重组人骨形态发生蛋白2 骨修复材料的制备与性能剖析

中国组织工程研究 第20卷 第38期 2016-09-16出版

Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 16, 2016 Vol.20, No.38

·研究原著·

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刘启省，男，1986年生，山东省曹县人，汉族，同济大学在读硕士，中级工程师，主要从事生物医药与组织工程材料等相关工作。

中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2016)38-05664-08 稿件接受：2016-07-09

重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料的制备与性能

刘启省1

，张东刚2 (1

同济大学，上海市 200000；2

烟台正海生物科技股份有限公司，山东省烟台市 264000)

引用本文：刘启省，张东刚. 重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料的制备与性能[J].中国组织工程研究，2016，20(38):5664-5671. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.006 ORCID: 0000-0002-5916-6596(刘启省)

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文题释义：

重组人骨形态发生蛋白/骨修复材料：具有良好的生物相容性和力学性能，保留了自然骨的天然结构，重组人骨形态发生蛋白与骨修复材料特异性结合，克服了重组人骨形态发生蛋白在体内不易扩散和易降解的缺点，并实现重组人骨形态发生蛋白2的缓慢释放。能更好的满足创伤、感染、肿瘤及发育异常等原因所导致的骨缺损的修复要求，将在创伤修复领域特别是骨缺损的修复中发挥巨大作用。 骨形态发生蛋白2：主要对未分化间充质细胞和骨系细胞起到聚集和分化作用。在骨形成早期，骨形态发生蛋白2不仅可使未分化间质细胞向骨形成中心聚集并分化为骨细胞，而且可使成纤维细胞、成肌细胞及骨髓基细胞逆转分化为骨细胞。

摘要

背景：制备具有天然骨结构，能够结合生物因子的骨修复材料成为研究的热点。

目的：制备重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料，评估其释放、活性及诱导异位成骨的能力。

方法：首先制备含有胶原结合域的重组人骨形态发生蛋白2，然后将胶原结合域与骨修复材料中的胶原相结合，经过冷冻干燥制备重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料，采用ELISA 法检测重组人骨形态发生蛋白2的体外释放情况。将C2C12细胞滴加到重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料上(重组人骨形态发生蛋白2剂量分别为0.25，0.5，1 μg/块)，72 h 后检测细胞碱性磷酸酶活性。将含0，2，5，10 µg 重组人骨形态发生蛋白2的重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料分别埋置于SD 大鼠肌肉内，埋置2，4周后，检测磷酸酶活性与新骨生长情况。将CY7标记的重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料埋置于SD 大鼠后肢肌肉窝内，观察重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料的稳定性。

结果与结论：重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料内的重组人骨形态发生蛋白2在45 d 内基本没有释放；C2C12细胞的碱性磷酸酶活性随复合材料中重组人骨形态发生蛋白2剂量的升高而升高；重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料植入体内的稳定性较好，碱性磷酸酶活性、异位成骨随重组人骨形态发生蛋白2剂量的增加而升高。结果表明，重组人骨形态发生蛋白2/骨修复材料保证了重组人骨形态发生蛋白2的稳定性，使其不易释放，提高了其异位诱导成骨能力。 关键词：

生物材料；骨生物材料；重组人骨形态发生蛋白2；基因工程；骨修复材料；骨缺损；释放；异位成骨；

主题词：

骨形态发生蛋白质类；碱性磷酸酶；组织工程

缩略语：

骨形态发生蛋白2：bone morphogenetic protein2，BMP-2

Liu Qi-sheng, Studying for master’s degree, Intermediate engineer, Tongji University, Shanghai 200000, China

Preparation and properties of recombinant human bone morphogenetic protein-2/ bone repair material

Liu Qi-sheng 1, Zhang Dong-gang 2 (1Tongji University, Shanghai 200000, China; 2Zhenghai Biotechnology Limited Company of Yantai, Yantai 264000, Shandong Province, China)

Abstract

BACKGROUND: It has become a hotspot to prepare the bone repair material that exhibits natural bone structure and is used in combination with biological factors.

OBJECTIVE: To prepare the recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2)/bone repair material, and to evaluate its capacities of release, activity and ectopic osteoinduction.

METHODS: A collagen-binding domain was added to the N-terminal of native rhBMP-2 that allowed bind to collagens in the bone repair material. Then, rhBMP-2/bone repair material was obtained

through freeze-dried method. The releasing ability of rhBMP-2 in vitro was assayed by ELISA. C2C12 cell lines were loaded to the composite material with 0.25, 0.5 and 1 µg rhBMP-2, respectively.

Afterwards, alkaline phosphatase activity was detected at 72 hours. The composite materials with 0, 2, 5 and 10 µg rhBMP-2 were implanted into the quadriceps of Sprague-Dawley rats, respectively. Alkaline phosphatase activity and the newly formed bone were detected at 2 and 4 weeks after implantation. The CY-7-labeled composite material was implanted into the quadriceps of Sprague-Dawley rats to observe its stability.

RESULTS AND CONCLUSION: Substantially no rhBMP-2 from the rhBMP-2/bone repair material was released within 45 days. The alkaline phosphatase activity of C2C12 was in a rise with the increased concentration of rhBMP-2. The stability of the composite material in vivo was better, the alkaline

phosphatase activity and ectopic bone formation increased as the concentration of rhBMP-2 rose. To conclude, the rhBMP-2/bone repair material preserves the stability of rhBMP-2, and improves ectopic osteoinduction ability.

Subject headings: Bone Morphogenetic Proteins; Alkaline Phosphatase; Tissue Engineering

Cite this article: Liu QS, Zhang DG. Preparation and properties of recombinant human bone morphogenetic protein-2/bone repair material. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(38):5664-5671.

0 引言 Introduction

临床中骨缺损最常用的方法为自体骨移植和异体骨移植，自体骨供体的有限性及供骨区的相关并发症限制了其应用，增加了患者痛苦；而异体骨则具有较大的抗原性，容易产生剧烈的免疫排斥反应，导致植骨失败。因此，寻找和开发能够替代自然骨的人工骨修复材料，成为组织工程领域中一个亟需解决的问题。制备具有与天然骨结构、组分及功能均相似的仿生型骨支架成为骨组织工程中的研究热点[1]

。理想的骨修复材料应接近天然骨，在生物学性能上要求达到：①组织相容性好，置入体内后不产生免疫排斥反应；②有骨传导性：保持了天然骨的三维结构，有利用血管、神经的进入；③有骨诱导性：材料中有利于成骨的生物大分子并在新骨的生成过程中逐步降解

[2-3]

。

在已知的生长因子中，骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein2，BMP-2)的成骨作用最强。已有研究证实BMP-2对成骨细胞、软骨细胞的分化及功能具有重要的调节作用

[4-5]

，它能跨种诱导未分化间充质干

细胞向成骨细胞方向增殖和分化，促进成骨[6]

，使成纤维细胞具有成骨表型

[7-8]

。然而，BMP-2在体液中扩散快

速，半衰期短，容易酶解，治疗浓度降低快，不能持续刺激靶细胞以充分发挥其诱导活性。而通过提高BMP-2的使用剂量来促进成骨，则会因为剂量太高产生一系列并发症，可能导致组织肿胀、产生炎症，促进不期望的异位骨生成，还可在骨痂内形成囊肿样病变

[9-16]

。所以，

目前的研究热点是将BMP-2与载体结合，建立稳定的BMP-2释放系统，减少BMP-2的释放以维持植入位点局部浓度，降低并发症的发生率，使BMP-2能够发挥更大的作用

[17]

。

中国科学院戴建武等发现一段含7个氨基酸具有胶原靶向结合能力的寡肽，即胶原结合域(collagen- binding domain ，CBD)，将胶原结合域通过肽键与BMP-2的N 端结合，形成具有胶原靶向结合能力的重组人BMP-2，将重组人BMP-2溶于水与胶原浸泡时，重组人BMP2会通过其胶原结合域的氨基酸侧链与Ⅰ型胶原形成共价键实现结合，构建一种新的重组人BMP-2局部