大小型层析柱的装填实践介绍(中文)

TOSOH BIOSCIENCE GmbH
恒流速装填方法
Flow Packed Columns (Millipore-QuikScale+Moduline, GE Healthcare-BPG, Götec-Superformance, BioRadGeltec, etc.)
方法简介:
将柱底筛板用装填缓冲液润湿（赶走气泡） 任何时候，均需确保浆液在注入层析柱前进行过匀浆操作 匀浆液倒入后，立刻将分配器臵于储槽内浆液表面 分配器与溶液浆液间不应有气泡存在 阶段性调整装填流速至目标流速，以产生一个实时的、没有太大振动 的栓塞流 – 在最初的压实操作基础上，为进一步压实柱床，至少泵入5-10倍柱体 积的装填缓冲液 – 调整分配器至胶体表面 – 重复后两个步骤，直至柱床被彻底压实。最后将分配器移至距离柱床 2-5 mm 处（最后一次）。不要担心使用分配器的同时进行柱床的压 实操作！ – – – – –
TOYOPEARL的静臵时间
TOYOPEARL 粒径
Coarse Medium Fine Superfine C级规格: 100 µm M级规格: 65 µm F级规格: 45 µm S级规格: 35 µm 水中静臵时间 15-30 Min. 30-45 Min. 45-60 Min. 60-90 Min.
1 M NaCl in 50 mM phosphate, Tris, or acetate buffer
HIC Ether-650, Phenyl-650, PPG-600m, Butyl-650, SuperButyl550C and Hexyl-650c AFC AF-Tresyl and AF-Epoxy-650M AF-Formyl-650M, AF-Amino-650M and AF-Carboxy-650M AF-Heparin HC-560M AF-Chelate-650M AF-Blue HC-650M, AF-Red-650M
2M Na2SO4 or (NH4)2SO4 in 50mM phosphate buffer
0.5M NaCl in 0.1M NaHCO3 or phosphate buffer 1M NaCl in 100mM phosphate or NaHCO3 buffer 2M NaCl in 20 nM phosphate buffer 0.5M NaCl or 0.2M glycine in 20mM phosphate or Tris buffer 2M KCI or NaCl in 20mM phosphate
使用约1.1倍柱体积的静臵胶
使用约1.2倍柱体积的静臵胶
使用约1.25-1.4倍柱体积的静臵胶
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主要装填方法
o 恒流速装填法 o 恒压装填法 o 辅助的重力沉降装填法
不同装填方法的特点
装填方法 装填速度 流速范围 重复性 泵 压力计 恒流速 快 可增大至较高 很好 恒速 需要 恒压 快 可增大至较高 很好 恒压 需要 重力沉降 慢 只能慢操作 好 蠕动泵 不需要
40 – 150
40 – 150 400 – 600 800 – 1000 800 – 1200 700 – 1000 800 – 1200 400 – 600 800 – 1000 800 – 1200 800 – 1000 800 – 1200 800 – 1000
15 – 30
15 – 30 45 – 65 80 – 130 80 – 600 80 – 240 80 – 500 45 – 65 80 – 130 80 – 500 80 – 130 80 – 500 30 – 130
装填
管路清洗
运行
卸料
优点：易于装填 弱点：填料用量较大, 卸料可能较难, 有剪切力发生, 卸料会导致大量的浆液体积
Resolute
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恒压装填方法
Radial Flow - “Self Packer” - preset column volume (Proxcys-CRIO)
- 这些装臵会磨碎树脂填料并产生小颗粒
☆ TOYOPEARL是一种刚性强的树脂填料，装填时务必 区别于一般的软式琼脂糖凝胶
Superformance / Götec
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TOYOPEARL树脂填料的装填
基本步骤
TOYOPEARL出货时为悬 浮液状态（含20%乙醇）
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TOYOPEARL树脂填料 大小型工业制备色谱柱的装填实践
Götec
GE Healthcare
Pall
Pall-Euroflow / Resolute A. Sprauer – 5/06
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TOYOPEARL树脂填料的装填
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匀浆准备
利用量筒测量静臵胶体体积或使用水泵抽滤浆液至湿滤饼后 计算装填所需要的填料体积 通过添加装填缓冲液调节浆液浓度:
流动式装填柱 ~ 40 - 70% (v/v) 自动装填柱 20 - 60% (v/v)
最终装填好的柱床体积是要小于装填前胶体静臵体积或抽干 的湿滤饼的体积
F (45 um)
HW-75 IEC DEAE-650, SuperQ-650 CM-650, SP-650 2,2 x 60 2,2 x 20 F (45 um) S (35 um) M (65 um) C (100 um) SP-550, QAE-550 MegaCap II SP-550 HIC Ether-650, Phenyl-650, Butyl-650 2,2 x 20 2,2 x 20 2,2 x 20 C (100 um) EC (100-300 um) S (35 um) M (65 um) C (100 um) PPG-600, Butyl-600 SuperButy-550, Hexyl-550 AFC AF-Amino-650, AF-Carboxy-650 AF-Formyl-650, AF-Epoxy-650 AF-Tresyl-650, AF-Chelate-650, AF-Blue HC-650, AF-Heparin-HC-650 AF-Red-650 2,2 x 20 2,2 x 20 2,2 x 10 M (65 um) C (100 um) M (65 um)
Slurry preparation in the column Settling resin Slurry preparation in a separate tank
Amicon Moduline-120cm ID
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对于给定的柱子，装柱所需的静臵胶体积
Toyopearl HW-40, HW-50, HW-55 HW-65 and HW-75F Ether-650, Phenyl-650 Butyl-650, DEAE-650 Super-Q-650, CM-650 SP-650 and all Affinity QAE-550C and SP-550C
显微镜微观显示 – Toyopearl 650 M Amicon Moduline-120cm ID
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装填缓冲液的平衡
在去除小颗粒时的最后一次步骤中可加入装填缓冲液进行填料的 平衡 最好根据实际生产中所使用的缓冲液选取合适的装填缓冲溶液
一般来讲，分离纯化工艺中将使用到的最高离子强度的流动相是 装填缓冲液的首选
HW-55S QAE-550C DEAE-650M
300
2000
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恒流速装填方法- 扰动（由入口处筛板下气泡而引起的）
气泡会由于切换阀、管路连接处、 Götec/Superformance 20cm ID Column 活塞运动、未脱气缓冲液而引起........
去除小颗粒
装填缓冲液平衡
匀浆准备
装柱
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小颗粒的去除
装柱前务必进行小颗粒去除的操作!
• 小颗粒的存在会阻塞筛板或烧结板，并最终会导致整个柱子的压降增大
小颗粒的去除采取悬浮静臵移注法 重复这一步骤不少于3次
借助显微镜可检 查小颗粒的存在
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CRIO - Colonne Radiale InOxidable
o Low space requirements – only 0,5~1 m2; even 600 liter BV is mounted on wheels o Large inlet surface area – cotrolled & gentle product application (“Natural Distribution”). o Thin frit keeps the resin together – it is not used as flow distributor –> a barrier of only ~60um – negligible influence on pressure generation
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恒压装填方法
Horizontal Flow - “Self Packer” - preset column volume
(Pall/Euroflow-ResoluteTM, Millipore-IsoPakTM, GE Healthcare-Chromaflow, Eastern River)
– 这一操作可以将填料装得最为紧密，并且可以防止死体积的发生或胶体内沟槽 的出现。
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TOYOPEARL-典型的装填缓冲溶液
SEC HW-40, HW-50, HW-55, HW-65 and HW-75 IEC DEAE-650, QAE-550C, Super-Q-650, CM-650, SP-550C, MegaCap II SP-550EC and SP-650 0.1M Na2SO4, NaNO3, or NaCL in 50mM phosphate or Tris buffer. Organic solvents may be applied to HW-40 as adsorption chromatography like Sephadex LH-20.
内容提要 装填前的准备工作
– 小颗粒的去除 – 缓冲液平衡 – 匀浆准备
装填步骤 / 层析柱类型 层析柱的操作
– 柱子的平衡与柱效评价 – 保存
Peak Biotech
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TOYOPEARL树脂填料的装填
装填的一般原则
☆TOYOPEARL的装填压力最好在0.5 - 5 bar的范围内 ☆装填流速至少比实际操作流速高50% ☆不要使用会产生剪切力的装臵（如：磁力搅拌器、 齿轮泵）
Millipore Quik Scale
Baidu Nhomakorabea
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实验室规模最优化的装填及柱操作流速
模式 填料类型 柱尺寸 [cm ID x L] SEC HW-40 2,2 x 60 S (30 um) F (45 um) C (75 um) HW-50 2,2 x 60 S (30 um) F (45 um) HW-55 2,2 x 60 S (30 um) F (45 um) HW-65 2,2 x 60 S (30 um) 填料等级 装填流速 [cm/h] 30 – 40 60 – 80 120 – 160 25 – 35 50 – 70 25 – 35 50 – 70 20 – 75 操作流速 [cm/h] 10 – 25 25 – 50 50 – 100 10 – 20 25 – 35 10 – 20 25 – 35 10 – 15
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恒流速装填方法
恒流速装填法中流速的增加量举例：
柱尺寸 (I.D. x L) 2.2 cm x 60 cm 9 cm x 30 cm 25 cm x 30 cm 填料类型
目标流速 (ml/min)
2
增加量 (ml/min) 0.5 50 500
保持时间 (min) 0.5 2 2