chapter7色谱

纸层析
• 是一种常用的快速分离、鉴定方法， 是一种常用的快速分离、鉴定方法，可用 于定性分析以及确定分离方案， 于定性分析以及确定分离方案，但一般不用于 定量分析 介质：滤纸 介质： 操作方法：将试样溶于适当溶剂中， 操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样 于滤纸的一端； 于滤纸的一端；选用适当的展开剂 ，借助毛细 管现象从点样的一端向另一端流动， 管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束 取下滤纸，晾干，染色显迹。 后，取下滤纸，晾干，染色显迹。
色谱分离图示
层析谱的本质是使一种液 体均匀地渗过一个相当细碎的 物质的柱体， 物质的柱体，这些物质通过某 种过程有选择地阻留了液体内 的某些组分。 的某些组分。
马丁（ Martin）（ ）（英 马丁（A. J. P. Martin）（英）
7 液相色谱
1、一般过程 、 2、分类 、 3、名词术语 4、理论 泵
自动馏分收集仪（国产）
自动馏分收集仪（进口）
国产柱层析系统
伯乐公司（BIO-RAD）柱层析系统
法玛西亚公司（Pharmacia）柱层析系统
柱色谱洗脱方法
洗脱一般有三种方法： 洗脱一般有三种方法： ①恒定洗脱法： 恒定洗脱法： ②逐次洗脱法： 逐次洗脱法： ③梯度洗脱法： 梯度洗脱法： 梯度洗脱法是目前最常用的洗脱法。 梯度洗脱法是目前最常用的洗脱法。
3)、按色谱的展开形式 、
A、柱色谱法 B、毛细管色谱法 C、平板色谱法：硅胶板色谱、纸色谱
按处理量分
• • • • 10mg） ⑴分析色谱 （10mg） (10⑵半制备色谱 (10-50mg) (0.1⑶制备色谱 (0.1-1g) ⑷工业生产规模色谱 (>20g/d) 年产10g合格的重组人粒细胞集落刺激 年产10g合格的重组人粒细胞集落刺激 10g 因子（rhGM-CSF），其产值高达1亿元。 ），其产值高达 因子（rhGM-CSF），其产值高达1亿元。 Recombinant Human GranulocyteMacrophage Colony Stimulating Factor
• •
展开剂的选择
• 展开剂可以是单一溶剂，也可以是混合溶剂。 展开剂可以是单一溶剂，也可以是混合溶剂。 • 常用的氨基酸纸层析体系中使用的展开剂 正丁醇-甲酸 甲酸-水 为：正丁醇 甲酸 水（15：3：2） ： ： ）
– – – 上行色谱 下行色谱 径向色谱
• 展开方式：3种 展开方式： 种
纸层析和薄层层析分离过程
Column Chromatography
柱层析系统
1、工艺流程图
2. 层析柱 径高比（ ： 径高比（1：10—1：100）、 ： ） 材质（玻璃、有机玻璃、 材质（玻璃、有机玻璃、PVC、不锈钢等）、 、不锈钢等） 耐压（ 耐压（0.05－10 MPa）等 － ） 3. 泵—恒速、压力（蠕动泵、柱塞泵等） 恒速、 恒速 压力（蠕动泵、柱塞泵等） 4. 馏分收集仪 手动、自动 馏分收集仪—手动 手动、
前沿法(frontal method)又称迎头法
• 此法仅第一个组分纯度较高，其他流出物 皆为混合物，不能实现各个组分的完全分 离，现已较少采用。
置换法(displacement method) 又称顶替法 当含三种组分的混合物样品注入色谱柱 后，各组分皆与固定相有强作用力，若使用一 般流动相无法将他们洗脱下来。 为此可使用一种比样品组分与固定相间作 用力更强的置换剂（或称顶替剂）作流动相， 当它注入色谱柱后，可迫使滞留在柱上的各个 组分，依其与固定相作用力的差别而依次洗脱 下来，且各谱带皆为各个组分的纯品。
色谱现象
纸层析
In 1903，俄国植物学家Michael Tsweett’s Work(see Ber. Deut. Botan. Ges., 1906; 24: 384). Chromatography = (chromatus = color, graphein = to write).
A、图形包含的意义 、 B、分离机制 、 C、柱效 、 D、分离度 、
柱层析装置图
梯 度 制 造 器
•
(1) (3)
(2)泵 泵
adaptor
记录器 记录
(4)
缓 冲 液
A
管 柱
reservoir 胶 体 装 填 胶 体
监 视 器
(5)
分 划 收 集 器
7.1.2
4)、按展开程序 、
A)、洗脱法 B)、顶替法 C)、迎头法
色谱分类
5)、按原理分类 、
按展开程序区分 展开程序区分 洗脱法(elution method) 又称淋洗法， 如将含三组分的样品注入色谱柱，流动相 连续流过色谱柱，并携带样品组分在柱内向前 移动，经色谱分离后，样品中不同组分依据与 固定相和流动相相互作用的差别，而顺序流出 色谱柱。
5. 检测仪
– 通用型 示差折光、介电常数、电导等 通用型—示差折光 介电常数、 示差折光、 – 专用型—紫外、荧光、放射性检测器等 专用型 紫外、荧光、 紫外
6. 记录仪 • 工作站—色谱参数的选择和设定、自动 工作站 色谱参数的选择和设定、 色谱参数的选择和设定 化操作、色谱数据的采集和存储，并作 化操作、色谱数据的采集和存储， 实时处理、数据后处理、 实时处理、数据后处理、自动打印出一 套完整的色谱分析数据…… 套完整的色谱分析数据
纸层析和薄层层析也属于色谱分析法。 纸层析和薄层层析也属于色谱分析法。但与其它色谱 动力源。 方法不同的是在分离过程中一般不使用动力源 方法不同的是在分离过程中一般不使用动力源。 纸层析和薄层层析流 动相的移动是依靠毛细 动相的移动是依靠 毛细 作用。 作用。 将试样点在色谱滤纸 或层析板的一端， 或层析板的一端 ， 并将 该端浸在作为流动相的 溶剂（ 溶剂 （ 常称之为展开剂 ） 中 ， 随着溶剂向上的 移动， 经过试样点时， 移动 ， 经过试样点时 ， 带动试样向上运动。 带动试样向上运动。
3. 点样
用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样 点在原点上。试样点的直径一般应 小于5mm 。 可并排点多个试样同时展开。
4.显色、 4.显色、检测 显色 有些组份在紫外光照射下产生荧光， 可在紫外灯下用铅笔将组份斑点描绘出来 。常用的显色方法有喷洒显色剂、碘蒸气 熏或氨水熏等。
特点及应用
前沿法(frontal method)又称迎头法 如将含三个等量组分的样品溶于流动相， 组成混合物溶液，并连续注入色谱柱。 由于溶质的不同组分与固定相的作用力 不同，则与固定相作用最弱的第一个组分首 先流出，其次是第二个组分与第一个组分混 合流出，最后是与固定相作用最强的第三个 组分与第二个和第一个组分混合流出。
7.1.2
1)、按应用的目的 、
色谱分类
A、制备性色谱 (preparation Chromatography)：工业 规模，实验室规模 B、分析性色谱 (analytical Chromatography) ： GC 、 LC、HPLC、TLC等。
2)、按流动相 、 A、GC: 气-固色谱法(固定相为固体) 气-液色谱法(将不挥发的液体固定在适当的固体 载体上作为固定相) B 、LC 液-固色谱(固定相为固体) 液-液色谱(液体固定相固定在适当的固体上)
平板色谱简单、方便、 平板色谱简单 、 方便 、 及操作费用 低 ， 可以在一块层析板上同时展开多个 试样及将多条滤纸同时展开。 试样及将多条滤纸同时展开。 采用方形薄层板还可以方便的进行 二维展开， 即按一般方法展开后， 二维展开 ， 即按一般方法展开后 ， 改变 方向和展开剂再次展开， 方向和展开剂再次展开 ， 进一步改善分 离效果。 离效果。 试样一般不需要经过预处理即可分离。 试样一般不需要经过预处理即可分离。
•
CSF药理作用： 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 （rhGM-CSF）作用于造血祖细胞，促进其增 殖和分化，其重要作用是刺激 粒、单核巨 噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放， 并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。
【适应症】 • • • • 1.预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引 起的白细胞减少症。 2.治疗骨髓造血机能障碍及骨髓增 生异常综合征。 3.预防白细胞减少可能潜在的感染 并发症。 4.使感染引起的中性粒细胞减少的 恢复加快。
4.1、塔板理论 、 4.2、速率理论 、 4.3、分离度 、 4.4、定性分析 、 4.5、定量分析 、 4.6、定量方法 、
5 应用 违禁药 应用: 物分析
层析的发展史
年代 1906 1931 1938 1941 1952 1956 1957 1958 1965 1975 1981 Golay Giddings Small Jorgenson 发明者 Tswett Kuhn, Lederer Martin, Synge Martin, James Van Deemter 发明的色谱方法或重要应用 用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。 用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念 用氧化铝和碳酸钙分离a-、 和 胡萝卜素 胡萝卜素。 用氧化铝和碳酸钙分离 、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始 为人们所重视。 为人们所重视。 提出色谱塔板理论；发明液 液分配色谱 液分配色谱； 提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作 为流动相（即气相色谱）。 为流动相（即气相色谱）。 从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。 从理论和实践方面完善了气 液分配色谱法。 液分配色谱法 提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。 提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。 基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。 基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。 发明毛细管柱气相色谱。 发明毛细管柱气相色谱。 发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。 发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。 发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相， 发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用 抑制型电导检测的新型离子色谱法。 抑制型电导检测的新型离子色谱法。 创立了毛细管电泳法。 创立了毛细管电泳法。