脲酶快速检测方法(1)

脲酶的测定——精选推荐

一.液态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。

2.试剂2.1尿素:GB696，分析纯。

2.2酚红指示剂2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解；2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。

3.操作方法3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。

3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。

3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。

颜色出现时间脲酶活性1min 极强1～5min 强5～15min 稍有15min 无同时作空白对照试验。

样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，只有上述空白正常时，即酚红指示剂不改变颜色，试验结果才是可靠的。

一般企业认为7、8分钟变色较为合适。

二、半固态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。

2.试剂2.1稀硫酸（H2SO4）0.2N。

2.2尿素一酚红试剂2.2.1将1.2克酚红溶解于30ml0.2N的NaOH中；2.2.2用蒸馏水将之稀释至约300mL；2.2.3加入90g尿素（分析纯）并溶解之；2.2.4用蒸馏水稀释至2L；2.2.5加入14mL 1.0N的H2SO4或70mL o.2N的H2SO4；2.2.6用蒸馏水稀释至最后体积3L；2.2.7溶液应具明亮的琥珀色。

3.操作方法3.1在一个150ml的烧杯中倒入少量试剂，注意溶液必须呈明亮的琥珀色。

若溶液已转变为深桔红色，滴人稀硫酸溶液并搅拌之，直至溶液再度呈琥珀色。

3.2量一匙粉末样品，放置于培养皿中。

3.在样品上加入两匙试剂，轻轻搅拌，将样品平铺于培养皿中。

若仍有干样品斑点，则再加入试剂，直至将样品浸湿。

4.放置5分钟后观察：a. 没有任何红点出现：再任其放置25分钟，若仍无红点出现，说明大豆粉过熟。

b. 有少量红点：少量尿素酶活性，可用。

大豆制品中脲酶活性的测定

大豆制品中脲酶活性的测定
制作人：刘力、李亚杰
背景
大豆制品中含有大量抗营养因子，影响到动物的正常生长发育。其中最主要的是胰蛋白酶抑制因子，不耐热，但在点击添加标题生产加工过程中，过度的加热在灭活抗营养因子的同时，导致蛋白质变性，特别是赖氨酸、精氨酸和胱氨酸等严重点击添加标题变性，大大降低了大豆制品的消化率和生物学价值。抗胰蛋白酶活性是直接反映大豆制品中抗营养因子水平及加热程度的可靠指标，但由于该法费时、所用试剂昂贵，在生点击添加标题产上不适用。而脲酶活性与抗胰蛋白酶活性呈高度正相关，方法较简便、快速、经济，国内外常用脲酶活性作为检验点击添加标题大豆制品加热程度和抗营养因子水平的判断指标。
注意事项
若样品粗脂肪含量高于点击添加标题 10%，则应先进行不加热的脱脂处理后，在测定脲酶活性；点击添加标题称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；点击添加标题试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。点击添加标题
问题
反应时间（30min ）对脲酶活性是否有影响？点击添加标题
仪器设备
粉碎机：粉碎时应不生强热，如球点击添加标题磨机。
点击添加标题点击添加标题
点击添加标题
测定步骤
样品中脲酶活性的测定：称取0.2 g（准确至0.0001 g）样品（如果活性很
高，可称取0.05 g试样）玻璃试管中，加10 mL尿素缓冲液，立即盖好试管盖剧烈振摇后，马上置于30±0.5 ℃水浴锅内，准确计30 min±10 s。取下点击添加标题后立即加入10 mL盐酸（0.1 mol/L），振摇后迅速冷却至20℃，将试管内容物全部转入50 mL烧杯中，用20 mL蒸馏水冲洗数次，以0.1 mL的氢氧化钠标准滴定溶液用酸度计滴定至 pH 4.70。记录氢氧化钠标准滴定溶液消耗量。点击添加标题如果选用指示剂，试管中内容物全部移入250 mL锥形瓶中，滴加8~10滴混合指示剂，以0.1 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至蓝绿色，记录氢氧化点击添加标题钠滴定溶液消耗量。空白测定：称取样品后立即加入10 mL盐酸溶液，之后不加。

大豆中脲酶活性的测定

e.结果计算
UA＝14×C(V0-V)/(30×m) C——氢氧化钾标准溶液浓度， mol/L； V0——空白试验消耗氢氧化钾的体积， ml； V——测定试验消耗的氢氧化钾的体积，ml； m——试验质量，g。
比色法
原理：向含有EDTA二钠盐的PH=7的缓冲液的分析悬浮液中加入尿素溶液，在 30℃下保温5min，加入磷钨酸终止酶作用并沉淀蛋白质。产生的氨在次溴酸钠和麝香草酚作用下形成蓝色的靛麝香草酚，借以比色。
大豆饼粕中脲酶活性的测定
豆粕的蛋白质含量为45%左右，是一种优质的蛋白质饲料，但是由于其中的抗营养因子较多，极大的限制了豆粕在饲料中的应用。
大豆中的抗营养因子
胰蛋白酶抑制剂植物红细胞凝集素皂甙胃肠胀气因子植酸抗维生素致甲状腺肿因子
这些抗营养因子大多是不耐热的，
在大豆饼粕的加工过程中由于加热而失活，从而降低或者失去其有害作用，因此，在大豆加工生产饲用饼粕时，必须对大豆粕进行充分而又适当的加热，这样才能使其中的抗营养因子失活。
评价大豆饼粕的指标
脲酶活性：检测豆粕的加热程度是否足以破坏其中的抗营养因子的指标。蛋白质溶解度：反映豆粕是否加热过度的一个指标。
快速测定方法2
在培养皿上放入少量的豆饼粕，在样品上滴入少量指示剂并搅拌，将其平铺于培养皿中，放置5min后观察结果。无任何红点出现，再放置25min仍然无红点出现，说明豆粕过熟；有少量红点出现，说明脲酶活性较低，豆粕可用；样品表面有25％被红点覆盖，豆粕可用；样品表面有50％被红点覆盖，应慎用；样品表面有75％－100％被红点覆盖，脲酶活性过高，豆粕过生，不可用；
大豆中的抗营养因子?胰蛋白酶抑制剂?植物红细胞凝集素?皂甙?胃肠胀气因子?植酸?抗维生素?致甲状腺肿因子这些抗营养因子大多是不耐热的在大豆饼粕的加工过程中由于加热而失活从而降低或者失去其有害作用因这些抗营养因子大多是不耐热的在大豆饼粕的加工过程中由于加热而失活从而降低或者失去其有害作用因此在大豆加工生产饲用饼粕时必须此在大豆加工生产饲用饼粕时必须对大豆粕进行充分而又适当的加热这样才能使其中的抗营养因子失活

豆浆中脲酶活性的测定

表２准确度试验（一３ｎ）
０９９）．９２。结果表明：豆甙在００２．３ｍｇｍｌ大．０￣０００／范围内呈良好的线性关系，低检出限为００ｔ；最．４ｔｇ淫羊藿甙在００２０１ｍｇｍｌ围内呈良好的线．０￣．Ｏ／范
维普资讯
江苏预防医学２０年９月第１卷第３０２３期
ＪｎｓｒｄＳｐ２０，ｌ３Ｎ — ｉ￣ｕＦｅＭｅ，ｅ，０２Ｖｏ１，ｏ３ａ＇ｖ —．
பைடு நூலகம்
（ＮＨ４２３２ａＨ — ）ＣＯ＋ＮＯ
２２ＨＯ
２５０２０１）
【文献标识码】Ｂ【中图分类号】Ｒ一３【３文章编号】１０－９７（０２０－０６－００６００２０）３０３３【关键词】豆浆；酶活性；脲吸光度
豆浆营养丰富，但必须煮沸后才可食用。煮沸可防止豆浆中毒，但也破坏了多种营养物质。由于豆浆有“ 假沸” 现象，目前多以豆浆脲酶活性来表示抗营
［］张回剐，３曾红，徐绥绪，．效液相色谱法测定糖脂双降茶中等高淫羊藿甙的含量Ｅ］色谱，０１１（）３５３６Ｊ．２０，９４：６—６．
－１］王德先，４杨更亮，秀荣等．毛细管电泳法测定淫羊藿甙的宋ｐａＫ值及其在中药淫羊藿中的含量ｌ］色谱，０１１（）６— －．Ｊ２０，９１：４
６６．
２５准确度试验．

豆粕脲酶活性相关资料

另取比色管做空白试验，加入10ml尿素缓冲液，10ml0.1 mol/l盐酸。称取与上述试样量相当的试样，迅速加入比色管中，
立即盖好比色管并剧烈摇动，在30±0.5℃恒温水浴上准确保持30min，冷却到20℃，将比色管内容物全部转入烧杯，用水冲洗比色管2～3次，用标准氢氧化钠溶液滴定至PH＝4.7。
大豆中脲酶活性测定
为什么要测定脲酶？
脲酶毒性
一般脲酶并没有毒性作用，但在一定温度和pH值条件下，生大豆的脲酶遇水迅速将含氮化合物分解成氨，引起氨中毒。大豆中的抗营养因子：胰蛋白酶抑制剂最重要
评估胰蛋白酶抑制剂活性
大豆饼粕中胰蛋白酶抑制剂抑制动物的生长和引起胰腺肥大。而直接测定大豆饼粕中的胰蛋白酶抑制剂的活性比较困难、耗时。脲酶和胰蛋白酶抑制剂在加热时有相近的速率变性，并且脲酶对热的抵抗力比胰蛋白酶抑制剂强，又易于测定，所以常用脲酶活性指标来判断大豆饼粕加热的程度和估计大豆饼粕中胰蛋白酶抑制剂是否已经被破坏。
M＝m/(V×0.2042) 式中：m：邻苯二甲酸氢钾质量，g；
V：消耗氢氧化钠体积，ml。
滴定法（续）
操作方法
称取0.2000g试样，转入比色管中，加入10ml尿素缓冲液，立即盖好盖子并剧烈摇动。置于30±0.5℃恒温水浴上准确保持30min后立即加入10ml0.1mol/l盐酸，迅速冷却到20℃，将比色管内容物全部转入烧杯，用水冲洗比色管2～3次，立即用标准氢氧化钠溶液滴定至PH＝4.7。
我国《饲料用大豆》标准（GB1038489）规定：“饲料用大豆需加热后使用，尿素酶活性不得超过0.4”。台湾省标准为
0.02～0.3△pH 。
脲酶的测定方法
比色法滴定法 PH增值法快速检测法
比色法

脲酶活性

随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。

判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。

脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。

脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。

脲酶活性没有负值，最低为0。

在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。

国内很多大企业一般均采用0.2。

实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和pH增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。

目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。

一.液态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。

2.试剂2.1尿素:GB696，分析纯。

2.2酚红指示剂2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解；2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。

3.操作方法3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。

3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。

3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。

颜色出现时间脲酶活性1min 极强1～5min 强5～15min 稍有15min 无同时作空白对照试验。

样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，只有上述空白正常时，即酚红指示剂不改变颜色，试验结果才是可靠的。

脲酶测定试剂盒说明书

脲酶（Urease，UE）测定试剂盒说明书分光光度法50管/24样注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：UE能够水解尿素，产生氨和碳酸。

UE活性与有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关，反应了氮素状况。

测定原理：利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的NH3-N。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1ml比色皿、研钵、冰、和蒸馏水。

试剂的组成和配制：提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；试剂一：粉剂×1瓶，临用前加入5mL蒸馏水，充分溶解待用，4℃保存；用不完的试剂4℃保存；试剂二：液体12mL×1瓶，4℃保存；试剂三A液：液体×1支，4℃保存；试剂三B液：液体×1瓶，4℃保存；临用前将A液倒入B液中混合，待用；用不完的试剂4℃保存一周；试剂四：液体5mL×1瓶，4℃保存；样本的前处理：1、细菌、细胞或组织样品的制备：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。

8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至578nm，蒸馏水调零。

2、酶促反应试剂名称测定管对照管样本（μL）20 20试剂一（μL）90蒸馏水（μL）90试剂二（μL）190 190混匀，放入37℃水浴1h后，10000g 25℃离心10min，取上清液。

酶电极法测定发酵酒中尿素的含量

关键词：尿素；传感器；脲酶；电极；发酵酒文章篇号：１６７３．９０７８（２０１３）９．２２５８．２２６１
Ｄｅｔｅｃｔｉ０ｎ０ｆＵｒｅａＣｏｎｔｅｎｔｉｎＦｅｒｍｅｎｔｅｄＷｉｎｅｂｙｔｈｅＥｎｚｙｍｅＥｌｅｃｔｒｏｄｅ
Ａｂｓｔｒａ ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ｔ：Ａｒａｐｉｄａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｄｅｅｃｔｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｕｒｅａｉｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｗｉｎｅｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｂｙｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｕｒｅａ
ｍｅｍｂｒａｎｅＷａｓｔｈｅｎａｐｐｉｆｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅａｃｔｕａｌｓａｍｐｌｅｓ，ｃｏｍｂｎｅｉｄｗｉｈｔｔｈｅａｍｍｏｎｉｔｔｍｉｏｎｓｅｌｅｃｉｔｖｅｅｌｅｃｔｒｄ．ｏＴｈｅｕｒｅａｓｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｃｏｎｉｔｄｉｏｎｓｎｄａｈｅｔｒｅｓｐｏｎｓｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆｔｈｅｕｒｅａｓｅｎｓｏｒｗｅｒｅａｌｓｏｓｔｕｄｉｅｄ．Ｆｏｒｕｒｅｓｅａｅｎｚｙｍｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｉｔｏｎｐｒｏｃｅｓｓ，ｈｅｔｍｏｓｔｓｕｉｔａｂｌｅ

2019-2020学年浙科版生物选修一新素养同步学案：实验2 分离以尿素为氮源的微生物 Word版含答案

实验2 分离以尿素为氮源的微生物[学考报告]知识内容考试属性考情解读分离以尿素为氮源的微生物加试 1.进行微生物分离。

使用含有尿素的培养基，采用涂布分离法，分离有脲酶的细菌。

2.使用酚红指示剂检测以尿素为氮源的细菌的存在。

3.说明分离以尿素为氮源的细菌的实验原理。

4.举例说明本实验分离出来的细菌不一定都是以尿素为氮源的细菌一、以尿素为氮源的微生物1.尿素又称脲，是蛋白质降解的产物。

在人和其他哺乳动物如家畜的尿中都含有尿素，植物不能直接吸收尿素，因此大量尿素的存在将对环境造成污染。

2.以尿素为氮源的微生物这些细菌可以尿素为氮源，是因为其含有脲酶，通过降解尿素作为其生长的氮源。

其利用尿素的反应式为：(NH 2)2C ＝O ＋H 2O ――→脲酶2NH 3＋CO 2。

3.分离以尿素为氮源的微生物所依据的原理在氮源只有尿素时，这些微生物能利用尿素获得氮源而存活；而其他微生物却不能利用尿素，最终因为缺乏氮源而死亡。

二、从土壤中分离出以尿素为氮源的微生物实验1.实验目的(1)使用以尿素为唯一氮源的培养基分离含有脲酶的细菌。

(2)通过指示剂颜色的变化检知酶(脲酶)所催化的化学反应(培养基pH 的变化)。

(3)统计被检测的土壤中含有的以尿素为氮源的微生物的数量。

2.实验原理(1)用选择培养基(培养基类型)可分离出以尿素为氮源的微生物。

(2)在细菌分解尿素的化学反应中，细菌产生的脲酶将培养基中的尿素分解成氨，使培养基变碱，pH 升高，酚红指示剂变红。

(3)根据培养基中的菌落数，可统计土壤样品中含有的这种微生物的数量。

3.实验步骤(1)倒平板：在60 ℃左右时，将两只三角瓶中已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基，在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固。

(2)制备细菌悬浮液将土样1 g，在无菌条件下加到有99 mL无菌水的三角瓶中，振荡10 min，制成10－2稀释液；从该稀释液中取0.5 mL悬液加到4.5 mL无菌水的三角瓶中，经振荡就制成10－3稀释液；再从10－3稀释液中取0.5 mL悬液加到4.5 mL无菌水的三角瓶中，经振荡就制成10－4稀释液；依此法可依次制备出10－5、10－6……土壤稀释液。

食品安全快速检测法的应用

食品安全快速检测法的应用作者：陈娟来源：《科学导报·学术》2019年第05期食品安全作为现代社会中不可或缺的重要产业，关系到人民的身体健康和生命安全，也影响着社会的稳定和发展。

我们应该重视食品安全监管这一环节，从多个环节保证食品的安全生产与安全流通，并提出有效的措施来改善现状，特提供食品安全快速检验方法一、食品安全快速检测方法介绍（一）酶抑制快速检测法酶对化学农药残留物质具有较强的抑制作用，通过酶的抑制可将化学农药残留物质中农药、重金属等有害人体健康物质的残留程度表现出来。

对食品进行农药残留物检测时一般所选用的酶为植物酯酶或者是动物酯酶。

农药中的酰胺键同酶活性中心的丝氨酸键合；食品中重金属在检测时会有一些酶活性对重金属元素进行分解，酶活性元素分解重金属元素过程其实也是一种元素同元素的键合过程。

酶抑制法对食品安全进行检测其机理就是利用酶活性元素同被测元素键合作用来完成的检测工作的。

目前，酶抑制快速检测法在对食品安全检测应用中根据其检测方式不同可将其分为以下几种：1、光度法光度法是目前食品安全检测中检测农药残留程度比较常用的方法。

该检测方法的的原理是：选择合适的显色剂同酶的催化底物进行反应，在反应过程中观察固定时间内吸光度的变化情况，根据吸光度的具体情况对农药残留程度、残留成分进行定性和半定量。

该种检测方法体系比较稳定，易于实现规范化操作。

但基于不同的酶的活性和含量对农药残留的敏感性存在一定程度的差异，也会造成在检测农药残留时容易出现假阳性或假阴性现象。

但目前对这一技术难题还未突破，需要进一步加强研究。

2、试纸法试纸法是使用试纸将选择确定好的酶及底物固定，并将酶同底物两种紧密地接触，基于待测分组酶具有抑制作用，因此在酶同底物接触时候会产生不同的催化显色，根据催化显色对待测分组分含量进行判定。

试纸法快速检测法操作程序简单、效率高、成本低，比较适用于超市或农贸市场的蔬菜、瓜果等产品的检测。

该种检测方法的原理是对食品的纤维素通过脲酶和植物酯酶固定反应，根据不同数值段及反应情况对有害物质进行判断。

临床对解脲支原体(uu)的检测方法

临床对解脲支原体（uu）的检测方法(一)分离培养方法Uu在含95% 氮气和5%CO2 环境中生长良好。

其生长最适pH为5.5-6.5,最适温度为36℃-37℃。

Uu具有尿素酶，能分解尿素产氨，使含酚红指示剂的Uu液体培养基pH值上升，颜色由黄色变为红色。

再将液体培养物转种到Uu固体培养基上，能生长成具特征性油煎蛋样集落。

(1 )液体培养基：支原体肉汤培养基80mL，马血清或小牛血清10mL，酵母浸液10mL,10 %尿素溶液0.5mL-1.5mL, 0.4%酚红溶液0.5mL,青霉素(使其在培养基中的浓度为500U/mL-2000U/mL,)用1N HCl 调pH值至5.5-6.5, 用小试管分装后置冰箱中备用，每管1.5-2.0mL。

(2 ) 固体培养基：在100mL 支原体肉汤培养基中，加入琼脂1.2-1.4g, ,高压灭菌后冷却到50 ℃左右，逐一加入上述添加剂。

摇匀，倒入无菌平皿中，待凝固后，置冰箱中备用。

接种标本后，经孵育，若培养基发生由黄变红的颜色变化，透明无混浊(有别于某些细菌及真菌生长)则可初步判断为有支原体生长。

大多数Uu在24h内可获得阳性结果。

如果培养基发生颜色变化，但液体又有混浊，则应排除杂菌污染, 可用0.45μm滤膜过滤后，作再接种观察。

进一步诊断需将液体培养物接种到固体培养基上培养, 经Dienes法染色后在低倍显微镜下观察集落形态。

阴性结果最好观察５天。

Uu 在固体培养基上集落核心呈粗颗粒状,具极窄的边，有时呈油煎蛋样。

如用Dienes 法染色，集落为特异的蓝色。

一般细菌的菌落不着色，容易鉴别。

(二)代谢抑制试验根据特异性抗体能阻止支原体的生长和代谢这一特性，可用病人血清进行代谢抑制试验。

在加有抗血清的培养基中，支原体的代谢受到抑制，从而阻止了培养基的颜色改变。

代谢抑制试验也可用于检测感染支原体患者血清抗体的滴度。

即将血清作10倍连续稀释后，滴入支原体培养液，并以不加血清的支原体试验管和不加支原体液的培养基管作对照。

脲酶定性的实验

脲酶定性的实验随着膨化技术在饲料工业中推广普及,越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉,与其它蛋白资源一样,大豆的适度熟化非常重要,熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子,熟化度过高又会导致氨基酸利用率低.判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性.脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下,每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数.脲酶本身无营养意义,但它与抗胰蛋白酶的含量接近,并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似,因此,尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标.脲酶活性没有负值,最低为0.在我国现行的国标推荐值为0.3,在美国一般认为以不超过0.2为宜,并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12,当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受.国内很多大企业一般均采用0.2.实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂,有滴定法和pH增值法两种,已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等.目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性,一般来说,主要有如下两种方法.一.液态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨,会使酚红指示剂改变颜色.2.试剂2.1尿素:GB696,分析纯.2.2酚红指示剂2.2.1称取0.1g酚红,加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液,在研钵中研磨以促溶解；2.2.2转移至250mL定量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀备用.3.操作方法3.1取0.2g粉末样品,置于25mL比色管中.3.2加0.02g尿素,加酚红指示剂2滴,再加水20mL,充分摇匀15s.3.3记录粉红色出现时间,并根据时间判断尿酶活性,颜色出现时间应少于15min. 颜色出现时间脲酶活性1min 极强1～5min 强5～15min 稍有15min 无同时作空白对照试验.样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品),只有上述空白正常时,即酚红指示剂不改变颜色,试验结果才是可靠的.一般企业认为7、8分钟变色较为合适.二、半固态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨,会使酚红指示剂改变颜色.2.试剂2.1稀硫酸（H2SO4）0.2N.2.2尿素一酚红试剂2.2.1将1.2克酚红溶解于30ml0.2N的NaOH中；2.2.2用蒸馏水将之稀释至约300mL；2.2.3加入90g尿素（分析纯）并溶解之；2.2.4用蒸馏水稀释至2L；2.2.5加入14mL 1.0N的H2SO4或70mL o.2N的H2SO4；2.2.6用蒸馏水稀释至最后体积3L；2.2.7溶液应具明亮的琥珀色.3.操作方法3.1在一个150ml的烧杯中倒入少量试剂,注意溶液必须呈明亮的琥珀色.若溶液已转变为深桔红色,滴人稀硫酸溶液并搅拌之,直至溶液再度呈琥珀色.3.2量一匙粉末样品,放置于培养皿中.3.在样品上加入两匙试剂,轻轻搅拌,将样品平铺于培养皿中.若仍有干样品斑点,则再加入试剂,直至将样品浸湿.4.放置5分钟后观察：a. 没有任何红点出现：再任其放置25分钟,若仍无红点出现,说明大豆粉过熟.b. 有少量红点：少量尿素酶活性,可用.c. 样品表面约有25％为红点覆盖：少量尿素酶活性,可用.d. 豆饼表面约有50％为红点覆盖：尿素酶活性较高,不可以使用.e. 豆饼表面的75％－100％为红点覆盖：尿素酶活性很高,样品过生,不能使用. 以上两种简易脲酶活性估测方法在国内各饲料厂被广泛采用,尤其是后者在膨化大豆粉生产的在线检测上很普遍.尽管这两种方法原理一样,但是,因其操作过程差异,所以对膨化大豆粉品质的反映内容也不尽相同.三、液态法和半固态法之比较首先需要说明的是,这两种脲酶活性快速检测方法没有行业约定俗成的名称,笔者接触过的企业均只采用其中的一种方法,对前者可以称之为“试管法”,后者称之为“表面皿法”,根据其实施的过程及样品的状态,笔者将其区分为“液态法”和“半固态法”.从实施方法来看,液态法是过程检测,从开始一直到规定时间段结束,而半固态法属于断点检测,是5分钟后看结果；液态法通过控制各个体合格,总体自然合格,而半固态法要求的是总体符合统计学上的合格,即允许部分个体不合格.简单地说,液态法要求每一个微粒的熟化程度均要满足5分钟以内不变色,如果一个不合格,整个批次为不合格；而半固态法允许部分微粒在5分钟内变色,部分不合格,总体可以是合格的.从这点上来说,液态法对膨化大豆粉的品质要求更高,控制更严格,不仅要求熟化,而且要均匀熟化.举例说明,如果在熟化完全的大豆粉样品中掺入微量（可以是一粒）生大豆粉,液态法会立即变色从而判定为不合格,而半固态法只是增加了一个变色点,总体上仍是合格的.从上可以看出,这两种检测方法对膨化大豆粉品质的反映内容是不一样的.半固态法反映的是产品符合统计学上的合格,而液态法反映的是完全合格.这两种不同检测方法对膨化设备的要求也是有差别的,液态法要求设备能均匀熟化,而半固态法允许产品出现部分不合格,只要总体上符合就可以,对膨化设备的要求自然要低. 可能会有人疑问,膨化大豆粉出来的不都应该是均匀一致的吗?其实不然,物料在膨化机内受到湿、热、机械剪切的共同作用从而熟化,机械剪切对膨化大豆粉所起的作用大约能占三成多,如果结构设计上缺陷或部件磨损,就会导致熟化不均匀.目前湿法膨化大豆粉的出料温度大都在135度左右（对家禽和猪要求可能低点）,六年前,笔者曾遇到过膨化大豆粉出料温度在170度,用液态法检测仍不合格,出来的料有熟的,有褐变的,还有少许夹生的,如果用半固态法检测,估计就合格了.次年,一膨化厂使用某企业膨化机生产膨化大豆粉,因不熟被退货六十吨,根据大部分企业采用半固态法检测的情况,将其以一定比例掺入熟化料中,最终符合统计学上的合格.上述事件,大概就是这两种不同测定方法的实践意义吧.脲酶urease（水解酶）：脲酶试验原理：存在于大多数细菌、真菌和高等植物里.它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解.脲酶的作用是极为专性的,它仅能水解尿素,水解的最终产物是氨和碳酸.土壤脲酶活性,与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关.根际土壤脲酶活性较高,中性土壤脲酶活性大于碱性土壤.人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况.土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量,也可以通过测定未水解的尿素量来求得.本方法是测定生成的氨量.试剂：1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素,用水溶至100ml.3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水.将两溶液合并,用1mol/LNaOH将PH调至6.7,用水稀释至1000毫升.4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇,加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮,用乙醇稀释至100毫升（A）,存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）.将AB溶液保存在冰箱中.使用前将2溶液各20毫升混合,用蒸馏水稀释至100毫升.5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂,至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定.6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml,得到1ml 含有0.1mg氮的标准液标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml,定容至100ml,即稀释了10倍,吸取1,3,5,7,9,11,13ml移至50ml容量瓶,加水至20ml,再加入4ml苯酚钠,仔细混合,加入3ml次氯酸钠,充分摇荡,放置20分钟,用水稀释至刻度.将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定,以标准溶液浓度为横坐标,以光密度值为纵坐标绘制曲线图.取新鲜土壤7份,每份30g,装于棕色广口瓶中,先将1,3－二氯丙烯溶于丙酮（定量）,6份分别加入不同浓度均为1.5ml的1,3－二氯丙烯,使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500µg/g,另1份相应加入1.5ml的丙酮作为对照,然后调节土壤的含水量至最大田间持水量的60%（记录此时重量,以便补充水分）.放置于25℃恒温培养箱,培养后第0d、1d,5d,10d（前10d密封,后来测定的敞口）、20d,30d,40d,50d分别取土样检测脲酶的活性.取样前,反复旋转广口瓶,混匀土样,一个处理随机取3个重复.1) 称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中.2) 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟3) 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7）,并仔细混合4) 将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中,培养24h5) 培养结束后,用热至38摄氏度水稀释至刻度,仔细摇荡,并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中.6) 显色：吸取3ml滤液于50ml容量瓶中,加入10ml蒸馏水,充分震荡,然后加入4ml苯酚钠,仔细混合,再加入3ml次氯酸钠,充分摇荡,放置20分钟,用水稀释至刻度,溶液呈现（青定）酚的蓝色.7) 1h内在（（青定）酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽,于578nm处将显色液进行比色测定.8) 无土对照：不加土样,其他操作与样品实验相同.以检验试剂纯度,整个实验设置一个对照9)无基质对照：以等体积的水代替基质,其他操作与样品实验相同.每个土样都设此对照.结果计算：土壤脲酶活性以24小时后100g土壤中NH3－N的毫克数表示.M＝（X样品－X无土－X无基质）*100*10式中：M－土壤脲酶活性值X样品――样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数X无土――无土对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数X无基质――无基质对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数100 ――样品定容的体积与测定时吸取量的比值10 ――酶活性单位的土重与样品土重之比值注意事项：当脲酶活性为3-80微克NH3-N时,本法能获得可靠结果.当脲酶活性小于3微克NH3-N,培养时间需增至24小时（已经24h了）（计算时应考虑这一点）计算：脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的mg数表示.NH3-N（mg）＝a*2A：从标准曲线查得NH3-N毫克数2 ：换算成1k土的系数.。

大豆脲酶活性的两种不同测定方法的研究

烈摇动，于（００５）ｃ置３ ± ．ｃ恒温水浴中，０每隔５ｍｎ振摇ｉ
王忠艳，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：０７２ｌ２ｏ一ｌ一０
因子等．且当抗营养因子的含量超过动物的耐受范并围时还会影响到动物的健康和生产性能。为此．国我
１大豆粉样品．１将普通市售生大豆粉碎（非强热）４过０目标准分析筛。在１０ｃ分别处理０３６９１、５１、１４ｃ下、、、、２１、８２、
测定，可及时修订配合饲料生产过程中对大豆及其制
品的正确加工及使用方法．经济、有效地消除抗营养
因子的抗营养作用。
１材料与方法
同时，大豆中也含有影响动物对饲料中营养物质的消化、吸收和利用的抗营养因子，如脲酶、蛋白酶抑制胰
（Ｂ１３４８）定：饲料用大豆需加热后使用，６、２７、８８、４８ｉ，Ｇ０８－９规 “ 脲９７、５７、１８、７ｍｎ冷却后装入封口袋备用。
１２化学试剂．
大豆饼》准（Ｂ０７－８）《料用大豆粕》准标Ｇ１３９９和饲标ｆＢ０８－８）Ｇ１３０：９规定：大豆饼和大豆粕的脲酶活性都－－ “
２２３３３３４２、５、８、４、７、０、３、６、９、４４５１、４、７、０、３、６、５５６６６

豆粕尿素酶快速检验法

豆粕尿素酶快速检验法-酚红法一、原理酚红指示剂在PH6.4~8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶，在室温下可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断尿素酶活性的大小。

二、试剂1、尿素：AR2、酚红：0.1%乙醇(70%)溶液三、步骤称取0.2g试样（称准至0.01g）转入试管中，加入0.02g结晶尿素及两滴酚红指示剂，加20—30mL蒸馏水，摇动10S，观察颜色，并记下呈粉红色的时间。

2、1min内呈粉红色为活性很强，说明加热不够，不可接受这种原料，过生。

3、1—5 min内呈粉红色为活性强。

4、5—15 min内呈粉红色为有点活性，豆粕可用。

5、15—30min内呈粉红色为没有活性，豆粕过熟，营养损失严重，蛋白质量下降（一般在1—10 min内观察）通常10min以上不显粉红色或红色的大豆制品，其尿素酶活性即认为丧失。

附：尿素酶活性与呈色时间对照表油脂分析方法一、酸价的测定（GB 5530—85）酸价（酸值）是指中和1.0g油脂所含游离脂肪酸所需氢氧化钾的毫克数。

同一油脂，酸价高，表明油脂因水解而产生的游离脂肪酸多。

可直接说明油脂的新鲜度和质量的优劣。

1、原理油脂中的游离脂肪酸与氢氧化钾产生中和反应，从氢氧化钾标准溶液消耗量，可计算出游离脂肪酸的量。

RCOOH+KOH RCOOK+H2O2、试剂1．中性乙醚—乙醇（2∶1）混合溶液，临用前用0.1mol/L氢氧化钾溶液中和至微红色。

2．1%酚酞乙醇指示剂溶液。

3．0.1mol/L氢氧化钾标准溶液。

3、操作步骤准确称取试样3~5g置于锥形瓶中，加入混合溶液50mL，振摇溶解（必要时可水浴温热），加入3~4滴1%酚酞乙醇指示剂，用0.1mol/L氢氧化钾标准溶液滴定至淡红色且在30s内不褪色为终点，记下消耗的碱液毫升数。

4、计算酸价（mgKOH/g）=C×V×56.1÷m游离脂肪酸含量FFA%=C×V×M÷m式中c—氢氧化钾标准溶液的浓度，mol/L；V—消耗氢氧化钾标准溶液的体积，mL；56.1—与1mL1mol/L氢氧化钾标准溶液相当的脂肪酸的质量，mg；m—样品的质量，g。

快速脲酶实验报告

一、实验目的1. 学习快速脲酶实验的原理和方法。

2. 掌握利用快速脲酶实验检测尿液中的脲酶活性。

3. 了解脲酶在临床诊断中的应用。

二、实验原理脲酶是一种催化脲分解成氨和二氧化碳的酶。

在正常情况下，人体代谢产生的尿素在肾脏通过脲酶的作用分解为氨和二氧化碳，氨在肾脏内与碳酸氢盐结合，形成碳酸铵，然后通过尿液排出体外。

当肾脏功能异常时，尿素在体内积累，导致脲酶活性升高。

因此，通过检测尿液中的脲酶活性，可以间接反映肾脏功能。

快速脲酶实验采用比色法，利用脲酶催化脲分解产生氨，氨与对硝基苯酚反应生成黄色化合物，通过比色测定脲酶活性。

三、实验材料1. 实验仪器：分光光度计、微量移液器、移液管、试管、烧杯等。

2. 实验试剂：脲酶试剂盒、对硝基苯酚、盐酸、氢氧化钠、磷酸盐缓冲液等。

3. 实验样品：尿液。

四、实验方法1. 样品处理：取尿液5ml，加入10ml的磷酸盐缓冲液，混匀，静置10分钟。

2. 标准曲线绘制：根据试剂盒说明书，配制一系列脲酶标准品溶液，分别加入对应的试剂，按照实验步骤进行反应，测定吸光度，以脲酶浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 样品检测：按照标准曲线绘制步骤，将尿液样品进行处理，加入试剂，反应后测定吸光度。

4. 结果计算：根据标准曲线，查得样品对应的脲酶浓度，即为尿液脲酶活性。

五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：绘制标准曲线，线性范围为0.1～1.0 U/ml。

2. 样品检测：将尿液样品进行处理，加入试剂，反应后测定吸光度，查得样品对应的脲酶浓度为0.5 U/ml。

3. 结果分析：根据尿液脲酶活性检测结果，可以判断肾脏功能是否正常。

当尿液脲酶活性超过正常值时，提示肾脏可能存在功能障碍。

六、实验结论通过快速脲酶实验，成功检测了尿液中的脲酶活性，为临床诊断肾脏功能提供了有力依据。

实验结果表明，尿液脲酶活性与肾脏功能密切相关，对于早期发现肾脏疾病具有重要意义。

七、实验讨论1. 实验过程中，尿液样品处理和试剂配制要准确无误，避免误差。

酶标仪测脲酶实验报告

摘要：本实验旨在利用酶标仪检测脲酶活性，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）技术，研究不同条件下脲酶的活性变化。

实验结果表明，酶标仪能够准确、快速地测定脲酶活性，为相关研究提供有力工具。

关键词：酶标仪；脲酶；ELISA；活性测定一、引言脲酶是一种广泛存在于生物体内的酶，主要催化尿素分解为氨和二氧化碳。

脲酶在生物体内具有重要作用，如参与氮代谢、氮循环等。

近年来，脲酶的研究在农业、医药、环保等领域具有重要意义。

为了准确、快速地测定脲酶活性，本研究采用酶标仪进行ELISA实验，探讨不同条件下脲酶活性的变化。

二、实验材料与仪器1. 实验材料：- 脲酶试剂盒（包括标准品、酶联试剂、洗涤剂等）- 样品（如尿液、组织等）- 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）2. 实验仪器：- 酶标仪- 洗板机- 移液器- 低温离心机- 培养箱三、实验方法1. 样品处理：- 将样品按照试剂盒说明书进行稀释和预处理。

- 将预处理后的样品置于低温离心机中，离心5分钟，取上清液。

2. ELISA实验：- 将酶联试剂按照说明书进行配制，加入待测样品，进行酶联反应。

- 加入底物，进行显色反应。

- 加入终止液，终止反应。

- 使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度。

3. 数据处理：- 将实验数据与标准曲线进行拟合，计算脲酶活性。

四、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：- 以酶联试剂的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

- 标准曲线线性良好，相关系数R²>0.99。

2. 不同条件下脲酶活性变化：- 在不同pH、温度、酶浓度等条件下，脲酶活性存在显著差异。

- 在pH 7.4、温度37℃、酶浓度1 U/mL的条件下，脲酶活性最高。

3. 实验结果分析：- 本实验采用酶标仪进行ELISA实验，能够准确、快速地测定脲酶活性。

- 不同条件下脲酶活性存在显著差异，可能与酶的稳定性、活性位点暴露程度等因素有关。

五、结论本实验通过酶标仪ELISA技术，成功测定了不同条件下脲酶的活性。

基于脲酶-金纳米棒的双重放大免疫比色法快速检测食品中黄曲霉毒素B1

基于脲酶-金纳米棒的双重放大免疫比色法快速检测食品中黄曲霉毒素B1程慧;李诗瑶;彭青枝【摘要】该研究提出了一种免疫比色方法用于快速检测黄曲霉毒素B1.在最优条件下,以免疫磁珠为载体,脲酶-金纳米棒为探针,探针与抗体特异性结合的同时与尿素反应催化沉积外加铜离子产生的显色反应为定量基础,紫外吸收强度作为参考指标,测定样品中的黄曲霉毒素B1.结果表明,标准曲线的线性回归方程为Y=4.017+ 1.430 6X,相关系数为0.997,检测限为0.042 ng/mL,加标回收率在92.5％～120.8％之间,表明该方法精密度良好、检测结果可靠.故该免疫比色法可用于检测食品中黄曲霉毒素B1.%A kind of immuocolorimetry for rapid detection of aflatoxinB1 was ing immune magnetic beads as the carrier,urease-gold nanorods as the probe,probe and antibody specificity combined with urea reaction catalytic deposition and copper ion chromogenic reaction as the quantitative foundation,the intensity of ultraviolet absorption as reference index,the aflatoxin B1 in the sample was detected under the optimal conditions.The results showed that the linear regression equationof the standard curve was Y=4.017+1.430 6X,the correlation coefficientwas 0.997,the limit of detection was 0.042 ng/ml,the adding standard recovery rate was 92.5％-120.8％.It indicated that the method had good precision and reliable test results,which could be used for detection of aflatoxin B1 in food.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2017(036)012【总页数】5页(P158-162)【关键词】免疫比色法;金纳米棒;脲酶;磁珠;黄曲霉毒素B1【作者】程慧;李诗瑶;彭青枝【作者单位】湖北省食品质量安全监督检验研究院,湖北武汉430000;湖北省食品质量安全监督检验研究院,湖北武汉430000;湖北省食品质量安全监督检验研究院,湖北武汉430000【正文语种】中文【中图分类】TS207.5免疫比色法因其方便快捷近年来在真菌毒素检测方面的应用较为广泛。

四种食物掺杂的快速检测方法

四种食物掺杂的快速检测方法
一、奶粉掺杂淀粉快速检测
原理：淀粉遇碘呈特异性蓝色反应。

方法：取待检奶粉约5克置试管中，加蒸馏水约10毫升，在酒精灯上加热使奶粉溶解，冷却后加2％碘酒数滴。

若液面呈蓝紫色为掺有淀粉；颜色愈深，表示掺入淀粉愈多。

正常奶粉溶液加碘液呈黄色。

二、味精掺杂尿素快速检测
原理：生豆浆中含有大量脲酶，脲酶可分解尿素产生氨，使溶液变碱性，用pH试纸检测呈碱性反应。

方法：取待检味精少许，加蒸馏水约2毫升溶解，加50％生豆浆溶液2～3滴，立即用pH试纸检测。

若呈碱性反应为掺有尿素，颜色深度与尿素含量成正比。

正常味精为中性。

三、糖精掺杂白砂糖快速检测
原理：糖是碳水化合物，加热脱去水分子后，剩下的碳呈黑色反应，而糖精钠不是碳水化合物，则无此现象。

方法：取待检糖精少许置小试管内，在酒精灯上熔化后继续加热，若呈黑色为掺有白砂糖，正常糖精为无色。

四、山芋淀粉掺杂石膏粉快速检测
原理：石膏粉是由生石膏(CaSO42H2O)经加热163℃以上失水而得，又称熟石膏。

它微溶于水，不溶于醇，将其水的澄清液加少量的酒精，则析出白色沉淀。

方法：取待检山芋淀粉少许置试管内，加蒸馏水适量溶解，放置澄清或过滤澄清，取澄清液加少许酒精(或加60度白酒)。

若呈白色混浊为掺杂石膏粉，正常山芋淀粉为无色。