第2节基因工程的基本操作程序

抗体
苏云金杆菌
将Bt毒蛋白注 射小鼠体内
从小鼠血管抽出 血液分离出抗 Bt毒素的抗体
提取 组织培养 脱分化
蛋白质
出现 杂交带
2、鉴定——个体水平的鉴定
抗虫、抗病接种实验，活性比较实验
例：用棉铃饲喂棉 铃虫，如虫吃后不出现 中毒症状，说明未摄入 目的基因或摄入目的基 因未表达。如虫吃后中 毒死亡，则说明摄入了 抗虫基因并得到表达。
基因表达载体的构建过程
质粒
DNA分子
同一种 限制酶处理
一个切口 两个黏性末端
两个切口 获得目的基因
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
注意：
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制 原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了 目的基因、启动子、终止子三部分结构 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到 DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化 学键都是磷酸二酯键 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体 的方式携带进去。
D、目的基因的检测和表达
【拓展深化】 只有第三步将目的基因导入受 体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉 及碱基互补配对
三、将目的基因导入受体细胞
1 转化： 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞 内维持稳定和表达的过程。
2 常用的受体细胞： 大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌 和动植物细胞等。
3 目的基因导入受体细胞的原理： 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
1、目的基因导入植物细胞的方法 （1）农杆菌转化法
①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植 物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
【拓展深化】 工具酶只有两种：限制酶在操作程序1、2中用到且 要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；DNA 连接酶只在操作程序2中用到。
课堂练习
4、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施
工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基
互补配对的步骤是
（ ）C
A、人工合成目的基因
B、目的基因与运载体结合
C、将目的基因导入受体细胞
1. 从基因文库中获取目的基因 1. 基因文库的概念:
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的 群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。
2. 基因文库的种类:
基因组文库：含有一种生物的全部基因
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库
3.基因文库的目的：
为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因
思 考 编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核
细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
基因文库的构建方法 ① 基因组文库的构建
提取某种生物的全部DNA
用适当的限制酶酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与载体连接
重组载体
导入受体菌中储存
基因组文库
② cDNA文库的构建-----逆转录法：
提取某种生物的某器官 或特定发育时期的mRNA
外显子：能编码蛋白质的序列 编码区
内含子：不能编码蛋白质的序列
非编码区 ：有调控作用,上游有RNA聚合 酶结合位点(启动子)。
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
不同点 相同点
原核细胞
真核细胞
编码区是 _连_续___的
编码区是间隔的 、不_连__续__的
都由能够编码蛋白质的_编__码__区_和具 有调控作用的非__编__码__区组成的
mRNA前体
mRNA
逆转录酶
单链DNA DNA聚合酶
双链DNA
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
文库类型
文库大小 基因中启动子（具有启 动作用的DNA片段）
cDNA文库 小
无
基因组文库 大
有
基因中内含子(位于编
码蛋白质序列的非编码
无
有
DNA片段）
基因多少
某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
物种间的基因交流
d.重复a.b.c步骤：每重复 一次，目的基因增加一___倍
PCR技术的操作过程
PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增
PCR技术扩增与DNA复制的比较
DNA复制
PCR技术
场所
主要在细胞核内
体外复制
原理
碱基互补配对原则
碱基互补配对原则
条件 解旋方式
四种脱氧核苷酸、模 板、酶、ATP
解旋酶催化解旋
可以
部分基因可以
2.利用PCR技术扩增目的基因
1 概念： PCR全称为_多__聚__酶__链__式__反__应__，是一项 在生物体__外__复制_特__定__D_N_A_片__段_的核酸合成技术。
2 原理：DNA复制 原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷 酸；热稳定DNA聚合酶
3 前提： 已知目的基因的一段核苷酸序列
启动子
编码区
非编码区
编码区下游 终止子
与RNA聚合酶结合位点 编码区 ：编码蛋白质 ,连续不间断
基因结构
①不编码蛋白质。
非编码区 ②调控遗传信息表达,上 游的RNA聚合酶结合位点:
真核细胞的基因结构
非编码区
编码区上游
启动子
编码区
非编码区
编码区下游
终止子
基因结构
与RNA聚合酶 结合位点 外显子
内含子
四、目的基因的检测与鉴定
1 导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？ 真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。
2 目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定 维持和表达？ 不一定，需要检测
1、鉴定——分子水平的鉴定
（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了 目的基因
方法—— DNA分子杂交技术 基因探针：放射性同位素等标记的DNA分子
③适用：单子叶植物
1、目的基因导入植物细胞的方法
（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞
①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花 粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入 DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通 道进入受体细胞
② 特点:十分简便经济。
③例：转基因抗虫棉
2、将目的基因导入动物细胞
①方法：显微注射法
反（逆）转录酶
单链DNA
DNA聚合酶
双链DNA片段
与载体连接
重组载体
导入受体菌中储存
cDNA文库
真核生物的基因用逆转录法得到的 cDNA与原基因相同吗？
真核细胞的cDNA的获取
非编码区 基因 启动子
不含非编码 序列。即不 含非编码区
和内含子
编码区
非编码区
转录 剪接 逆转录 复制
终止子
RNA聚合酶 剪接有关的酶
②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受 体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上 。
③过三程、： 目的基因导入受体细胞
构建基因表达载体 转入 农杆菌
稳定维持和表达
导入
植物细胞
1、目的基因导入植物细胞的方法
（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞
①操作方法：利用压缩气体产生的动力 ，将 包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体 细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法 。② 钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在 0.6～4um 。
四种脱氧核苷酸、 模板、酶、引物
DNA在高温下变性解旋
酶
细胞内的DNA聚合酶、 解旋酶等
热稳定的DNA聚合酶
特点
半保留复制、 边解旋边复制
半保留复制、 全解旋再复制
结果
形成整个DNA分子
大量的DNA片段
3. 人工合成法
在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可
以利用DNA合成仪人工合成
蛋白质的氨基酸序列
种 基因组文库：含有一种生物的全部基因 类 部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库
2、利用PCR技术扩增
3、人工合成
二、基因表达载体的构建 ——基因工程的核心
1 目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可 以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达 和发挥作用。
2 基因表达载体的组成： 复制原点+目的基因+启动子 +终止子+标记基因
课堂练习
2、下列属于获取目的基因的方法的是( D) ①利用mRNA反转录形成 ②从基因组文库中提取 ③从受体细胞中提取 ④利用PCR技术 ⑤利用DNA转录 ⑥人工合成 A.①②③⑤ B.①②⑤⑥ C.①②③④ D.①②④⑥
课堂练习
3、有关基因工程的叙述正确的是 （ D）
A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供 资料
4、目的基因的检测与鉴定 在受体细胞中稳定遗传和正 确表达。
一、目的基因的获取
1 目的基因主要是编码蛋白质的基因： 如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相 关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、 与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的 基因、具调控作用的因子等。
2 获取目的基因的常用方法： 1、从基因文库中获取 2、利用PCR技术扩增 3、人工合成
小结：将目的基因导入受体细胞
生物种类
植物细胞
动物细胞
Leabharlann Baidu微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 Ca2+处理法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
将目的基因插入到 Ti质粒的T-DNA上 →农杆菌→导入植 转化过程 物细胞→整合到受 体细胞的DNA→表 达
Ca2+处理细胞 将含有目的基因 →感受态细胞 的表达载体提纯 →重组表达载 →取卵（受精卵 体与感受态细 ）→显微注射→ 胞混合→感受 受精卵发育→获 态细胞吸收DNA 得具有新性状的 分子 动物
推测
mRNA的核苷酸序列
推测
基因的核苷酸序列
化学合成
目的基因
思考：化学法合
成的目的基因含内含 子、启动子和终止子 吗？
人工合成法（真核生物）
反转录法 目的基因的信使RNA
单链DNA
合成
目的基因
化学合成法
肽链氨基酸序列
推测
信使RNA序列
推测
基因的核苷酸序列
合成
目的基因
课堂小结
目的基因的获取
1、从基因文库中获取
第2节基因工程的基本操作 程序
基因工程基本操作的四个步骤
有了目的基因，我们才能赋
1、目的基因的获取 予一种生物以另一种生物的 遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳
2、基因表达载体的构建 定存在，并可进行遗传、表 达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定表达
3、目的基因导入受体细胞 ，才能实现一种生物的基因 在另一种生物中的转化。 才能确定目的基因是否真正
受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基 因完成了表达吗？
不能，受体细胞必须表现出特定的性 状，才能说明目的基因完成了表达。
课堂练习
1、有关基因工程的叙述中，错误的是( A) A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起
来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶
①程序
目的基因表达载体提纯
显微注射
受精卵
取卵（受精卵） 新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞
①微生物作受体细胞原因：
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
②常用菌：大肠杆菌
③常用法：Ca2+处理获得感受态细胞
④过程：
Ca2+处理 大肠杆菌
感受态 细胞
表达载体 与感受态 细胞混合
感受态细胞 吸收DNA
aP、CDRNA技变术性的（操90℃作-过95程℃）
：双链DNA模板在热作用下
，氢_键____断裂，形成单链DNA
________ b、退火（复性55℃-65℃） ：系统温度降低，引物与
DNA模板结合，形成局双部链
________。
c、延伸（70℃-75℃）：在 Taq酶的作用下，合成与模
板互补的_D_N__A_链___。
表达载体
启动子：位于基因的首端的一段 特殊的DNA片断，它是RNA聚 合酶识别和结合的部位，有了它 才能驱动基因转录出mRNA， 最终获得蛋白质
终止子：位于基因的尾端的一段 特殊的DNA片断，能终止 mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别受体 细胞中是否含有目的基因，从而 将有目的基因的细胞筛选出来
探针
15N
15N
转基因生 14N 物的DNA 14N
变性 变性
1、鉴定——分子水平的鉴定 （2）检测目的基因是否转录出了mRNA
方法—— 分子杂交技术
探针
15N
15N
变性
转基因生物 的mRNA
14N
14N
1、鉴定——分子水平的鉴定
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法——抗原-抗体杂交
Bt毒素蛋白
基因组DNA文库与cDNA文库
某生物体内全部DNA
限制酶
许多DNA片段
与运载体连接导入
受体菌群体
基因组文库
某种生物某个时期的mRNA
反转录 cDNA
与运载体连接导入
受体菌群体
cDNA文库
基因的结构
非编码区
编码区
非编码区
原核
启动子
真核
RNA聚合酶 结合位点
外显子
内含子 终止子
原核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游