神经生物学-3 神经元和神经胶质细胞

成神经分化后细胞内游离Ca2+浓度的变化
图3-1 共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度。
成神经分化后细胞内游离Ca2+浓度的变化
图3-2 不同诱导天数细胞内钙离子流变化趋势。取未分化AMSCs及成球诱导法诱导的分化不同 天数（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d）的类神经元细胞经10 umol/LFluo3/AM 染色30min后， 经共聚焦显微镜扫描拍摄单个细胞内的荧光强度值。（n=10）
来源：人脂肪组织（手术获取，均征得患者同意）、 骨髓组织（病人本身或志愿者捐赠） 足月胎儿脐带（均征得孕妇同意）
干性标志性抗原表达检测： 间质细胞的标志物CD29、CD44、CD90、CD105、CD166等 造血干细胞标志物CD34、CD45、CD14等
技术路线
神经向诱导分化
• 化学诱导方法 • 鼠脑条件培养基诱导方法 • 成神经球后分化诱导方法 脂肪、骨髓间充质干细胞原代培养
（2）转录因子的调控
– 在胚胎干细胞的发生中，转录因子Oct4是必需的。 – Oct4是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子， 它诱导表达的靶基因产物是FGF-4等生长因子，能 够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围 滋养层的进一步分化。 – Oct4缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细 胞不能发育成内层细胞团
3．小胶质细胞（microglia）
分布于灰质及白质内,约占胶质 细胞的5％脑体较小,呈长椭圆 形,常以胞体长轴的两端伸出两 个较长突起,反复分支,其表面 有小棘。胞核小,呈椭圆或三角 形,染色较深。
具有变形运动和吞噬功能,属于 单核吞噬细胞系统的细胞 也有人认为小胶质细胞是中枢 神经系统中神经胶质的干细胞, 能分化成其他胶质细胞。
图2-5 Syn及Basson Real time PCR 检测不同分化阶段基因表达
突触蛋白Basson检测
图2-5 Basson蛋白表达及定位 经成球诱导分化9 d后，检测FITC标记Basson免疫荧 光表达，Hoechst33258染核
诱导后类神经元细胞分泌功能检测
图2-6 Elisa法检测诱导后AMSCs的EGF，BDNF因子分泌功能（** P<0.05）
化学方法诱导后形态学鉴定
图2-1 化学因子诱导后类神经元形态 A：诱导14 days B：诱导30 days
鼠脑条件培养基诱导后形态学鉴定
图2-1 鼠脑条件培养基诱导后类神经元形态 C：诱导7days D：诱导14days
成神经球分化诱导后形态学鉴定
图2-1成球诱导分化后类神经元形态 E：成球诱导72 h F：Nestin荧光染色鉴定
内源性调控
• 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从 而调节其增殖和分化
（1）细胞内蛋白对干细胞分裂的调控
e.g 在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种 称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如 膜收缩蛋白和细胞周期素A。 收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位， 从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代 干细胞中。
5.干细胞临床应用和展望----
-----干细胞移植和干细胞产业
录像：干细胞产业
自2009年美国总统奥巴马签署命令解除对胚胎干细胞研究的政府 资金支持限制后，美国联邦食品药品监督局（FDA）放行干细胞临 床实验和干细胞产品。2010年批准了第一个上市的干细胞治疗药 物-美国杰龙公司的一个干细胞药物。
肝样诱导分化
•共聚焦显微镜及 免疫蛋白印迹检测 不同分化阶段细胞几 种特异蛋白的表达
干细胞特性鉴定
细胞活力测定
• 形态学检测 • 免疫荧光检测 • 神经特异性标记 β-Ⅲ-Tubulin NSE Nissl • 突触形成检测 • 神经细胞分泌功能检测
AMSCs形态学观察
图1-1 脂肪间充质干细胞（AMSCs）形态学观察
第三讲 神经元与神经胶质细胞
一、 神经元
脊椎动物的神经细胞结构
神经细胞及其组成成分
二、神经胶质细胞
数量多，没有传导功能。
脑内含量比较：果蝇-25%
啮齿类-65% 人类-90% （与神经元的比例约为10：1）
神经元的代谢和正常活动都起着重要作用：
神经退行性疾病 髓鞘化 郎飞氏节形成 突触形成 神经元信号转导
– 白血病抑制因子（LIF） – Tcf/Lef转录因子
外源性调控
• 干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基 质等外源性因素的影响 （1）分泌因子
– 间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖， 分化和存活. e.g TGFβ 家族和Wnt信号通路。
（2）膜蛋白介导的细胞间的相互作用
– 有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。 e.g β -Catenin (一种介导细胞粘附连接的结构 成分)。 e.g 穿膜蛋白Notch及其配体Delta或Jagged也对干 细胞分化有重要影响.

胚胎干细胞： 全能的，具有分化为几乎全部组织和 器官的能力

成年组织或器官内的干细胞：具有组织特异性，只能 分化成特定的细胞或组织。
2.干细胞分化如何调控的？ ——干细胞的应用基础
• 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干 细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方 向发展。 • 内源性调控 • 外源性调控
（－）中枢神经系统的神经胶质细胞
1.星型胶质细胞 Astrocytes
胶质细胞中最大的一种,胞体呈星形,核大呈圆形或椭 圆形,染色较浅。 胞质内有交织走行的神经胶质丝（neuroglial filament）。由胞体伸出许多呈放射状走行的突起, 部分突起末端膨大形成脚板（end foot）,附着在毛 细血管基膜上,或伸到脑和脊髓的表面形成胶质界膜 （gliolimitan）。 约占全部胶质细胞的20％。
4．室管膜细胞（ependymal cell）
•覆盖在脑室和脊髓中央管壁的一层立方或柱状细胞 •细胞表面有微绒毛或纤毛
•细胞基部发出细长突起伸向脑及脊髓深层
•具有保护和支持作用。
（二）周围神经系统的神经胶质细胞
1．施万细胞（Schwann cell）：又称神经膜细 胞（neurolemmal cell）,它包卷在神经纤维轴突的 周围,形成髓鞘和神经膜。在神经纤维的再生中起诱 导作用。 2．卫星细胞（satellite cell）又称被囊细胞 （capsular cell）,是包绕在神经节细胞周围的一 层扁平形细胞,核圆形,染色较深。它具有营养和保 护神经节细胞的功能。
增殖能力 分化
低，最原始
最强 全能 可生畸胎瘤
较低
强 多能 安全
较高
较强及较低 多能 安全
人类尸体大脑内里的细胞培养出多功能干细胞
现在科学家们已经从人类尸体的头皮和大脑内里收集到这样的细胞并且把它们 再次转变成干细胞。换句话说，死人能够产生活体细胞，而且能够被转化成为 身体中的任何细胞或者组织。研究人员称，这项研究能够带来新奇的干细胞疗 法并且清楚的了解各种各样的精神障碍，比如说精神分裂症、孤独症和躁郁症， 这些疾病或许就是源自于发育问题。 健康网2012-10-19
三种方法诱导后β-Ⅲ-Tubulin检测
图2-2 AMSC经过不同方法诱导后β-Ⅲ-Tubulin表达免疫荧光检测
三种方法诱导后NSE检测
图2-3 AMSC经过不同方法诱导后NSE表达免疫荧光检测
三种方法诱导后Nissl检测
图2-4 AMSC经过不同方法诱导后Nissl表达免疫荧光检测
突触基因Basson、Syn检测
德国慕尼黑大学、亥姆霍兹慕尼黑中心组成的一个研究小组2010年5月18日宣布在脑 细胞再生研究方面取得新进展：使用特殊的转录因子可使大脑皮层的星形胶质细胞转 化为功能性神经细胞。这一成果将有助于老年痴呆症或中风等疾病的新疗法研究。
Heinrich et al :Directing Astroglia from the Cerebral Cortex into Subtype Specific Functional Neurons PLoS Biology 2010,8（5）：1-29
Fig 3 ER-a36, a isoforms of ERa, is highly expressed throughout in human mesenchymal stem cells (hBMSCs )
Fig 4 ER-a36 is translocated into nucleus related with Runx2 in osteogenetic differ2.少突胶质细胞（oligodendrocyte）
又称少突胶质,分布于灰质及 白质内,位于神经元胞体及神 经纤维的周围,其数量很多, 约占全部胶质细胞的75％。
胞体较小,呈圆形或椭圆形, 突起少,分支亦少,核呈圆形 或椭圆形，染色稍深。电镜 下可见少突胶质细胞的每一 个突起包绕一个轴突形成髓 鞘。它除形成髓鞘外,可能还 有营养和保护作用。
（3）整合素（Integrin）与细胞外基质
– 整合素家族是介导干细胞与细胞外基质粘附的最主要的 分子。整合素与其配体的相互作用为干细胞的非分化增 殖提供了适当的微环境。 e.g β1整合素
干细胞的可塑性
• ___供体的干细胞在受体中分化为与其组织来 源一致的细胞。而在某些情况下干细胞的分 化并不遵循这种规律。 • e.g 1999年Goodell等人分离出小鼠的肌 肉干细胞，体外培养5天后，与少量的骨髓间 质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中， 结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系。 这种现象被称为干细胞的横向分化
3.干细胞来源于哪里？如何分离、 培养和定向分化？
——干细胞的平台技术
干细胞来源及其特点
特征 胚胎及胚胎组织干 脐带及脐带血干细 骨髓及外周组织干 细胞 胞 细胞（血液，体细 胞） 自然及人工流产 三胚层及其选择 分娩取得 外胚层为主 骨髓穿刺，外周血 细胞因子激发 单纯
来源及获取 组织学特征
抗原性
研究意义
• 有望找到用脑中现有的星形胶质细胞 “更新”因伤或疾病而受损的脑细胞的 方法。 这一成果将有助于老年痴呆症或 中风等疾病的新疗法研究。
三、神经干细胞的研究进展
录像：干细胞基础知识
1.什么是干细胞？有何特征？ ——干细胞的基础知识
干细胞的概念
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。 包括胚胎干细胞和成体干细胞：
4.当前干细胞研究的热点问题？ -----干细胞的研究进展
录像：干细胞的研究进展
• 应用干细胞治疗疾病:
e.g 组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死， 退行性病变如帕金森综合征, 自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。



低毒性（或无毒性），一次药有效； 不需要完全了解疾病发病的确切机理； 还可能应用自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。 用干细胞治疗疾病已不再只是设想。
BMSCs形态学观察
图1-2 骨髓间充质干细胞（BMSCs）形态学观察
MSCs表面抗原鉴定
图1-3 第5代MSCs细胞表面抗原
MSCs成骨细胞诱导分化
图1-4 AMSCs向成骨细胞分化
钙钴法染色
MSCs成脂细胞诱导分化
图1-4 MSCs向成脂细胞分化
油红染色
MSCs增殖能力比较
图1-6 MSCs生长曲线及冻存复苏后细胞生长曲线
在大脑皮层的星形胶质细胞中植入 “Neurogenin2”转录因子可使星形胶质细胞转 变为兴奋性神经元，在同样的星形胶质细胞中 植入“Dlx2”转录因子则可使其转变为抑制性神 经元。
Postnatal cortical astroglia reprogrammed by forced expression of Neurog2 give rise to synapse-forming glutamatergic neurons.
人脐带和脂肪来源的MSCs优点
⑴无伦理道德等方面的约束； ⑵原代培养即可获取大量细胞 ⑶分离成功率高，几乎可达100%； ⑷获取过程为非侵袭性操作，对母体和胎儿无影响，也不会造成 任何痛苦； ⑸细菌和病毒感染风险较成体组织来源的MSCs低； （6）分化潜能介于胚胎干细胞和成体干细胞之间，不会发生畸胎 瘤，易于分化为3个胚层衍生的多种成熟细胞； ⑺能被诱导分化为多种神经元和各类胶质细胞，还能分泌大量的 神经营养因子 ⑻免疫源性低，有可能成为同种异体细胞移植的来源； ⑼转染效率高，能稳定表达外源性基因，可作为基因治疗的载体。