RNA核酸酶RNA诱导的沉默复合体

2、条件型基因敲除：
完全基因敲除往往导致胚胎死亡；而条件型基因敲除，由 于具有可调节性而受到科学家的重视。
特点：常将正向选择标记neor置于内含子中。
6. 2. 2 高等动物基因敲除技术
真核生物基因敲除的技术路线主要包括： 构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法 把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中。 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生 同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源 基因组中并得以表达。 主要实验流程及筛选步骤：
真核生物转录调控因子具有组件式结构（modular） 特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立 的结构域。
其中DNA结合结构域（binding domain，BD）和 转录激活结构域（activation domain，AD）是转 录激活因子发挥功能所必须的。
DNA结合结构域（BD）能与特定基因启动区结合， 但不能激活基因转录。
同的ⅡS类标签酶（MmeI），并将程序做了相应修
改。
6. 1. 2 RNA的选择性剪接技术
RRT-NPAC的R：选把择R性N剪A提接取是后指反用转不录同成的c剪DN接A方，式并从以一其个为 模m板R进NA行前的体PC中R产反生应不。同的mRNA剪接异构体的过程。
可分为： •平衡剪切； •5’选择性剪切； •3’选择性剪切； •外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。
首先用正向突变引物（M）和反向引物（R1），扩增模板 DNA产生双链大引物（PCR1），与野生型DNA分子混合 后退火并使之复性，第二轮PCR中加入正向引物（F2）， 与PCR1中产生的一条互补链配对，扩增产生带有突变的 双链DNA。
6. 2 基因敲除技术
6. 2. 1 基本原理
经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体 的表型出发，研究其基因型，进而 找出该基因的 编码序列。 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首 先从基因序列出发，推测其表现型， 进而推导出 该基因的功能。
连接10-50个标签进 行克隆，测序，分析
LongSAGE技术
传统的SAGE技术用14个碱基的标签代表一个基因并 不能覆盖人类基因组内所有的基因序列，因而又发 展了LongSAGE技术。
LongSAGE标签来自转录物3’端一段21bp的序列， 可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。
其原理与传统的ShortSAGE方法类似，只是用了不
RNA原位杂交：一般用放射性或非放射性 （如地高辛、生物素等）标记的特异性探针 与被固定 的组织切片反应，若细胞中存在 与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双 链RNA，就可通过放射性标记或经酶促免疫 显色，对该基 因的表达产物做出定性定量 分析。
用组织原位杂交技术检测棉花纤维特异基因 的表达
将正向选择标记 neor置于载体中
与ES细胞重组
筛选重组后的ES细胞
显微注射筛选后 的ES细胞
注入母体
回交
胚胎干细胞 (embryonic stem cell,ES)
模式动物 小鼠中完 全基因敲 除的主要 技术策略 与应用。
重组载体中的DNA整合到 内源基因组中得以表达
显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔 法命中率比显微注射低，操作使用方 便。
RNAi的命名来源于安德鲁·法尔1998年在《自然》 杂志上的论文。
双链小RNA
初始转录产物 降解细胞内同源mRNA
RNAi作用 机制示意 图。
核酸酶
RNA诱导的沉默复合体 （RISC）的核蛋白体
siRNA
RISC介导切割
mRNA被降解， 翻译受抑制
研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引发与之 互补的单链RNA（ssRNA, single- stranded RNA） 的降解。 经过Dicer（一种具有RNAase III活性的核酸酶）的 加工，细胞中较长的双链RNA（30个核苷酸以上） 首先被降解形成21～25个核苷酸的小分子干扰核糖 核酸（siRNA，short interfering RNA ），并有效 地定位目标mRNA。
能蛋白编码基因；
图6-16 从拟
验证反式转录调控因子的DNA结合结构南库域；中芥筛cD选N与A文顺
准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序式列元。件DRE结
由量于极该低方且法用的生敏物感化和学可手靠段性难，以已纯被化广的泛那用部合基图于分本的。克转转流隆录录程细调因示胞控子意中因含子。
6. 3. 2 酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）
常用RT-PCR法（反转录PCR）研究某个基因是 否存在选择性剪切。
平衡剪切 5’选择性剪切 3’选择性剪切
外显子遗漏型剪切 相互排斥性剪切
一般用RT-PCR法研究一个基因是否存在选择性剪接。选择性剪 接使一个基因翻译为多种蛋白质序列。分析人类基因组数据发 现60%的基因在表达中可通过选择性剪接产生各种形式的 mRNA。
条件型基因敲除：指通过定位重组系统实现特定时 间和空间的基因敲除。
关于基因敲除技术，噬菌体的Cre/Loxp系统、 Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和 R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统， 尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
1、完全基因敲除：
Neo基因有双重作用：①形成靶位点的插入突变；②作为
该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变编 码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基 对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影 响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰 表达载体、引入新的酶切位点等。
迄今尚未建立用于精确预测特定氨基酸变化对整个 蛋白结构及活性影响的模型，即使了解一个蛋白质 的三维结构，也无法了解某个氨基酸残基对其的影 响。而基因定点突变为进一步了解蛋白质的结构与 功能的关系提供了重要的手段。
由T-DNA介导 目的基因片段
整合
LB为插入载体的引物 已知序列
导致基因失活 通过设计引物分离靶基因
PCR 产物 电泳 结果
a.引物设计。LP 和RP分别代表插 入基因两端的引 物，LB 是指载体 上的一段 引物， 目的基因片 段 (设为900bp)。 旁邻序列是经测 序后获得的DNA 序列。
b，PCR产物电泳 结果。分别代表 野生 型、杂合子 和纯合 子PCR条 带。
该基因编码一个神经无轴突定向受体，4号外显子有12个变异体， 6号外显子有48个变异体，9号外显子有33个变异体，17号外显 子有2个变异体。推测该基因共有12×48×33×2=38016剪接 异构体。
பைடு நூலகம்
6. 1. 3 原位杂交技术
原位杂交( In Situ Hybridization，ISH) 是用标记的 核酸探针，经放射自显影或非放射 检测体系，在 组织、细胞、间期核及染色体 上对核酸进行定位 和相对定量研究的一种手 段，分为两大类： •RNA原位杂交 •染色体原位杂交
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)
首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记， 然后 用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结 合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来 确定该DNA序列在染色体上的位置。
6. 1. 4 基因定点突变(site-directed mutagenesis)
基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶：
通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组， 进行精确的定点修饰和基因改造，具有 专一 性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗 传等特点。
基因敲除分为： •完全基因敲除 •条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）
完全基因敲除：指通过同源重组法完全消除细胞或 者动物个体中的靶基因活性；
正向筛选标记。
取代型
插入型
由于基因转移的同源重组自然发生率极低， 动物的 重组概率约为10-2～10-5，植物的概率为10-4～10-5， 即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞 中筛选出真正发生 了同源重组的胚胎干细胞。
所以，得用多种PCR及Southern杂交等多种分子筛 选技术验证所获得的确实是目的基因被敲除的细胞 系。
以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达模式的 技术。
任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种 特异性的转录产物。因此，可用特定限制性核酸内切酶 分离转录产物中具有基因特异性的9-10个碱基序列并制 成标签。
将10-50个序列标签连接、克隆、测序后，根据其占总 标签数的比例即可分析所对应编码基因的表达频率。
转录因子与顺式作用元件结合，激活最基本启动子Pmin， 使报告基因表达。若接入3个以上顺式作用元件，可增强 转录因子的识别和结合效率。
结构域
二者融合 导入酵母 细胞
上游
启动子 下游
酵母单杂交体系主要用于：
确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用；
分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功
由不同转录调控因子的BD和DNA转录激活结构域 AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。
AD BD
杂合蛋白
激活转录功能
6. 3. 5 RNAi（RNA interference, RNA干涉） 技术及其应用
RNAi技术：利用设计的双链小RNA高效、特异性 降解细胞内同源mRNA，从而阻断靶基因表达， 使细胞出现靶基因缺失的表型。
分离提取合成cDNA
用锚定酶AE消化
分3ˊ端酶切两份，分
别与ⅡS类TE标签酶
识别位点结合。
标签酶TE酶切
末端补平
连接两份，根据接头1、 2设计引物进行PCR
得到双标签，分 离纯化串联入载体。
常规SAGE 方法（short SAGE）基本 流程
连接子1和连 接子2的5ˊ 端分别加有 氨基，以防 止5ˊ端相 连接。
分子生物学基本研究法 （下）—基因功能研究技术
•基因表达研究技术 •基因敲除技术 •蛋白质及RNA相互作用技术 •基因芯片及数据分析 •利用酵母鉴定靶基因功能 •其他分子生物学技术
6.1 基因表达研究技术
6. 1. 1 基因表达系列分析技术（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）
6. 3 蛋白质及RNA相互作用技术
6. 3. 1 酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system）
是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之 间相互作用的新技术，可识别稳定结合于DNA上 的蛋白质，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋 白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接 获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。
胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定 了哺乳动物基因敲除的技术基础。
6. 2. 3 植物基因敲除技术
T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广 报告泛基的因基：因是敲一除种手编段码。可被检测的蛋白质或酶的基因，是 一个表达产物非常容易被鉴定的基因。
利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基 因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段 DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基 因的表达，从而使该基因“失活”。 T-DNA：是农杆菌Ti或Ri质粒中的一段DNA序列，可以从 农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中，已成为植物 分子生物学中广泛应用的遗传转化载体，是Ti质粒上的片 断。Ti质粒因为自身一些优点很适合作为导入外源基因的 载体。
70年代 初， Smith等 建立了体 外寡核苷 酸介导的 DNA 突 变技术， 提高了突 变效率。
目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大 引物诱变法，在基因序列中进行定点 突变。 重叠延伸介导的定点诱变机制：
图6-7 重 叠延伸介 导的定点 诱变机制
FMR2
RMF2
首物然区发先R后2生模，）退板在及火DP引CN，物RA按3分对反虚别2应（线与中正所引变向示物性引进对后物行1的（F延2正F伸和M向，反R诱2形向和变成诱R引全变M物F长引2F双物片M链R和 段MD反在）N向重A退。引叠 火，通过PCR1和2反应扩增出两种靶基因片段。
将已知顺式作用元件构建到最基本启动子 （minimal promoter，Pmin）的上游，把报告基 因连接到Pmin下游。
将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结 构域（transcription-activating domain, AD） 融合 表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺 式作用元件相结合，就能激活 Pmin启动子，使报 告基因得到表达。