老鼠组织标本石蜡切片免疫组化实验的具体步骤及方法

老鼠组织标本石蜡切片免疫组化实验的具体步骤及方法

根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子结合在多聚酶上形成多聚物分子,其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。

1. 石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3’）。

2. 取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2×3’。（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定）

3. 每张切片加1滴3%H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3’。

4. 除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。

5. PBS冲洗3×5’。除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂，室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3’。

6. 除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5’。

7. 除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液（二氨基联苯胺），显微镜下观察5分钟。

8. 苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。

注意事项

1. 在切片加上一抗后，第二抗体标记多聚螯合物酶（HRP）的复合物与一抗结合，在多聚螯合物上有大量的HRP分子，使抗原信号有显著的放大，其敏感性较SABC、SP法高。

2. 由于多聚物在体内不存在，又不使用生物素，从而避免了由于生物素引起的非特异性背景染色，背景比SABC、SP法清晰。

3. 辣根过氧化物酶与二抗结合在多聚物上，替代传统方法的二抗、三抗，减少了实验步骤，且试剂孵育时间短，只需15分钟，使得免疫组化方法更简单，实验时间比SABC、SP法大为缩短。

一、特点

1. 在切片加上一抗后，第二抗体标记多聚螯合物酶（HRP）的复合物与一抗

结合，在多聚螯合物上有大量的HRP分子，使抗原信号有显著的放大，其敏感性较SABC、SP法高。

2. 由于多聚物在体内不存在，又不使用生物素，从而避免了由于生物素引起的非特异性背景染色，背景比SABC、SP法清晰。

3. 辣根过氧化物酶与二抗结合在多聚物上，替代传统方法的二抗、三抗，减少了实验步骤，且试剂孵育时间短，只需15分钟，使得免疫组化方法更简单，实验时间比SABC、SP法大为缩短。