小鼠骨髓细胞微核试验讲解学习
实验五小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞的采集与处理
小鼠麻醉
将小鼠麻醉，并固定在 操作台上。
暴露骨髓
用消毒手术刀切开小鼠 的腿骨，暴露骨髓腔。
采集骨髓细胞
用注射器吸取生理盐水， 冲洗骨髓腔，收集骨髓
细胞。
细胞处理
将采集的骨髓细胞进行 洗涤、离心、分离等处 理，得到所需的细胞样
本。
骨髓细胞的培养与观察
细胞培养
将处理后的骨髓细胞接种在细胞 培养皿中，加入适量的细胞培养 基，在适宜的温度和湿度条件下 进行培养。
率之间存在正相关关系。
本实验为进一步研究致突变物的 致突变作用提供了有力证据，有 助于深入了解致突变物的致癌机
制。
对实验结果的理解与讨论
本实验结果表明，致突变物能够诱导小 鼠骨髓细胞微核的形成，这可能是致突 变物导致基因突变和细胞恶性转化的重 要机制之一。
实验结果还提示，致突变物的致突变作用可 能与其在体内的代谢活化有关，因此需要进 一步研究致突变物的代谢活化过程及其与微 核形成之间的关系。
实验五小鼠骨髓细胞 微核试验
目录
CONTENTS
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果分析 • 结论与讨论
01 实验目的
了解微核试验的原理
微核试验是一种用于检测染色体畸变和DNA损伤的细胞遗传 学方法。它通过观察细胞中微核（微小的细胞核）的数量， 来评估细胞受到的遗传损伤程度。
染色体结构畸变
分析实验组和对照组的染色体结构畸变类型，如断裂、倒位、重 复等。
染色体数目畸变
观察染色体数目畸变情况，包括非整倍体、多倍体等。
畸变类型与实验条件关系
探讨不同实验条件下染色体畸变类型的差异及其与实验条件的关系。
实验结果与预期结果的比较
小鼠骨髓细胞微核试验
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4.3 固定
将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇 溶液固定15分钟，取出，晾干。不能及时 染色的涂片也应固定好保存。
4.4 染色
将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的 Giemsa (Giemsa储备液1份+pH6.8的磷酸盐 缓冲液9份) 染色10~15分钟，冲洗，晾干。
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MN NCE
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红细胞
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电镜
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单个微核
多个微核
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Hale Waihona Puke 16医学ppt17
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3 器材与试剂
3.1 器材 解剖器械，生物显微镜，载玻片 等。
3.2 试剂 甲醇（分析纯）、甘油（分析 纯）、小牛血清、生理盐水、Giemsa 储备 液、 pH 6.8磷酸盐缓冲液
3.3 阳性对照物 环磷酰胺
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4 操作步骤
4.1 试验动物及处理
动物选择 小鼠是微核试验的常规动物，通常用7～12
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4.5 观察计数
低倍镜下观察，选择细胞完整、分散均匀， 着色适当的区域，再在油镜下观察计数。
多染红细胞（PCE）呈灰蓝色，正染红细胞 （NCE）呈橘黄色。典型的微核多为单个、 圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致， 呈紫红色或蓝紫色 。
计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计 数200个细胞中PCE与NCE的比值。
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化学致突变物
染色体
作用于纺锤丝
无着丝点,片或环
整条染色体 带着丝粒的环和断片
形成微核
小鼠骨髓中嗜多染红细胞(PCE)微核实验简介
小鼠骨髓中嗜多染红细胞（PCE）微核实验简介微核（micronucleus），与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质中，比主核小，故称微核。
故微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
实验目的1.学习和掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核测定方法2.了解细胞染色体损伤情况，掌握检测断裂剂和部分非整倍体致突变剂的测定方法3.进一步熟练制片和镜检操作器材与试剂1.器材手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、载玻片、玻璃染色缸、定时钟、晾片架、显微镜（带油镜）、注射器及针头、干净纱布、乳头吸管、玻璃铅笔、电吹风机2.试剂甲醇、Giemsa储备液、磷酸盐缓冲液（PH6.8）环磷酰胺操作步骤1.试验动物及处理（1）动物选择：一般选用大小鼠，小鼠最常用，18-20g，每组10只，雌雄各半。
（2）染毒途径：根据研究目的或受试物性质不同，原则上可尽量采用人类接触受试物的途径：通常采用灌胃法和腹腔注射。
（3）染毒次数：多次染毒法（每天染毒一次，连续4天，第五天取样）或两次染毒法（处死前30h+处死前6h）（4）剂量及对照选择据受试物的LD50，以1/2LD50为最高剂量组，下设3-4个剂量组。
同时设立阳性（环磷酰胺）和阴性对照（溶剂组）2.骨髓细胞制片和涂片：最后一次染毒后，在确定时间脱颈椎处死动物，迅速剪取其胸骨，剔去肌肉，用干净纱布擦拭，剪去每节骨骺端，用小型弯止血钳挤出骨髓液，点在载玻片一端预先滴好的一滴小牛血清中。
混匀后推片。
长度为2-3cm。
3.固定：将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇固定15min,取出晾干。
4.染色：Giemsa应用液染色15min.冲洗染色液，晾干。
5.观察计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分布均匀、疏密适度、形态完整、染色良好的区域，再在油镜下按一定顺序进行PCE和微核计数。
兽药小鼠骨髓细胞微核试验指导原则
为了确保小鼠骨髓细胞微核试验结果的真实性、可靠性和可追溯性，根据新 兽药研究的规律，结合国内兽药毒理学评价的实际情况制定了本指导原则。
（二）适用范围
本指导原则适用于兽用化学药品、中兽药、消毒剂及饲料药物添加剂的哺乳 动物体细胞遗传毒性检测。
二、试验设计
（一）材料与方法
1.实验动物 SPF小鼠，7～12周龄，体重25～30g，100只左右，雌、雄各半。 2.试剂 （1）致突变阳性对照物 环磷酰胺，分析纯以上，含量不低于98.5%。
（2）其他试剂 甲醇：分析纯； 甘油：分析纯； 磷酸二氢钾：分析纯； 磷酸氢二钠：分析纯； 姬姆萨（Giemsa）染料：分析纯； 小牛血清：分析纯。 过滤除菌后放入56℃恒温水浴中保温1h进行灭活。储存于4℃冰箱或冰盒里 备用。 （3）Giemsa 贮备液配制 称取Giemsa染料3.80g于研钵中，加入375 mL甲醇（分析纯）一起研磨，待 完全溶解后再加入125 mL甘油。移入试剂瓶内，置37℃恒温箱保温48h，其间振 摇数次, 两周后过滤可用。 （4）1/15mo1/L 磷酸盐缓冲液（pH6.8）配制 分别称取磷酸二氢钾（KH2PO4）9.08g和磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O） 23.88g，加蒸馏水980mL溶解，用酸度计调整pH至6.8，转入1000mL容量瓶，用 蒸馏水定容至1000mL。 （5）Giemsa 工作液配制 取1份Giemsa贮备液与6份1/15mo1/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）混合即成，临用 时配制。 3.仪器设备 （1）台式离心机 （2）生物显微镜（带 100×油镜头） （3）恒温水浴（温控误差士 0.5℃） （4）细胞计数器 （5）解剖器械、载玻片、注射器、灌胃针头等实验室常用仪器设备
实验三小鼠骨髓细胞微核试验
实验三小鼠骨髓细胞微核试验实验三：小鼠骨髓细胞微核试验一、实验目的本实验旨在通过观察小鼠骨髓细胞微核率的变化，了解并评估骨髓细胞受到的损伤程度，为进一步研究生物样品中的毒性物质及其潜在危害提供依据。
二、实验原理微核试验是一种检测染色体畸变的快速、敏感的方法，常用于评价各种因素对机体的遗传毒性。
微核是由染色体的片段或整个染色体在细胞分裂后期或末期未能进入子代细胞核而形成的，因此微核率的高低可反映细胞染色体受损的程度。
骨髓细胞微核试验常用于检测体内外接触毒物的程度及检测药物的遗传毒性。
三、实验步骤1.选取健康的成年小鼠，进行试验前处理，包括脱毛、称重等。
2.对小鼠进行腹腔注射或口服给予不同剂量的待测毒物。
3.分别于24小时、48小时和72小时三个时间段采集小鼠骨髓细胞，制备骨髓细胞涂片。
4.对涂片进行染色处理，以便观察和计数。
5.在显微镜下观察每个涂片，记录微核数并计算微核率。
6.统计分析数据，对比不同剂量组与对照组的微核率差异。
7.根据实验结果，评估待测毒物的遗传毒性及对骨髓细胞的损伤程度。
四、实验结果与数据分析经过对小鼠骨髓细胞微核率的观察和计数，我们得到了不同剂量组与对照组的微核率数据。
通过对比分析，我们发现随着待测毒物剂量的增加，小鼠骨髓细胞的微核率也逐渐升高。
这表明待测毒物具有明显的遗传毒性，能够导致骨髓细胞的损伤。
为了更直观地展示实验结果，我们可以使用柱状图或折线图来表示不同剂量组与对照组之间的微核率差异。
通过观察图表，可以清楚地看到随着毒物剂量的增加，微核率也逐渐升高。
这进一步证实了待测毒物的遗传毒性和对骨髓细胞的损伤作用。
五、实验结论通过本实验，我们得出以下结论：1.待测毒物具有明显的遗传毒性，能够导致小鼠骨髓细胞的损伤。
2.随着待测毒物剂量的增加，小鼠骨髓细胞的微核率也逐渐升高。
3.实验结果提示，待测毒物可能对机体产生一定的危害作用，需要进一步研究其对人体健康的潜在影响。
4.微核试验作为一种快速、敏感的检测方法，可用于评估生物样品中的毒性物质及其潜在危害。
小鼠骨髓微核试验
小鼠骨髓细胞微核试验一、目的与要求1. 熟悉微核的概念、微核的来源、体内微核试验的实验设计、微核试验检测的遗传学终点。
2. 学习和掌握小鼠骨髓细胞微核试验基本方法步骤，嗜多染红细胞及微核细胞镜下观察。
3. 了解微核试验数据整理、分析方法及结果的评价。
二、实验原理微核与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。
无论是断片还是整条染色体，其实质都是遗传物质，一但发生畸变，就有能形成遗传物质方面的问题，造成突变，因此，微核的检测实质上就是遗传物质突变的检测，现已被卫生部定为外来化合物毒理检测的—个必检指标。
微核试验是观察受试物能否产生微核的试验。
主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。
传统的微核试验是体内试验，它观察骨髓嗜多染红细胞（PCE）中的微核。
微核可位于多种细胞，但在有核细胞中难与正常核的分叶及核突出物区分，所以只有在无核的红细胞中才易辨认。
在骨髓中无核的红细胞有嗜多染红细胞或称晚幼红细胞（呈灰蓝或浅蓝色）和成熟红细胞（呈粉红或桔红色）两种，正常情况下嗜多染红细胞占多数，所以观察骨髓嗜多染红细胞。
PCE指在红细胞成熟之前，最后一次分离后数小时将主核排出而微核仍保留在细胞质中的细胞，但由于嗜多染红细胞的胞质内含有核糖体，因此Giemsa染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡橘红色，使嗜多染红细胞在染色上与正常RBC（NCE）有所不同。
微核可以由染色体诱裂剂导致的染色体无着丝粒片段所构成，也可以由非整倍体诱发剂所导致的落后染色体形成。
三、实验设计1. 动物选择：常用小鼠，体重18~20 g，7~12周龄，每组10只，雌雄各半。
2. 染毒途径：原则上与人接触化学毒物相同或相近的途径。
3. 染毒次数及取样时间：一般采用两次染毒或多次染毒。
两次染毒：第1次染毒后24小时进行第2次染毒，6小时后取样；多次染毒：每天染毒1次，连续染毒5天，末次染毒后24小时取样。
3.小鼠骨髓细胞微核试验
Giemsa染色时网织红细胞呈蓝灰色，称为多染红细胞；而成熟红细 胞染色呈橘红色，称为正染红细胞。
三.实验步骤 1.染毒：昆明种小鼠，环磷酰胺100mg/kg腹腔注射。 2.骨髓液制备和涂片：颈椎脱臼处死动物。解剖后取胸骨或股骨， 去除肌肉，剪去骨骺，将骨髓挤出或冲洗出，滴于载玻片推片。 3.固定：晾干后甲醇固定15秒，取出晾干。 4.染色：晾干后以新鲜配制的Giemsa染液染色5-10分钟，自来水冲 洗，晾干。 5.观察计数：低倍镜选择分布均匀、染色较好的区域，油镜下观察 计数。含有微核的PCE/1000个PCE；PCE/NCE。
实验三 小鼠骨髓多染红细胞微核试验
重庆医科大学实验教学管理中心 公共卫生实验原理 3.掌握镜下辨认微核的技术
二.实验原理： 细胞分裂过程中在染色体断裂剂或纺锤体毒物作用下，细胞染色体 断裂产生不含着丝粒的断片，或者整条染色体遗失在细胞质中，形 成微核。 染色与主核一致，大小相当于细胞直径的1/20-1/5，圆形或椭圆 形，一个或多个。 在多种细胞中出现。 在红细胞成熟前组后一次分裂后数小时主核排除而微核保留。
红细胞发育过程： 骨髓多能干细胞→定向干细胞→原红细胞→早幼红细胞→中幼红细 胞→晚幼红细胞→网织红细胞→成熟红细胞 从原红细胞到晚幼红细胞需分裂3-4次。形成晚幼红细胞后即不再 分裂，在发育过程中主核排出形成网织红细胞。网织红细胞含有少 量RNA，甲酚蓝染色成蓝色丝网状。网织红细胞进一步发育，RNA消 失成为成熟红细胞。
四.结果分析与评价 1.PCE/NCE比值约为1（0.6-1.2）。比值小于0.1表明PCE生成严重 受抑制，染毒剂量过大。 2.用统计方法分析结果。 五.实验成功的关键 1.制作良好的骨髓涂片 2.优质的染色
微核试验讲义
(3)染毒次数及取样时间：研究证实化学毒物需在靶器官内蓄积至一定的浓度才具有致突变作用。不同化学毒物诱发微核出现的高蜂时间也不尽相同。波动范围可以达到24～72h。这就要求在接触化学毒物后设立不同的采样时间点。考虑到以上两方面的原因，建议采用多次染毒的方法。其中以4次染毒比较方便合理。即每天染毒一次，连续4天，第5天取样。这样，取样一次就能覆盖24～72h高峰，如果高峰延迟到96h也不会漏掉。
石河子大学教案续页（内容与进程）
阳性及阴性对照组按上述方法同时进行处理。
3.固定的涂片也应固定后保存。
4.染色将固定晾干后的涂片、用新鲜配制的Giemsa应用液（Giemsa储备液1份加PH6.8的磷酸盐缓冲液9份）染色10～15min，然后冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。
2.试剂
甲醇(分析纯)、甘油(分析纯)、小牛血清、生理盐水、Giemsa储备液(取Giemsa染料1g，甘油66m1，甲醇60m1。先将染料置于研钵内，加入少量甘油混合研细，再分次倾人剩余的甘油继续研磨，然后转移至烧杯内，盖上玻璃表面皿，置，60℃水浴2h，取出待冷却后加入甲醇，混合静置2周后，过滤于棕色瓶内，存放阴凉处。该储备液存放的时间越长，染色效果越好。临用时用pH6.8的磷酸盐缓冲液配制为10％的应用液)、pH 6.8的磷酸盐缓冲液。
石河子大学教案续页（内容与进程）
实验四、小鼠骨髓细胞微核试验
(一)目的
通过本次实验，学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞(PCE)微核测定方法。
（二）原理
微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，大小相当于细胞直径的1／20—1／5，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞微核试验是一种用于检测物质对小鼠骨髓细胞基因毒性的方法。
骨髓细
胞微核是正常细胞中小核细胞数量的标志。
在受到某些化学物质的影响后，骨髓细胞可以
形成异常小鼠骨髓微核和形态不规则的细胞，这是指指出该物质可能是致癌物或基因毒物，因此，这种试验可以用于评估某种物质对人类健康的风险。
在小鼠骨髓微核试验中，通常将小鼠的骨髓细胞放置在培养基中进行培养，然后将待
检物质加入培养中。
待检物质可能是化学物质、辐射或生物质等。
随后，经过一定时间后，分离的细胞会被染色并进行显微镜检查，以确定细胞数量和微核的数量。
通过小鼠骨髓细胞微核试验得出的结果可以帮助研究人员判断待检物质是否是基因毒
物和可能是致癌物，是否影响细胞的正常生长和健康。
因此，小鼠骨髓细胞微核试验已成
为一种广泛使用的实验室技术，以评估物质的潜在致癌性和毒性。
总之，小鼠骨髓细胞微核试验是一种快速且有效的实验室技术，用于评估化学物质、
辐射等物质对人类健康的影响和风险。
虽然该方法需要一定的经验和技能，但它已被广泛
使用于实验室中，并成为确定制定公众卫生政策的重要工具之一。
小鼠骨髓细胞微核试验
操作步骤
• 1.取材：实验动物最后一次染毒后，按确定的时间将 小鼠颈椎脱臼（大鼠断头）处死后，剪取一侧股骨， 剔净肌肉，用纱布擦掉附在股骨上的血液和肌肉，剪 掉股骨头，露出骨髓腔。用带７号针头的注射器吸取 小牛血清（小鼠需１ml，大鼠需２ml），插入骨髓腔
微核。
试验设计
• 1.动物选择 一般常用的实验动物为大、小
鼠。以小鼠用的最多，要求体重18-20g，
7-12周龄。每组小鼠数量10只，雌、雄各
半。
试验设计
• 2.染毒途径 根据研究目的或受试化学毒物
性质不同，可分别选用经口、经皮、经呼
吸道及注射等染毒途径。但原则上应尽可
能采取如人接触化学毒物相同的途径。
原 理
• 微核试验是用于检测染色体损伤和干扰细
胞有丝分裂的化学毒物的快速方法。微核
是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，
大小相当于细胞直径的1/20~1/5，呈圆形或
杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细
胞中可以出现一个或多个。
原 理
• 一般认为微核使细胞内染色体断裂或纺锤
丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细
10min。如当日不染色，也需固定好保存。
• 4.染色：片子固定后，滴加瑞氏-姬姆萨A溶液于涂
片上，让染液覆盖整个标本涂片染色1分钟；再将
B溶液滴加于A液上面（滴加量为A液的2~3倍），
以嘴或洗耳球吹出微风使液面产生涟漪状，使两液
充分混合，染色8分钟；水洗、干燥、镜检。
• 注意：（不要把细胞冲洗掉）
胞核外的遗传物质。所以，微核试验能检
测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体
小鼠骨髓细胞微核试验.
五、作业
1. 观察并记数细胞微核率； 2. 用统计学软件SPSS统计结果。Biblioteka 三、实验材料小鼠骨髓
四、实验步骤
1. 实验前6小时用对苯二酚80mg/kg注射于小鼠腹腔内， 处死动物，用0.85%的生理盐水吹出股骨骨髓，离心1000 转/分5分钟，除上清液，滴入少量小牛血清混匀后涂片。 2. 固定：放入甲醇和冰醋酸固定液中固定5-10分钟； 3. 染色：直接在Gimsa染液中染色10分钟，然后冲洗； 用滤纸擦干载片背面的水分，再用滤纸轻轻吸干载片上面 的水分，取出盖上盖片； 4. 观察：嗜多染红细胞呈灰兰色，成熟红细胞呈桔红色， 每只动物计数1000-2000个嗜多染红细胞，微核率为千分 之2.58+0.41。
小鼠骨髓细胞微核试验
一、实验目的
1． 观察诱变物质产生的微核； 2． 了解微核测定的方法与意义，计算微核 率。
二、实验原理
微核（Micronuclei）是真核类生物细胞中的一种异常结构， 往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。在细胞间 期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主 核1/3 以下。 已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈 正相关，这一点和染色体畸变一样。所以，可用间期的微 核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。 目前国内外不少部门已经把微核测试用于辐射损伤，辐射 防护，化学诱变剂，新药实验，染色体遗传疾病及癌症前 期诊断等各方面。
实验四.小鼠骨髓细胞微核试验
院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠实验四：小鼠骨髓细胞微核试验1、实验目的通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞（PCE）的微核出现率，间接反映骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试动物是否具有致突变作用。
主要用于测试干扰细胞有丝分裂的物质。
2、实验原理微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。
红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出，但微核仍保留于PCE细胞中，因此可通过计数PCE细胞中的微核来判断受试物的致突变作用。
3、实验材料3.1实验动物7～12周龄健康小鼠，体重20~30g，10只，雌雄各半。
3.2试剂小牛血清（灭活）；甲醇；姬姆萨染色液：磷酸盐缓冲液（pH6.8）：丝裂霉素C。
3.3器材生物显微镜、恒温水浴箱、解剖剪、镊子、止血钳、注射器、灌胃针头、载玻片、玻璃染色缸、塑料吸瓶、吸管、乳钵、干净纱布、滤纸等。
4、操作步骤4.1试剂的配制4.1.1小牛血清（灭活）小牛血清滤菌后置于56℃恒温水浴保温30 min进行灭活。
4.1.2磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1/15mol/L磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠(Na2HPO4) 9.47 g溶于1000ml蒸馏水中;1/15mol/L磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾(KH2PO4) 9.07g溶于1000ml蒸馏水中;1/15mol/L磷酸氢二钠溶液50ml与1/15mol/L磷酸二氢钾溶液50ml混合即可。
4.1.3姬姆萨染色液将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至375 ml，待完全溶解后，再加入125ml甘油，混合均匀。
置37℃恒温箱中保温48h。
保温期间振摇数次，促使染料的充分溶解。
取出过滤，即为姬姆萨储备液，两周后可使用。
实验前取姬姆萨储备液与磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1 : 9混匀，即可。
4.2实验动物的处理步骤如下:（1）给药根据急性LD50，选用使动物出现中毒，但不引起动物死亡的剂量，受试小鼠腹腔注射丝裂霉素C1.5～2mg/kg（2）骨髓细胞液的制备在给与受试物6h后，小鼠脱颈椎处死，打开胸腔，沿着胸骨柄与肋骨交界处剪断，剥掉附着其上的肌肉，用滤纸擦干血污（3）PCE及微核的观察涂片在洁净的玻片一端滴小牛血清1滴，横向剪开胸骨，暴露骨髓腔，然后用止血钳挤出骨髓液至血清中，混匀，推片（长度约2～3cm），在空气中晾干（一般以两节胸骨髓液涂一张片子为宜）固定将干燥的涂片置甲醇液中固定5～10min，取出晾干染色固定好的涂片放入姬姆萨应用液中染色15～30min，蒸馏水冲洗，干燥镜检先在低倍镜下观察，选择分布均匀，染色较好的视野，然后换到油镜下观察计数。
兽药小鼠骨髓细胞微核试验指导原则
兽药小鼠骨髓细胞微核试验指导原则
一、概述
（一）定义与目的
微核试验是通过测量微核率来评价染色体损伤的一种细胞遗传学方法。微核 是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然滞留在 细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后，单独形成一 个或几个规则的次核，包含在细胞的胞质中，由于比核小得多故称微核。这种情 况的出现往往是受到染色体断裂剂作用的结果。另外，也可能在受到纺锤体毒物 的作用时，主核没有能够形成，代之以一组小核。此时小核往往比一般典型的微 核稍大。
实验17 小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞微核试验金一和大連理工大学環境与生命学院微核形成机理微核实验原理微核是染色体断裂或纺锤丝受损, 在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。
RBC在成熟之前最后一次细胞分裂后，主核排出细胞外，微核仍滞留在PCE细胞中。
因此，可以根据PCE细胞中微核出现率，观察环境污染物对染色体完整性和染色体分离改变的影响，判定其有无遗传毒性。
实验目的1.掌握小鼠骨髓细胞微核试验方法2.掌握骨髓多染红细胞（PCE）中微核的观察方法实验器材1.手术刀2.手术剪3.无齿镊4.小型弯止血钳5.干净纱布6.带橡皮头吸管7.台式离心机8.刻度离心管9.电吹风机10.玻璃蜡笔11.2ml注射器及针头12.载玻片及推片13.定时钟14.带油镜头显微镜15.细胞计数器16.玻璃染色缸17.晾片架主要试剂甲醇（分析纯）生理盐水小牛血清pH6.8的磷酸盐缓冲液分别取1/15 mol/L的磷酸二氢钾溶液50.40ml和1/15 mol/L的磷酸氢二钠溶液49.60ml，两者混合均匀。
阳性对照物环磷酰胺或丝裂霉素C实验操作步骤•染毒次数连续 4 次染毒取样时间最后一次染毒后，经过24h，取骨髓制作骨髓涂片骨髓涂片的固定、染色和封片微核观察和细胞计数骨髓细胞染色方法取胸骨剪去骨骺端擦净血污，剔去肌肉小牛血清Giemsa 应用液10~15min 甲醇中，固定15min 混匀、推片冲洗、晾干晾干冲洗、晾干细胞计数嗜多染红细胞和微核微核率计算方法结果分析与评价阳性判断实验组中至少一个剂量组微核阳性率显著大于对照组，并具有重现性和剂量-反应关系。
阴性结果试验剂量不够、采样时间不合适、细胞计数量不足、实验动物自发微核率高等原因，均可以造成实验结果阴性。
当实验设计符合标准，试验剂量足够大，其他染毒方式的微核试验结果仍为阴性时，可认为受试物微核试验阴性。
注意事项1. 实验所用的器具必须洁净，小牛血清无污染。
2. 骨髓涂片上，细胞疏密程度要合适，细胞之间互不重叠。
厦门大学-实验五.小鼠骨髓细胞微核试验(讲义)
1小鼠骨髓细胞微核试验(Bone marrow cell micronucleus test)⏹指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，大小相当于细胞直径的1/20~1/5，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。
2微核(micronucleus ，MN)细胞核微核⏹细胞有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片/环，也可以是纺锤体受损而丢失的整个染色体。
⏹它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微核。
⏹一般认为微核是细胞受到染色体断裂剂或纺锤体毒物作用的结果。
3微核(micronucleus ，MN)小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验⏹嗜多染红细胞(polychromatic erythrocyte ，PCE)细胞质内仍含有核糖体的未成熟红细胞。
4⏹正染红细胞(normochromatic erythrocyte ，NCE)核糖体已消失的成熟红细胞。
为何选择PCE (polychromatic erythrocytes)⏹PCE ：指在红细胞成熟之前，最后一次分离后数小时将主核排出的细胞，而微核仍保留在细胞质中。
⏹微核可以出现在多种细胞，但在有核细胞中难与正常核的分叶及核突出物区别。
5为何选择PCE ？⏹PCE ：Giemsa 染色呈灰蓝色(胞质内含核糖体)⏹NCE(正染红细胞/成熟红细胞，normochromatic erythrocyte ，NCE))：淡桔红色⏹骨髓中PCE 数量充足，微核容易辨认，且微核自发率低，因此，成为微核试验的首选细胞群。
6一.实验目的和意义⏹1.了解小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验的实验原理及毒理学意义。
⏹2. 掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核测定方法。
7二.实验原理⏹微核试验检测外源化学物诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
小鼠骨髓细胞微核及精子畸形实验5
（三）PCE及其微核形态
MN
NCE
MN
MN
MN
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二、正常精子及畸形形态
精子畸形
• 精子畸形如圆锥形头､双头､双尾､尾卷曲等
• 精子畸形率的增高,往往间接反映了睾丸生精功能的障 碍,也必然影响到精子的活力和受精能力｡
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无
香
钩
蕉
头
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胖 头
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双头
双尾
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尾折叠
无定型
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双头双尾
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无定型
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无钩
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一、小鼠骨髓细胞形态及微核形态
（一）基本概念
• 微核（Micronucleus，MN）：是在细胞的有丝分裂
后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍 然滞留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝点 断片，或因纺锤体受损而丢失的整条染色体。它在 末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包 含在子细胞的胞质内而形成，因比主核小，故称为 微核。
成熟红细胞，因其核糖体已消失，可通过选择性的染 色而与未成熟红细胞区别开来。
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PCE与NCE在光镜下的区别
胞
名称
胞体
核
PCE 椭圆或圆盘状 无
NCE 圆盘状
无
胞 着色 灰蓝色 桔黄色
质 分布 不均匀 均匀来自当前3页，共22页，星期二。
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染毒途径：经口、经皮、经呼吸道、注射。
染毒次数：多次染毒法（每天染毒一次，连续4天，第五天取样） 两次染毒法（第一次染毒24h后进行第二次染毒，6h取样）
五、操作步骤
本次实验染毒处理： 环磷酰胺
剂量：0.8mg/10g 每次染毒(腹腔注射） 次数：多次染毒法（4次）----最佳浓度及作用时间
五、操作步骤
骨髓液制备 ↓
涂片 ↓
染色 ↓
观察与计数
五、操作步骤
骨髓液制备及涂片 猝死：颈椎脱臼、麻醉 取组织：胸骨、股骨 获取骨髓液：在胎牛血清中迅速制取骨髓液 涂片：均匀
五、操作步骤
染色 涂片充分晾干后 染色：1. 平置涂片于染色架上，滴加试剂一5滴，
迅速均匀盖满涂片，染色1.5 min 2. 不要丢弃试剂一，直接滴加试剂二10滴， 轻轻均匀摇晃涂片使染液均匀覆盖涂片，染色8 min 3. 水洗涂片30s, 待干后镜检
到严重抑制，实验结果不可靠
2. 微核率：含有微核的嗜多染红细胞数，以千分率（‰）表 示
（若一个PCE中出现两个或两个以上微核，仍按有一个微核细胞计数）
3.阴性对照组和阳性对照组的微核发生率，根据实 验对象的不同，应与相关文献报道或研究历史数 据相一致。
4.统计分析（Poinsson分布、二项分布、X2检验等）
试验组微核率与阴性对照组相比有显著差异时， 可认为受试物为具有遗传毒性。
骨髓微核观察的步骤
取胸骨
擦净血污，剔去肌肉
剪去骨骺端
小牛血清
混匀、推片
晾干
Giemsa应用液 反面冲洗、晾干 细胞计数
六、注意事项
骨髓液制备：迅速。在胎牛血清中迅速制取骨 髓液。
涂片及染色：涂片均匀，防止细胞重叠 染色层次分明（染液新鲜配制、pH、染色时间）
四、器材及试剂
器材：手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱 布、带橡皮头吸管、晾片架、玻璃蜡笔、玻璃染 色缸、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜、 细胞计数器
试剂：小牛血清、生理盐水、Giemsa贮备液
五、操作步骤
实验动物的选择及处理
动物选择：大、小鼠，小鼠最常用，18-20g，7~12周龄， 每组10只，雌雄各半。
五、操作步骤
观察 显微镜的使用 低倍镜：细胞群 高倍镜：分布均匀、染色良好 油镜：细胞形态、微核
五、操作步骤
观察
镜下有3种细胞：
PCE:
灰蓝色
NCE： 橘黄色
有核细胞：蓝紫色
微核：蓝紫色、 圆形、 边缘则五、操作步骤计数及结果分析
1. 总共200个细胞中，计数PCE与NCE的比值 正常范围 0.6-1.2 PCE/NCE评价细胞毒性的指标 P值具有统计学意义：受试化学物剂量过大，PCE形成受
植物细胞微核实验（蚕豆根尖） 淋巴细胞微核实验 双核微核实验 小鼠骨髓微核实验
嗜多染红细胞（PCE）
嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞，由幼年发 展为成熟红细胞的一个阶段
特点： 1.无主核、易识别微核（有核细胞中微核与正常核
叶及核的突起难以鉴别） 2.胞内含核糖体，染色后成灰蓝色（区别于成熟红
细胞，其无核糖体、染色呈淡橘红色） 3.骨髓中PCE数量充足，满足实验计数的要求
三、意义及应用
检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体 完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学 终点。
检测能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤 体联结损伤的化学物（DNA断裂剂和非整倍 体诱变剂）。
辐射损伤、化学诱变剂、新药试验、染色体遗 传疾病及癌症前期诊断等各方面。
镜下观察：认真识别PCE和NCE 正确区分微核和涂片上的杂物
显微镜：油镜观察（松柏油、二甲苯）
镜下观察
正染红 细胞
微核
有核 细胞
嗜多染 红细胞
镜下观察
有核 细胞
正染红 细胞
有微核的 嗜多染红
细胞
镜下观察
有微核嗜 多染红细
胞
正染红 细胞
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小鼠骨髓细胞微核试验
二、实验原理
微核（ micronucleus） 细胞主核之外，大小为细胞直径1/20-1/5 圆形或杏仁形，边缘光滑整齐 染色与主核一致 一个细胞内可以存在一个或多个微核
二、实验原理
微核成因 染色体或染色单体的无着丝点断片 纺锤丝受损而丢失的整个染色体
细胞分裂后期遗留在胞质中，单独形成规则的次核