植物抗冻蛋白研究

植物抗冻蛋白研究（综述）

摘要：植物的抗冻性是由于植物体内具有抗冻蛋白，抗冻蛋白蛋白的发现为研究植物的抗冻性，提高植物的抗冻能力具有重要的作用。本文主要介绍了一些关于植物抗冻蛋白的发现、特性、作用机制以及基因工程方面的研究状况。

关键字：抗冻蛋白；植物抗冻蛋白；抗冻基因；基因工程

1.前言

抗冻蛋白(antifreeze proteins AFPs) 是从耐冻的鱼、昆虫等过冬生物组织中提炼出来的一类具有特殊功能的蛋白，它能抑制冰晶生长速度，降低冰点，保护细胞膜免受冷冻损伤【1】。研究植物的抗冻蛋白的特性、作用机理以及抗冻蛋白的基因工程对提高植物的抗冻性具有重要的意义，还可以减少每年由于冻害造成的经济损失。

2.植物抗冻蛋白的发现

早在20世纪60年代，抗冻蛋白AFPs就在极区海鱼中发现【2】，但直到1992年加拿大的Griffith等人才第1次从冬黑麦中分离纯化得到植物抗冻蛋白【3】。同年，美国圣母大学的Duman实验室在多种植物中发现了具有热滞效应的蛋白质。卢存福等在高山植物唐古特红景天叶片及悬浮培养细胞中获得AFPs，并采用组织培养方法低温诱导其愈伤组织产生A_UPs也获得成功【4】。目前已在许多越冬植物包括裸子植物、被子植物、蕨类植物和苔藓植物中检测到具有热滞活性的AFPs，说明具有热滞活性的AFPs在植物中的分布具有普遍性【5】。1995年，Huang T等【6】在无头甘蓝(Brasica oleracea)扣分离了66kD的AFPs；随后卢存福【7】等在高山植物唐古特红景天叶片及悬浮培养细胞中获得具有抗冻活性的蛋白质。在木本植物AFPs 的研究中，我国费云标等(1994)从常绿灌木沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)中率先分离和部分纯化到AFPs，这是最早发现的木本植物AFPs【5】。1998 年英国York 大学的Dawn 等诱导纯化了胡萝卜AFPs ,它是一种分子量为36ku 的抗冻糖蛋白,pI 为5.1 ,体外热滞值为0.355℃,去掉糖链也不影响其抑制重结晶的活性【8】。2000，Chris 等从一种越冬的多年生

的黑麦草中发现了AFPs,并发现该AFPs在100℃仍能保持稳定【9】，这是目前发现最耐高温的AFPs。

3.抗冻蛋白的作用机制

根据目前的研究发现，抗冻蛋白的作用效应是降低冰点，减小冰晶的生长速度。但对于它的作用机制，目前仍然是争论不休的。在这个过程中，有人提出了一系列的假说，其中主要有结合水假说、空间障碍、表面结合学说和吸附抑制学说等，其中吸附抑制学说最为得到大家的认可，它最早由Raymond和Devries于1977 年提出, 他们认为AFPs 可逆地吸附在冰晶表面,通过Kelvin 效应抑制其生长【8】。费云标等【10】报道沙冬青及黑小麦AFP的冰晶都具有鱼类AFP双锥形的冰晶形态，因此推测植物AFP与鱼类AFP可能有类似的作用机制，即依靠抗冻蛋白的热滞效应降低冰点。但是由于植物AFP的热滞值通常为0.2℃-0.6℃，其热滞效应大大低于鱼类和昆虫的AFP，这对环境温度远远低于-1．9℃下的北方越冬植物来说，仅靠AFP 的热滞效应束降低冰点是难以解释的【11】。抗冻蛋白的作用机制可以分为以下几个方面：①降低原生质溶液冰点，尽量避免植物体内形成冰晶；②抑制冰晶的重结晶；③修饰胞外冰晶的生长形态；④调节原生质体的过冷状态，AFPs与包括冷诱导的热稳定蛋白在内的所有溶质相互作用；调节细胞质的状态，使过冷点降低，这可能是越冬植物细胞的主要抗冻调节方式【12】。因此对于植物的抗冻蛋白的作用机制还有待进一步的研究。

4.抗冻蛋白的特性

抗冻蛋白的特性主要有：热滞效应、冰晶形态效应和重结晶抑制效应。

抗冻蛋白只影响结冰过程,而几乎不影响熔化,使得冰点低于熔点,这种冰点和熔点的差异就成为热滞效应(thermal hysteresis) 。抗冻蛋白通过结合到冰晶的表面抑制其生长,从而改变冰晶的形态称为冰晶形态效应。AFPs 具有抑制重结晶发生的作用,防止小的冰晶凝结成更大的冰晶,使形成的晶粒体积小且均匀。AFPs 的上述特性都是通过AFPs 与冰晶的表面相互作用而实现的，这称为重结晶抑制效应【8】。

5.植物抗冻蛋白的基因工程

基因工程(genetic engineering)也叫基因操作、遗传工程，或重组DNA技术。它是在分子遗传学的理论指导下用类似工程设计的方法，预先设计蓝图，通过DNA拼接技术，将生物的某个基因通过基因载体另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，从而创造生命新品种的遗传学技术【13】。目前已知的植物抗冻基因主要为环境诱导表达的基因及某些组成性表达的基因。前者指冷驯化(植物自身适应环境的结果)，后者是通过基因工程技术克隆出抗冻基因，连上强启动子或冷诱导启动子转入植物，获得转基因植株，进而提高植

株的抗冻性【14】。

现阶段，可以转入植物体的抗冻蛋白基因主要来自鱼类、昆虫和植物。其中在将鱼类的AFPs基因转入植物体的研究中，但是由于对其调控机理不了解，用鱼抗冻蛋白基因转化植物的研究未能达到理想的效果【15】。目前在昆虫中已经提取出20多种抗冻蛋白，肖艳华利用准噶尔小胸鳖甲MpAFPl49基因对驱蚊香草进行了遗传转化，使驱蚊香草获得了一定的抗冻性【16】。最近克隆到的植物抗冻蛋白基因还包括黑麦草l117 kD的AFP的cDNA，冬黑麦中3117 kD 的AFPs的CHT基因，2 418 kD的AFPs的CHT46基因。其中来自冬黑麦中的这两个抗冻蛋白基因，均已被转化到大肠杆菌中，检测结果表明，表达蛋白具有抗冻活性【17】。Murata N【18】将南瓜藤和拟南芥中得到的甘油一32一磷酸酰基转移酶基因导人烟草中，明显改变磷酸酰甘油的脂肪酸组成，并提高其抗冻力。Gleeson D等于2005年利用农杆菌将 Vigna aconitifolia 基因转化到落叶松，结果转基因植株的脯氨酸含量比未转基因的对照植株高30倍，转基因植株的抗冻性得到很大提高【19】。

虽然植物低温诱导基因表达改变的报告较多，但目前尚未对已分离鉴定的植物低温诱导基因作全面研究，多数情况下仅能通过将已克隆到的基因序列与基因库里的序列比较来推测其可能具有的功能，真正被认定为抗冻蛋白基因的研究报告极少【20】。因此，抗冻蛋白的研究还需要我们继续不断地进行。

参考文献：

【1】潘瑞炽.植物生理学（第六版）[M].北京：高等教育出版社，2008.

【2】陈晓阳，沈熙环.林木育种学[M].北京：高等教育出版社，2005.

【3】樊绍刚,张党权，邓顺阳,明付焕.抗冻蛋白和冰核蛋白对植物抗冻性能的作用机制[J].经济林研究，2009,27(2):125-130

【4】韩婧.植物抗冻蛋白的结构模型及应用[J].沧州师范专科学校学报，2005,21(3) 【5】林善枝，张志毅，林元震.植物抗冻蛋白及抗冻性分子改良[J].植物生理与分子生物学学报，2004,30(3):251-260

【6】Huang T,Duman A Q,Purification and characterization of thermal hysteresis protein from

Cold acclimated kale，Brasica oleracea[J]．Cryobiology,1995，32：577-581