含油土壤微生物修复技术

含油土壤微生物修复技术

一、国内外研究动态

1.1技术背景

石油是原油和石油制品的总称。原油是积累的有机物质经过地质变迁而形成的，主要由链烷烃、环烷烃、芳香烃以及少量硫化物、氮化物、环烷酸类等非烃化合物组成的复杂混合物，其中烃类占所有组分的95~99.5%，其化学组成、颜色和物理性状等随产地的不同而略有不同.【1】

石油是现代社会的最主要能源之一，石油工业在国民经济中占有十分重要的地位，也是国家综合国力的重要组成部分，因此世界各国十分重视石油工业的发展。【2】

在石油行业，土壤污染主要来源于油气生产、加工过程中产生的落地原油及含油污泥、钻井废泥浆以及含油污水处理产生的废渣等三部分。【3】石油进入土壤后,会破坏土壤结构，影响土壤的通透性，降低土壤质量；油污粘着在植物根系上，形成一层粘膜，阻碍植物根系对养分和水分的吸收，引起根系腐烂，影响农作物生长；石油富含的化学基团能与无机氮、磷结合并限制硝化作用和脱磷酸作用,从而使土壤有效氮、磷的含量减少，影响作物的营养吸收；【4】石油中的多环芳烃具有致癌、致畸、致突变等作用【5】。石油烃中不易被土壤吸附的部分能渗入地下污染地下水。

1.2含油土壤的处理方法

为了消除土壤中的石油污染，各国的研究人员进行了广泛的研究。处理含油土壤的物理和化学方法主要有焚烧法、固化法、热脱附法、溶剂萃取法、洗涤法等，这些方法存在价格较高、破坏土壤结构和组分、造成二次污染等问题，限制了应用范围。【6】

生物修复因其具有成本低、效率高、无二次污染、易操作等优点，被认为是有机污染物修复技术中最有效、最可行和最可靠的方法，越来越引起人们的关注。Hung-Soo Joo等人发现粉末状Candida catenulata 在23%食物残渣和77%柴油污染的土壤（2%柴油）培养13天后，84%最初的石油烃被降解，相比较没有接种的只有48%的降解率。【19】研究表明固定化细胞相比自由细胞有着很高的热稳定性，并且底物浓度明显的影响着降解的能力。【21】

3石油的微生物降解

.3.1微生物降解石油污染物的优势

动物、植物、微生物都具有降解污染物的能力，但微生物在污染物降解中的作用最大。这是因为微生物具有种类多、分布广、个体小、繁殖快、比表面积大、容易变异的特点。

3.2环境中降解石油的微生物

能降解石油烃的微生物非常多，有100余属，200多个各种(顾传辉等，2001)。一般认为，细菌分解原油比真菌、放线菌容易的多，更能有效地降解原油。降解

原油的微生物大量的存在于污染地区，比未受污染地区高出1-2个数量级。N. N. Pozdnyakova等发现真菌主要降解的是有芳香味的成分，而显微植物则强烈的降解链烷烃石蜡和石油烷烃成分。【20】Michael等(1998)利用rDNA限制性酶切片段多态分析(RFLP)对一被烃类污染的含水土层的微生物区系组成进行了调查，结果表明，在已确定的ro4个序列类型中，94个属于细菌，10个属于古细菌。Y. Higashioka等利用16s rRNA16S ribosomal RNA, xylM, C23O,和bcr基因分析来自两个不同原油污染的土壤样品细菌种群结构后发现，不同样品的种群结构明显不同。【22】

3.3石油微生物降解机理

石油中所含的各种烃类，从最简单的Cl化合物至复杂的几十个碳原子的固体残渣，只要条件合适，大多数都能被微生物代谢降解，但难易程度和降解速度不同。一般的石油化学物质按照下列方式被降解【7】

Lu Feng, Wei Wang在2007年发现了一种嗜热脱氮土壤芽孢杆菌“NG80-2具有独特的降解重油和产生表面活性剂的能力;发现了一种关键将重油的主要成分——长链烷烃降解为小分子的生化酶LadA。（PNAS）【28】

好氧微生物对烷烃分解的一般过程是逐步氧化，生成相应的醇、醛和酸，而后经β-氧化进入三羧酸循环，最终分解成CO2和H2O（图1）。最常见的氧化是链烷烃末端甲基氧化；乙酸在微生物代谢中被分解成为CO2和H2O；剩下的少去两个碳原子的脂肪酸按同样的方式经β-氧化再脱下两个碳原子，新生成的乙酸继续被分解成为CO2和H2O；依此类推，直至在氧的参与下全部烷烃分解完毕。烷烃类物质的β-氧化在某些环境中会受到阻碍，特别是一些带支链的烷烃类物质，这时就可能发生ω-氧化，即在β-氧化受阻时，微生物在烃链的另一端将甲基氧化。当然，ω-氧化在偶尔的情况下也会与β-氧化同时发生，即一个烃链的两端被同时氧化形成二羧酸。有些微生物攻击链烷烃的次末端，在链内的碳原子上插入氧。这样，首先生成仲醇，再进一步氧化，生成酮，酮再代谢为酯，酯键裂解生成伯醇和脂肪酸。醇接着继续氧化成醛、羧酸，羧酸则通过β-氧化进一步代谢。

不具备末端甲基的环烷烃由类似于上述次末端氧化的机制进行生物降解。如环已烷，由混合功能氧化酶的羟化作用生成环已醇，后者脱氢生成酮，再进一步

氧化，一个氧插入环而生成内酯，内酯开环，一端的羟基被氧化成醛基，再氧化成羧基，生成的二羧酸通过β-氧化进一步代谢。

大多数烯烃比芳烃、烷烃都容易为微生物利用。微生物对烯烃的代谢主要是产生具有双键的加氧氧化物或环氧化物，最终形成饱和或不饱和的脂肪酸，然后再经β-氧化进入三羧酸循环而被完全分解

芳香烃由加氧酶氧化为儿茶酚，二羟基化的芳香环再氧化，邻位或间位开环。邻位开环生成已二烯二酸，再氧化为β-酮已二酸，后者再氧化为三羧酸循环的中间产物琥珀酸和乙酰辅酶A。间位开环生成2-羟已二烯半醛酸，进一步代谢生成甲酸、乙醛和丙酮酸。

多环芳烃的生物降解，先是一个环二羟基化、开环，进一步降解为丙酮酸和CO2，然后第二个环以同样的方式分解。

近年来，对石油污染的厌氧处理开始引起国内外研究者的关注。与好氧处理相比，厌氧处理有优点也有缺点。在好氧条件下，低环芳烃会被好氧微生物降解，但四环以上的多环芳烃却无明显降解效果。厌氧微生物在NO3一、SO、Fe等作为电子受体的条件下，能降解部分好氧处理不能降解的物质。但厌氧菌的培养速度和对污染物的降解速度却比好氧处理慢得多【14】。

研究表明【15】，石油污染物在自然条件下的厌氧处理能否进行的关键在于厌氧微生物所处环境受石油污染的时间长短，这是由于土壤微生物需要对环境有一个适应的过程，污染时间越长，土壤微生物就越能适应，从而能产生出相应的降解酶。另外，电子受体对厌氧降解的影响也很大。研究表明，在有混合电子受体的条件下，更有利于石油烃的降解，故可通过加混合电子受体的方式加强修复。

3.4影响石油微生物降解的因素

影响生物修复技术的因素很多，除污染物自身的特性外，还包括土壤中微生物生态结构、土壤中的环境因子等。

石油烃类物质化学组成一般有4类:饱和烃、芳香烃、氮硫氧化合物及沥青质。各种烃类生物降解的难易不同。【8】通过大量的研究，通常认为不同烃类的微生物可降解性的次序为：正烷＞支链烷烃＞芳香烃＞环烷烃＞支链芳香烃，同种类型烃类中分子量越大降解慢；或者小于C10的直链烷烃＞C10～C24或更长的直链烷烃＞小于C10的支链烷烃＞C10～C24或更长的支链烷烃＞单环芳烃＞多环芳烃＞杂环芳烃。研究发现，碳数多少是影响石油烃组分降解的重要因素：C23烷的降解速度近似于石油烃的总体降解速度；碳数越大，降解越难进行；当碳数相同时，不同类型石油烃组分的降解速度由其官能团决定。总之，结构越简单，分子量越小的组分越容易被降解。

石油浓度对石油生物降解有很大影响，在较高的石油烃浓度下，由于营养、氧的传递限制或挥发性烃产生的毒性而抑制了生物降解。即使降解同一种石油污染物，降解方法或降解菌不同，最合适的石油烃浓度也会不同。Rambeloarisoa 等在1984年曾指出，原油的降解率与油浓度成反比例，Arco.等(2001)发现随石油浓度的升高，最终的降解率逐渐降低，降解率与石油浓度成负相关关系。【9】

环境中的pH变化对微生物的生命活动影响很大，与大多数微生物类似，能降解石油类物质的土壤微生物繁殖的适宜pH值为6-8。由于土壤微生物在降解过程中产生的酸性物质往往在土壤中有积累效应，会导致pH进一步降低，所以