植物低温诱导蛋白的研究进展_马斌

植物低温诱导蛋白的研究进展
马斌,孙骏威,李素芳
*
(中国计量学院,浙江杭州310018)
摘要 低温能够诱导植物基因的表达从而合成新的蛋白质,这些蛋白质具有增强细胞抗冰冻脱水能力、保护酶行使正常功能和代谢调节功能及稳定细胞膜等作用。

植物低温诱导蛋白及其理化性质与抗冻关系一直是国内外的研究热点。

综述了抗冻蛋白、脱水蛋白和热激蛋白3种低温诱导蛋白的最新研究进展及与植物抗冻性的关系。

关键词 低温诱导蛋白;抗冻蛋白;脱水蛋白;热激蛋白
中图分类号 Q 943 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2010)12-06085-02
Research Adva nces about Lo w -te mperature -induced Protei ns i n P l ants MA B i n et al (Chi na Jili ang U ni versity ,H angzhou ,Zhejiang 310018)Abstract Low te mperature can regul a te t he expressi on of pl ant genes ,and thus s ynt hesize m any ne w prote i ns t hat are ab l e to enhance t he cell u l ar ant-i freeze dehydrati on ,pro t ect the acti on of nor ma l functi ons of enz ymes ,andm etabo lic regul a t ory f unction ,stabilit y me mbrane etc .
The physi cal and che m ica l characters o f pl ant lo w-te mperat ure -i nduced protei ns and i ts f uncti on i n l ow te mperat ure resi st ance has been a ho t research fiel d .The l atest research advances in three ki nds o f l ow -t e m pera t ure -i nduced prote i ns were expounded ,t he antifreeze protei n ,dehy -dration prote i n and heat s hock prote i ns ,and t heir f unctions in l ow te mperature resistance of p l ants .K ey words Low -te m perature -i nduced pro t e i ns ;A ntifreeze pro t e i n ;Dehydrati on protein ;H eat s hock prote i ns
基金项目 浙江省自然科学基金项目(Y3080166)。

作者简介 马斌(1985-),男,山东潍坊人,硕士研究生,研究方向:生
物化学与分子生物学。

*通讯作者。

收稿日期 2010-01-21
1970年,W ei ser 首先提出了低温诱导能够调节植物基
因发生改变从而合成新的蛋白质的观点[1]
,这些伴随着植物
的低温驯化而出现的新蛋白质被称为低温诱导蛋白。

此后30多年,低温诱导蛋白及其理化性质与抗冻关系一直是国内外的研究热点。

研究者大多使用体内标记、蛋白质合成抑制剂及mR NA 体外翻译等方法研究抗冻基因表达合成的特异性蛋白,试图分离纯化出低温特异性蛋白,以获得其氨基酸序列,并利用氨基酸序列作为探针,筛选出特异性基因,用于改良作物的抗冻性能。

目前,已在云杉(P ice a as perata M ast)、黑麦草(Loliu m perenne)、小麦(T riticu m aestivum )、拟南芥(A r abi do psis thaliana )、黄瓜(Cuc w nis s a tivu )、棉花(Gos -s ypiu m hirsutu m )、沙冬青(Amm o p i ptan t hus m ongolicus)、胡萝卜(Dauc vz carotavar)、马铃薯(S olanu m tuberos um )、菠菜(Spi -naci a oleracea )、水稻(Or yz a s ativa )、白桦(B et u l a p l a t yphylla Suk)等[2-7]
30多种植物的低温诱导中观察到特异蛋白的合成。

根据现有研究结果,可将植物低温诱导蛋白按其性质、结构与功能不同分为增强细胞抗冰冻脱水能力、冰冻时对酶行使正常功能可能起保护作用、有代谢调节功能、对细胞膜具有稳定作用、与细胞内信号转导有关的低温诱导蛋白及低温诱导的热激蛋白、抗冻蛋白和脱水蛋白8种类型[8]
,其中有关抗冻蛋白、脱水蛋白和热激蛋白的研究居多。

笔者重点阐述抗冻蛋白、脱水蛋白和热激蛋白3种低温诱导蛋白的特性及其与植物抗冻性的关系。

1 抗冻蛋白的特性和植物抗冻性
抗冻蛋白(Antifreeze pr otei n ,AFP)是一类具有热滞效应、冰晶形态效应和重结晶抑制效应的蛋白质,存在于很多生物体内,这些生物一般生活在亚极带或南北两极等低温自然环境中。

研究发现,抗冻蛋白降低体液冰点的机制与盐离子不同,在其溶液中,冰点与融点温度不相同,抗冻蛋白的实
质是热滞蛋白。

各种抗冻肽和抗冻糖蛋白具有以下性质:¹冰点作用是非依数性的;º有热滞性,即表观冰点低于融点;
»热滞性的大小与AFP 浓度相关,但不是线性相关;¼热滞性所致的冰点降低值与溶液依数性所致的冰点降低值具有相加性[9]。

抗冻蛋白最初是在北极鱼的血清中发现的,这种蛋白能够与冰晶结合并控制其生长,在不影响细胞质渗透压的情况下降低血液的冰点,从而使鱼类免受冰冻伤害。

它是一族由三肽重复单元甘氨酸-甘氨酸-苏氨酸构成的聚合物,其中苏氨酸与一个二糖单位即葡萄糖-N -乙酰半乳糖胺相连接,糖基是抗冻活性的主要基团,亲水基团能与水形成氢键阻止
冰晶形成[9-10]。

与鱼类抗冻蛋白相比,关于植物AFPs 的研究较晚。

直到1998年,英国Yor k 大学的Da w 等首次在胡萝卜发现了AFPs 及其基因
[2]。

目前,已在多种植物中观察到抗寒蛋白
的合成,新合成的抗寒蛋白有47kD 拟南芥抗寒蛋白[11]
、39
kD 小麦抗寒蛋白[12]
等,它们的共同性质是:热稳定性,富含甘氨酸、低芳香族氨基酸和高亲水性氨基酸,可使蛋白质保持高度的可伸缩性以保护细胞由于低温引起的脱水作用。

2002年,Fa n 等在胡萝卜幼苗上进行PCR 扩增,克隆到1个1099bp 的抗冻蛋白基因,连上C a MV 35S 启动子,构建到pCA M BI A 2300载体上后转入烟草,0e 条件下,转基因烟草
所受的冻害明显低于对照烟草[13]。

这表明植物具有类似于鱼类的降低冰点、修饰冰晶形态和抑制冰重晶化等特性,在提高细胞在冰冻胁迫下的抗结冰能力中起着重要作用。

2 热激蛋白与植物抗冻性的关系
热激蛋白(H eat shock pr otei n ,H SP)又称热休克蛋白或应激蛋白,是细胞在应激原刺激下所生成的一组糖蛋白,广泛存在于各种生物体内。

热激蛋白是一个很大的蛋白质家族,根据其分子量而区分为H SP110、H SP90和H SP70等类群。

通常在高温刺激、冻害期、种子萌发期和成熟期均有相应的H SP 表达,与保持酶的活性和维持机体的稳定性有关。

一些因子如高盐、厌氧、水分胁迫、重金属离子、乙醇、营养饥
饿和脱落酸等都可以诱导H SP 的表达[14]
,如ER -H sp70就是
安徽农业科学,Jou r n al ofAnhu iAgr.i Sc.i 2010,38(12):6085-6086,6094责任编辑 姜丽 责任校对 卢瑶
在菠菜冷驯化过程中发现的一种热激蛋白,它在蛋白质的转运、折叠、装配和拆卸过程中起作用。

大部分H SP被鉴定为分子伴侣,参与植物的许多代谢调控过程。

冷驯化使植物体内产生具有分子伴侣功能的H SP,如在冷胁迫时在马铃薯、甘蓝型油菜、水稻和菠菜等植物中分别可检测到H SP90、H SP110和H SP70等系列热激蛋白的表达,部分热激蛋白还与脱水蛋白存在序列上的相似性,这能减轻冷胁迫对膜的损伤,减少溶质渗漏,抑制细胞脱水,从而增强了组织的抗冷性[15]。

W a ng等将35S Ca MV启动子驱动的番茄叶绿体小分子热激蛋白c DNA植物表达构架导入番茄,低温处理后发现,转基因番茄的冷害症状轻于未转基因的番茄,转基因番茄细胞电解质外渗较少[16]。

Colli ns等首先证实了H SP与抗寒性的直接关系;热激(40.0e,3h)诱导绿豆下胚轴H SP70和H SP79从头合成,减轻随后的冷胁迫(2.5e)对膜的损伤,使溶质渗漏减少,增强了组织的抗冷性;在2.5e下6~9d,热激诱导的耐冷性消失,同时H SP70和H SP79也降至对照(20.0e)水平[17]。

由此可见,虽然热激反应和冷驯化涉及不同的适应性反应,诱导产生独特的逆境蛋白,但不同逆境同样可以诱导相同的蛋白。

M aj ou l等用2-D电泳分离小麦胚乳总蛋白,并用MAL D I-T OF-MS技术鉴定了25个热诱导蛋白;随后从小麦非醇溶谷蛋白组分中分离出了43个蛋白,其中24个热上调蛋白,19个热下调蛋白;通过质谱技术分析,共鉴定了42个蛋白,其中5个热上调蛋白与L MW-H SP相似[18]。

这些研究均表明,叶绿体s mH SP的过量表达提高了植物抗寒性。

3脱水蛋白
脱水蛋白(Dehydratio n pr otei n,D HN)是植物在脱水、低温、冷冻、渗透胁迫、盐碱、脱落酸处理和种子成熟时积累的一个典型的植物蛋白家族,属于LEA D-11蛋白家族,是对多种逆境因子响应的一类逆境诱导蛋白。

脱水蛋白富含甘氨酸,不含半胱氨酸和苏氨酸[19]。

脱水蛋白的积累与植物细胞抗脱水力的形成有密切关系,并推测脱水蛋白的作用机理可能有3个方面:稳定膜系统;作为冰冻保护剂;抑制大分子的团聚。

脱水蛋白保护植物细胞中的大分子在脱水过程中不受伤害。

脱水素具有高度水合能力,它与膜脂结合能够阻止细胞内水分的过多流失,维持膜结构的水合保护体系,防止膜脂双分子层间距的减小,进而阻止膜融合以及生物膜结构的破坏[20]。

植物耐寒性的增强与低温驯化下脱水蛋白的合成密切相关。

脱水蛋白通过K片段形成的兼亲性A螺旋,为脱水蛋白的亲脂性提供了结构基础。

所以,脱水蛋白K片段的功能之一也许在于可以与部分变性蛋白质及膜的疏水区相互作用,从而防止蛋白质和膜进一步变性。

因而在低温诱导下,脱水蛋白的出现有助于提高植物在冰冻时忍受这种胁迫的能力,减少细胞冰冻失水,提高耐寒性。

如苜蓿的C A S18[21]和小麦的脱水蛋白WCS120、WCS200、COR39[22]都与晚期胚胎丰富蛋白同源性较高,在低温下可被诱导积累,细胞抗冰冻脱水能力提高,植物的耐寒性增强。

Zhu等研究大麦时发现,田间的脱水可诱导编码低分子量的D HN S基因的表达,可帮助植物细胞适应更强的冷害。

豇豆幼苗萌发时,冷胁迫可诱导表达一个脱水蛋白,具有耐冷作用[23]。

H ara等从柑橘中克隆得到CuCOR19基因,在离体叶片中该基因的相应mRNA水平只在低温胁迫条件下显著增加;将CuCO R19基因转入烟草中能增强烟草的抗低温能力并能有效阻止膜脂过氧化的发生[24]。

之后,他们还从柑橘果皮中分离到1种脱水素CuCOR15,它在低温条件下积累增加。

在马铃薯中,K irc h等发现1条胁迫诱导脱水素基因ci7,它在低温(4.0e)、干旱、高盐和外源ABA作用下都能诱导表达[25]。

在野生马铃薯中,还发现脱水素D HN24,其同时存在于未受胁迫的输导组织、顶端部分和块茎中,但不存在于叶片中;经过4.0e低温处理后,HN24蛋白含量在块茎、茎秆和顶端部分都显著增加,但在叶片中只有少量增加。

4展望
提高植物的抗冻性,培育抗冻作物品种对于农业具有十分重要的意义。

已研究的植物低温诱导蛋白虽多达几十种,但真正被分离纯化出来的低温诱导蛋白尚不多,而且绝大多数植物材料中蛋白的活性大大低于鱼类和昆虫。

因此如何从植物中分离出更多的、活性更高的低温诱导蛋白,并通过遗传转化将其导入抗冻性弱或不抗冻的植物中,进而获得抗冻性强的转基因植株,将是今后植物抗冻基因工程的主要研究内容之一。

植物抗冻基因研究中还有许多问题等待解决,但是完整的植物基因工程的理论和技术体系已基本建立,植物基因工程技术已开始走向商业化的发展道路,在不远的将来转入抗冻基因的植物将会得到飞速的发展。

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(下转第6094页)
所比材料之间没有一条共有酶带时S=0,计算结果见表3。

表3不同地区罗布红麻与罗布白麻酶带相似系数
Table3Si m il ar coeffi cient of isoe nzy me ba nds fro m differe n t breeds of Ap ocynu m venet u m i n different regi ons
材料编号M at eri alNo.(1)(2)(3)(4)
(1)1.000
(2)0.5711.000
(3)0.6670.6001.000
(4)00.2220.3641.000
由表3可知,新疆、内蒙古、宁夏地区之间的罗布红麻与罗布白麻过氧化物同工酶酶谱相似系数均大于50.0%,说明亲缘关系很亲近;新疆地区罗布红麻与宁夏地区的罗布白麻相似系数为0,说明无亲缘关系;内蒙古和宁夏地区的罗布红麻与宁夏地区的罗布白麻的过氧化物酶酶谱相似系数为22.2%、36.4%,说明亲缘关系较远。

3结论与讨论
罗布红麻是罗布麻属的一个种,在新疆、内蒙古、宁夏不同地区均匀分布,其过氧化物酶酶谱之间既具有相同点,又具有各自的特征。

并且3个地区的过氧化物酶酶谱清晰稳定,酶带数目较少,最多达到6条,最少出现3条,但酶谱谱型及其强弱差异十分明显,反映出罗布麻不同生态型之间遗传基础的相互联系与差异。

这与3个地区罗布麻不同生态型在形态学上的细微差异表现相一致。

罗布白麻是白麻属的一个种,酶谱分析共出现2种谱型,5条谱带,可作为品种鉴别的生化指标之一。

3个地区罗布红麻和罗布白麻过氧化物同工酶酶谱相似系数值为0~66.7%,说明它们之间有着较复杂的亲缘关系。

刘胜祥提出的亲缘关系等级划分标准为:S\0.5,很亲近;0.5>S\0.3,亲近;0.3>S\0.2,较亲近;0.2>S\0.1,较疏远;0.1>S\0.05,疏远;0.05>S\0.01,很疏远;S=0,无关系[8]。

根据此标准,该研究中,3个地区的罗布红麻与罗布白麻的过氧化物同工酶酶谱相似系数值大于50.0%,说明虽然在不同生态环境条件下,物种为了生存而发生适应性的变异,但仍然保留了其种的基本特性,亲缘关系很亲近。

宁夏地区的罗布白麻与新疆、内蒙古、宁夏地区的罗布麻之间的酶谱相似系数分别为0、22.2%、36.4%,说明它们之间的亲缘关系从无、较亲近到亲近,反映了2个物种之间的遗传背景差异,从宁夏地区2个物种的相似系数看,它们之间表现的亲缘关系亲近,可以推断2物种在同一地区、同一生态群落内存在种间花粉杂交的现象;内蒙古地区的罗布红麻与罗布白麻之间的亲缘关系较亲近的结果有待于进一步研究探讨。

彭雪梅等利用PCR产物直接测序法对罗布麻、大叶白麻和Apoacynum cannabinu m的核基因组(r DNA)I TS区与叶绿体基因组(c pD NA)tr nL内含子及trnL-F间隔区序列进行测序比较得出,同种内不同居群样品的tr nL与tr nL-F序列完全一致,而所有罗布麻与大叶白麻在此序列上存在稳定的碱基差别[9]。

因此,理论上可以鉴定罗布麻和大叶白麻。

这与该研究中不同地区罗布红麻与罗布白麻的不同生态型之间亲缘关系很亲近的试验结果相一致。

过氧化物同工酶是由单基因决定的同工酶,具有物种、组织器官和发育阶段的特异性,它在一定程度上能较好地反映不同种源间的遗传差异,作为基因存在和表达的一种生化指标,已在遗传学、分类学和生理学等学科中得到广泛应用[10-12],用作分类依据之一是有一定价值的,但遗传差异受多种因素影响,如果能同时将其他生理生化指标结合形态指标进行分析,则更能全面地反映遗传差异,更能对不同种源罗布麻作出合理评价。

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