表达人骨形成蛋白4的非复制型腺病毒的构建与鉴定

# 现在安徽医科大学第一附属医院急诊外科 通讯作者: 汪春兰, 教授, 硕士导师, 研究方向: 组织工程
中国修复重建外科杂志 2007 年 4 月第 21 卷第 4 期
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编码BM P 的基因转入靶细胞可以在骨缺损局部产生 并 持续释放 BM P , 诱导新骨的形成, 从而促进骨缺损 的修复, 更好地达到运用BM P 治疗的目的[ 3 ]。BM P 24 是骨诱导活性最强的 BM P 之一[ 4 ] , 构建一种表达人 BM P 24 ( hum an BM P 24, hBM P 24) 的腺病毒表达载体, 为进一步研究其在骨及软骨组织修复重建基因治疗中 的作用打下基础。
1 材料与方法 1. 1 材料 pCS2 ( + ) hBM P 24 质粒由波兰L udw ik H irszfeld
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用Pm e 酶切线性化, 无水乙醇回收。 回收产物用电穿 孔法转化含有腺病毒骨架质粒pA dEa sy 21 的E. co li BJ 5183 p 进行同源重组, 涂 Kana + LB 平板、 挑克隆、 摇 菌、 小量提取质粒。用 EcoR 、 B am H 、 Pac 分别对 重组质粒进行酶切鉴定。 将酶切证实正确连接的重组 质粒命名为pA dE hBM P 24, 用CaC l2 法转化至 E. co li DH 10B , 扩增后用 PEG 8000 大量制备和纯化质粒 pA dE hBM P 24, 电泳定量约 1 Λg Λl。 1. 2. 4 复制缺陷型腺病毒 Pac 酶切线性化重组的 腺病毒质粒 pA dE hBM P 24, 将酶切产物用阳离子脂 质 体 L ipofectam ine22000 转 染 至 培 养 密 度 约 90% 收集出现典 H EK293 细胞中, 逐日观察细胞病变效应。 型病变 ( 约 1 周左右) 的细胞及其培养上清, 反复冻融 后离心获取病毒液, 取原液及逐级稀释的病毒液接种 至新的 H EK293 细胞, 进行病毒扩增。
【Abstract】 O bjective To con struct a rep lica tion 2defective recom b inan t ad inoviru s includ ing the ta rget gene
hum an bone m o rp hogenetic p ro tein 4 ( fragm en t hBM P 24 ). M ethods T he hBM P 24 gene fragm en t w a s cu t dow n from pCS2 ( + ) hBM P 24, cloned in to the euka ryo tic exp ressive vecto r p cDNA 3. 1 ( + ) , then subcloned in to p Shu ttle2 CM V and tran sfo rm ed in to the com p eten t E. co li BJ 5183 p by electropo ra tion. T he resu lting recom b inan t p la sm id pA dE hBM P 24 w a s tran sfo rm ed in to the p ackag ing of the cell lines H EK293 to p roduce the rep lica tion 2defective recom b inan t adenoviru ses con ta in ing the hBM P 24 gene. T hese rep lica tion 2defective recom b inan t ad inoviru ses w ere tran sfected in to H EK293 and H eL a cells. T hen, to ta l RNA and to ta l p ro tein w ere detected by R T 2PCR and the W estern 2b lo t a ssay. Results T he pA dE hBM P 24 w a s confirm ed by the restrictiona l endonuclea se d igestion. In H EK293 and H eL a cells, the sp ecific tran scrip tion of the hBM P 24 gene w a s confirm ed by R T 2PCR , and the exp ression of the hBM P 24 p ro tein w a s confirm ed by the W estern 2b lo t a ssay. Conclusion T he rep lica tion 2defective recom b inan t ad inoviru s exp ression vecto r con ta in ing the hBM P 24 gene can be con structed and exp ressed successfu lly, w h ich ha s la id a founda tion fo r the fu rther resea rch on the genetherap y of hBM P 24.
1. 2. 5 R T 2PCR 检测 hBM P 24 基因转录 根据N CB I GeneB ank 中 hBM P 24 m RNA 的基因序列 (A ccession 下游引物 5′ 分别引 N o. U 43842) 设计并合成引物 ( 上、
研 究 所 的 Kochanow ska IE 教 授 惠 赠; A dEa sy A denovira l V ecto r Sy stem 、 p cDNA 3. 1 ( + ) 、 E. DH 10B、 E. co li BJ 5183 p 及 H EK293、 H eL a 细胞均 由安徽医科大学免疫学实验室保存提供。 限制性核酸 内切酶、 DNA M a rker ( T aKaR a 公司, 日本) ; T 4 DNA T rizo l L iga se、 SA P ( Sh rim p A lka line Pho sp ha ta se ) 、 及逆转录试剂盒A ccess Q u ickTM R T 2PCR ( P rom ega 公司, 美国 ) ; 脂质体转染试剂盒 L ipofectam ine22000 ( Invit rogen 公司, 美国) ; 鼠抗人 hBM P 24 单克隆抗体 购自 ( San ta C ruz 公司, 美国) ; ECL 检测的鲁米诺试 剂 和 氧 化 剂 ( P ierce 公 司, 美 国 ) ; 蛋 白 M a rker P resta ined P ro tein L adder (M B I 公司, 立陶宛 ) ; 引物 由上海 Sangon 公司合成。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 p cDNA 3. 1 ( + ) hBM P 24 扩增并提取质粒 pCS2 ( + ) hBM P 24, EcoR 单酶双切, 琼脂糖凝胶回 收 hBM P 24 基 因 片 段 ( 小 片 段 ) ; 扩 增 并 提 取 质 粒 p cDNA 3. 1 ( + ) , EcoR 酶切, 无水乙醇回收线性化产 物并用 SA P 去磷酸化处理。 将上述两步产物加入 T 4
CO NSTRUCT I O N AND
3
I D ENT IF ICAT I ON OF
REPL ICAT I O N-D EFECT IVE
RECOM B INANT AD INO V IRUS
EXPRESS ING HUM AN BO NE MO RPHO GENET IC PRO TE IN 4 W A N G X ingy u , W A N G C hun lan , ZH A O Y u , et a l.
RNA 和总蛋白, 进行 R T 2PCR 和W estern 2 b lo t 检测。 结果 获得了含有目的基因 hBM P 24 的非复制型腺病毒表达载
体 pA dE hBM P 24, 酶切鉴定提示构建正确, R T 2PCR 检测到 hBM P 24 基因的转录,W estern 2 b lo t 检测到 hBM P 24 蛋白表 达。 结论 将目的基因 hBM P 24 克隆至非复制型腺病毒表达载体中, 为进一步研究其在基因治疗骨缺损中的应用奠定 基础。 【关键词】 骨形成蛋白 4 非复制型腺病毒 基因治疗 中图分类号: R 78 Q 813 文献标识码: A
p cDNA 3. 1 ( + ) , 再亚克隆至 p Shu ttle2 CM V , 电转化至含有 pA dEa sy21 骨架质粒的 E. co li BJ 5183 p 中进行同源重组, 重
组质粒转染 H EK293 细胞包装成含有 hBM P 24 基因的非复制型腺病毒。 病毒颗粒感染 H EK293 和 H eL a 细胞, 提取总
骨形成蛋白 (bone m o rp hogenet ic p ro tein, BM P ) 是属于转化生长因子 Β( t ran sfo rm ing g row th facto r Β ,
) 超家族的多功能细胞因子, 迄今已分离出 20 T GF 2Β
BM P 还具有诱导多能间充质干细胞向成骨细胞和软
【摘 要】 目的 构建含有人骨形成蛋白4 ( hum an bone m o rp hogenetic p ro tein 4, hBM P 24) 的非复制型腺病毒表 达载体 pA dE hBM P 24 并检测其表达。 方法 酶切质粒 pCS2 ( + ) hBM P 24 获得目的基因片段, 克隆至真核表达载体
【Key words】 Bone m o rp hogenetic p ro tein 4 R ep lica tion 2defective recom b inan t ad inoviru s Genetherap y Founda tion item : N a tu ra l Science Founda tion of A nhu i P rovince ( 20042021)
2 安徽医科大学免疫学教研室
骨细胞分化的作用, 并且是已知的唯一具有异位成骨 能力的细胞因子。BM P 22、 24 和27 是其中仅有的能单 独促进体内异位成骨和体外新骨形成的因子[ 1 ]。 目前国内 BM P 是当前组织工程的研究热点之一。 外多采用高分子材料与基因重组技术生产BM P 复合 以促进骨缺损修复, BM P 早期呈爆发式释放, 随后浓 度很快下降至治疗水平以下, 其半衰期短, 难以持续发 挥作用, 且价格非常昂贵, 如何使BM P 持续高效地发 挥作用一直是骨组织工程的难点之一。 基因治疗是组 织工程近年来的研究方向, 将特定的基因转入目标细 胞, 使之能够合成由这段基因编码的蛋白质[ 2 ]。 通过将
余种。 分化、 凋 BM P 在胚胎发育期起着调节细胞生长、 亡、 趋化、 血管和基质生成等作用, 如: BM P 22 与心脏 发育有关, BM P 24 参与中胚层的形成, BM P 26 调节上 皮的增殖, BM P 27 在肾及输尿管的形成中发挥作用。
基金项目: 安徽省自然科学基金资助项目 (20042021) 作者单位: 1 安徽医科大学第一附属医院整形外科 ( 合肥, 230022) ;
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. 21, N o. 4 Ch inese Jou rnal of R eparative and R econ structive Su rgery, A p ril 2007, V o l
表达人骨形成蛋白 4 的非复制型腺病毒的构建与鉴定
王兴宇1# 汪春兰1 赵宇1 王帮河1 姚远1 朱华锋1 何金生2
D ep a rtm en t of P lastic S u rg ery , F irst A f f ilia ted H osp ita l of A nhu i M ed ica l U n iv ersity , H ef ei A nhu i , 230022, P. R . C h i2 na. E 2 m a il: w ang 2 w xy @ 126. com C orresp ond ing au thor: W A N G C hun lan