小鼠骨髓间充质干细胞的目前干细胞培养难点
发育生物学实验指南简要
实验一小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养一、目的要求1．掌握小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养方法。
2．了解小鼠骨髓间充质干细胞的鉴定方法。
3．了解小鼠骨髓间充质干细胞定向分化和鉴定方法。
二、材料与设备1．动物：SD大鼠。
2．主要试剂：胎牛血清（FBS），DMEM--LG培养基，PBS，抗体（NSE和GFAP）。
3．主要器材与仪器：手术剪，手术镊，眼科剪，眼科镊，培养瓶，培养皿，称量瓶，刻度离心管，吹打管，注射器，倒置相差显微镜，CO2培养箱三、实验步骤1．小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSC)的分离培养:⑴小鼠BMSC的分离和原代培养：①以颈髓离断法处死小鼠。
在无菌条件下取出小鼠股骨，除去骨表面附着的组织，用PBS 清洗干净。
②用剪刀去除股骨两端，暴露骨髓腔。
无菌条件下用5ml注射器抽取PBS约3-4ml将小鼠股骨内的骨髓冲出，收集骨髓冲洗液，将收获的全部骨髓用注射器反复抽吸，以打散组织成为细胞悬液。
③收集细胞悬液约7ml并将其转入15毫升离心管中，1500r/min离心5min，弃上清液及脂肪层。
④在细胞沉淀中加入5-6ml含10%胎牛血清的DMEM一LG培养基，倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2 培养箱中培养。
2. 带学生在电脑上观看以往的小鼠间充质干细胞免疫荧光图片。
实验二大鼠神经干细胞的分离培养一、目的要求1．掌握大鼠胚胎神经干细胞的分离培养方法。
2．了解大鼠胚胎神经干细胞的鉴定方法。
3．了解大鼠胚胎神经干细胞定向分化和鉴定方法。
二、材料与设备1．动物：孕龄约15天的Wistar或SD孕鼠2．试剂：条件培养基(DMEM/F12+20ng/mlbFGF+20ng/mlEGF+20μl/mlB27)，D-Hank’s液(NaCl 8g, KCL0.4g，Na2HPO4.12H2O 0.1g, KH2PO4 0.06g, NaHCO3 0.35g, 加水1000ml溶解，调PH 值为7.2－7.4，高压灭菌后，4℃储存备用)，0.25％胰蛋白酶（D-Hank’s液配制，过滤灭菌，-20℃储存），抗体(巢蛋白、NSE、GFAP)。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。
方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。
结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。
传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。
传至10代仍具有良好的增殖活性。
流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。
结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
小鼠再生肝浸出液体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样分化的研究
小鼠再生肝浸出液体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样分化的研究于俊兰;李荣;王文杰;李力;刘巨超;王金晶;徐迎新【期刊名称】《中国康复理论与实践》【年(卷),期】2006(012)012【摘要】目的应用小鼠再生肝浸出液体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样分化.方法利用2/3肝部分切除术后36 h小鼠再生肝组织浸出液定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞,在倒置显微镜下观察细胞形态,应用免疫荧光法鉴定细胞性质.结果骨髓间充质干细胞经小鼠再生肝浸出液诱导7 d后,呈肝细胞样圆形,1～2周后免疫荧光染色可见细胞表达肝细胞标记物CK8、CK18和清蛋白.结论小鼠再生肝浸出液可诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞方向分化.【总页数】3页(P1056-1057,封3)【作者】于俊兰;李荣;王文杰;李力;刘巨超;王金晶;徐迎新【作者单位】解放军总医院普通外科研究所,北京市,100853;解放军291医院,内蒙古包头市,014040;解放军总医院普通外科研究所,北京市,100853;清华大学材料系生物材料实验室,北京市,100084;解放军总医院普通外科研究所,北京市,100853;解放军总医院普通外科研究所,北京市,100853;解放军总医院普通外科研究所,北京市,100853;解放军总医院普通外科研究所,北京市,100853【正文语种】中文【中图分类】R329.2【相关文献】1.虫草多糖体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞样细胞 [J], 刘江凯;宋雅芳;刘友章;杨谕晨;张久梅;2.虫草多糖体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞样细胞☆ [J], 刘江凯;宋雅芳;刘友章;杨谕晨;张久梅3.川芎嗪体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究 [J], 刘云云;赵兴绪;赵红斌;葛宝丰;刘兴炎;陈克明4.体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞方向分化 [J], 胡晶;牟玲;罗恩杰5.小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的实验研究 [J], 朱小虎;陈霞平;阮绪芝因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
骨髓间充质干细胞的培养及生物学特性
Ｌ Ｕ ＪＡ ｉ ｔｌ Ｉ Ｉ ｑ ａ ｅ （ ｄ ｎ ｎ ｄｃｌ ｎ ｅｓｙ Ｍｕａｊ ｇＣ ｉａ Ｍｕ ａｊ ｇＭｅｉａ Ｕ ｉ ｒｉ ， ｄｎｉ ｈｎ ｉ ｖ ｔ ｎ １７ １ ） ５ ０ １
［ ｂｔ ｃ］ Ｏ ｊｃｖ ：ａｂｎ ｍ／ Ｗｍ ｓｎｈｍ ｌｔ ｌ （ Ｍ Ｃ ） ｅ ｏ ｔ ｄ ｕｕ ｄ ｎ ｒｅｔｉ ｅ ｉ ｔｔ ｏ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂｅｔｅＲ ｔ ｏｅ ｓＯ ｅ ｃｙ ａｓ ｍｃ ｌ Ｂ Ｓ ｓ ｗｒ ｉｌｅ ａ ｌｒ ｄｒｏｎ ｓｇ ｅｈ ｂ － ｉ Ｔ ｅ ｅ ｅｓ ｅｓ ａ ｄ ｎ ｃ ｔｅ ｉ ｏ ｖ ｔａ ｅ ｉ
ｌｇ ｃ ｈ ｒ ｃｅ ｉｔ ｓ ａ ｄ ｏ ｅ ｒ ｄ ｍｉａ ｔｔｒ ｅ ｅｌ ｆ ｒ ｔ ｓ ｅ ｅ ｇ ｎ ｅ ｉ ｇ ａ ｄ ｇ ｎ ｎ ｉｅ ｒ ｇ Ｍ ｅ ｈ ｄ ： ＭＳ ｓ ｗ ｒ ｕ ｔ ｒｄ ｏ ｉ ａ ｃ ａ ａ ｔｒ ｉ ｎ ｆ ｒ ｐ ｅ ｏ ｎ ａ ｇ ｔｃ ｌ ｏ ｉ ｕ ｎ ｉ ｅ ｒｎ ｎ ｅ ｅ ｅ ｇｎ ｅ ｉ ． ｌ ｓｃ ｎ ｓ ｓ ｎ ｔ ｏ ｓ Ｂ Ｃ ｅｅ ｃ ｌｕｅ
骨 髓 间充 质 干细胞 的培 养及 生ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 学特 性
刘嘉祺 林
（ 牡丹江 医学院
峰
李孟全
牡丹江 １７ １ ） ５ ０ １
黑龙江
【 摘 要】 目的： 分离、 培养大鼠骨髓间充质干细胞（ Ｍ Ｃ）探讨其生物学特性， Ｂ Ｓｓ， 为组织工程和基 因工程提供优势靶细胞。
方法 ： 骨髓 细胞贴壁 法进行 Ｂ Ｓ ｓ 全 Ｍ Ｃ 的原代培养 ， 倒置相差显微镜 观察 细胞 形 态， 流式 细胞 仪检 测 Ｂ Ｓｓ 面抗原 ， Ｔ 法 ＭＣ表 Ｍ ｒ 检测 Ｂ Ｓｓ 殖能力， ＭＣ增 并绘制生长 曲线。结果 ： 原代培养 ２ｈ ４ 后看见 少量贴壁细胞 ， 为小圆形 ，ｄ 可见梭 形类似 成纤维 初起 ３后 细胞 ， 涡样 生长， ３— 代细胞均一性 良好 ， 代 以后 细胞逐渐有 宽大梭形样 变， 呈漩 传 ６ ｌ ０ 增殖减慢 ， 偶有 细胞漂 浮、 亡。流 式 死 细胞仪检测传 ３ 代细胞 Ｃ ２ 表达率为 ９％ ，Ｄ４几乎无表达 。生长曲线显示 ， ３６ Ｂ Ｓ ｓ Ｄ９ ２ Ｃ３ 传 、 代 Ｍ Ｃ 有较 强的增殖 能力， 中传 其 ６代细胞更为明显 ， １ 传 ０代细胞的增殖能力较 前有所减弱。 结论 ： 成功从 大鼠骨髓组织分离、 培养 Ｂ Ｓｓ纯度 高， Ｍ Ｃ， 生物学特性 符合正常干细胞生长规律 ， 组织工程和基 因工程理 想的靶 细胞 。 是
小鼠骨髓间充质干细胞使用说明
小鼠骨髓间充质干细胞小鼠骨髓间充质干细胞产品说明：为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的小鼠骨髓间充质干细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。
培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。
4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。
5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。
小鼠骨髓间充质干细胞产品简介：产品名称：小鼠骨髓间充质干细胞组织来源：正常小鼠骨髓产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶小鼠骨髓间充质干细胞简介：小鼠骨髓基质系统内存在的骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stemcells，BM-MSCs）是一种除造血干细胞以外的、具有多向分化潜能的干细胞，可以向骨、软骨、肌组织、皮肤、脂肪、神经等多种组织分化，因此可以作为组织工程中的种子细胞。
本公司生产的小鼠骨髓间充质干细胞采用冲洗骨髓，密度梯度离心，骨髓基质细胞专一性选择培养筛选获得，经检验细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
分离小鼠骨髓间充质干细胞的方法
分离小鼠骨髓间充质干细胞的方法一、分离方法说明及图例A.Ⅰ.取新鲜抗凝血液或脐带血与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；Ⅱ.取新鲜抗凝骨髓，加入一份细胞洗涤液（Cat#：2010X1118），混匀后以400g（约1500转/分）离心5分钟，弃去上清。
沉淀与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；B.加入为步骤A中所得混合液1/2体积的全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）混匀20℃-30℃自然沉降20-30分钟，吸取上清备用；C.向步骤B中所得上清液中加入为其一倍以上体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）混匀，以500g（约1800转/分）离心15分钟（半径15cm水平转子），弃去上清保留沉淀细胞；D.向细胞沉淀中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）调整细胞浓度为2×108—1×109个/ml，小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2:1）；（本实验采用天津灏洋TBD生物实验室的分离液）E.以400g（约1500转/分）离心20分钟（半径15cm水平转子）；第三层；为透明分离液层。
第四层；为极少数红细胞层。
收集第二层细胞放入约为其5-10倍体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）中，充分混匀后以500g（约1800转/分）离心1 5分钟。
沉淀经反复洗涤2次既得所需干细胞。
F.为获得纯度更高的干细胞，在步骤E中离心完成后可吸取第二层干细胞层再与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混匀，20℃-30℃自然沉降20-30分钟，收集上清加入细胞洗涤液500g（约1800转/分）离心15分钟。
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干细胞培养基的选择
研究背景：
小鼠骨髓间充质干细胞的目前干细胞培养难点。
小鼠的骨髓基质细胞成分复杂，间充质干细胞比率低，分离培养有一定的难度。
广东医学院的博士研究生陈博士在培养过程中就遇到该问题。
他曾成功饲养成人和大鼠骨髓间充质干细胞。
但新近培养的小鼠间充质干细胞状态就很差。
按照自己的分析：细胞培养操作没有问题，培养条件也不错，试剂来源可靠。
问题应该出现在培养基配方上。
陈博士以原来的骨髓间充质干细胞培养基为基础，按照导师的提点，修改了配方，但细胞不好不坏。
为此他做了两次正交，结果缺总不理想，细胞状态并不稳定。
陈博士为此焦头烂额，担心下一步的实验无法进行。
经朋友介绍找到百恩维公司的技术支持。
解决方案：
百恩维的干细胞技术专家了解了陈博士的情况，培养技术、取材和试剂来源等，觉得不存在大问题；问题主要的原因是培养基的成分配比。
建议陈博士重新配制培养基或使用现成的完全培养基。
陈博士为了加快实验进度，直接选用了百恩维小鼠骨髓间充质干细胞培养基。
选用产品：小鼠间充质干细胞培养基（Catalog No.BW110014）
实施步骤：
1、使用百恩维的小鼠间充质干细胞培养基，进行原代的取材；
2、同样时间下，百恩维的培养基的MSC细胞状态明显优于自己配置的培养液；
3、经过传代，细胞的状态和增殖能力都很好；
4、成功获得了足够进行下一步实验所需的mouse MSC。
结果分析：细胞状态良好，成梭状、紧密分布，大小较均匀。
目前已经传至20代。
对于这次走的弯路，陈博士感慨良多。
要高效的完成课题实验，就需要转变观念，合理利用和整合现有的各个优势资源，快速达到实验目标。
案例分析：目前成功的间充质干细胞培养液主要包含DMEM+FBS+谷氨酰胺+双抗。
其中FBS的品牌和批次对细胞都会有不同的影响；无菌技术不成熟的新手，或者无菌条件不完善的实验室，最好使用双抗。
最后，各成分的配比也有较大影响：大部分间充质干细胞适用低糖，加约10%的FBS等等，对不以寻找配方为目的的干细胞研究人员，我们建议直接使用经过不断优化和严格质量检测的百恩维干细胞培养基，提高科研效率。