｇ ／ Ｉ ｐ ｅ ｒ ｃ ｏ ｌ １ 分离液离心 ３ ０ ｍｉ ｎ ｓ 。取 中层 云雾 状 细 胞 。３ ７ ℃、 ５ Ｃ Ｏ 培 养箱 中 贴 壁 培 养 。取 ５ ～ １ Ｏ代 细 胞 培 养 至 对 数 生 长期 后 ， 洗 涤 离 心 。取 １ ０ ０ ｌ 细 胞 悬 液 分 别 加
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小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
小鼠骨髓间充质干细胞培养
小鼠骨髓间充质干细胞培养目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
实验准备：1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。
2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器操作步骤1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5�2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。
以后每两天换液1次，并观察细胞形态。
待细胞长至80%-85%时传代（1传2）2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。
传代后细胞生长迅速。
采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。
原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。
本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。
一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。
2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。
3.胎牛血清：用于细胞培养。
4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。
5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。
6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。
二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。
2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。
离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。
3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。
4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。
5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。
2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。
传代后的细胞继续培养至所需细胞量。
3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。
4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。
四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。
2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。
3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。
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小鼠骨髓间充质干细胞培养
目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
实验准备：
1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。
2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器
操作步骤
1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养
取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5�2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。
以后每两天换液1次，并观察细胞形态。
待细胞长至80%-85%时传代（1传2）
2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。
传代后细胞生长迅速。
采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。
因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。
分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs 获得或失去这些表面标记物的表达。