免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)

免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法

一、原理及应用

免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。

二、操作步骤：

（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。

（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。

（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。

（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。

（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。

注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。微波法最为常用。（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。

（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。

（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。

（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。

（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。

（10）次日取出切片，室温下复温30min。

（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。

（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。

（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。（15）脱水：梯度酒精（由低到高）各5min → 二甲苯I 10min→ 二甲苯 II 10min。

（16）中性树胶封片。

三、免疫组化结果分析原则及具体方法

（1）必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。

（2）抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上; CK应定位在细胞浆内; PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内; EMA应定位在细胞膜上等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。

（3）阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分,有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。（4）尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。

（5）定性分析：即用“＋”和“－”来表示染色结果。可将实验组织分为阳性组和阴性组，然后对两组的其它指标进行统计分析。这种分类方法是最简单的一种，一般意义也较小些。

（6）半定量分析：即用“＋＋＋”、“＋＋”、“＋”和“－”来表示染色结果。其分组的标准在不同的文献中有不同的描述；一种是以着色细胞的密度来进行计算的：如阳性细胞占一个视野（高倍或低倍）中所有细胞总数的25％以下为“＋”，25％～50％为“＋＋”，>50%为“＋＋＋”；另一种是数量再结合着色细胞的颜色浓度来计算，在着色细胞百分率基本相同的实验中，“＋”为浅染的棕黄色（DAB染色），无明显颗粒；“＋＋”为较深的棕黄色，可见明显颗粒；“＋＋＋”为深棕黄色并且有浓染颗粒出现。

（7）定量分析：即用数字来表示染色结果。也就是在显微镜下（通常是高倍视野）计数阳性细胞个数（或者血管条数等等）。计数最好是两人或多人同时通过多人共览显微镜进行，并且要求有相同的计数标准。同一张切片选择多个视野（3～5个），然后取所有人的计数结果的平均值。这种方法较前一种为准确，但在视野的选择、计数的标准上也有一定的主观因素干扰。