组织细胞培养

组织细胞培养概述组织细胞培养一般泛指所有的体外培养，包括组织培养、细胞培养和器官培养。

其中，组织培养（Tissue Culture）指从活体内取出组织，模拟体内生理环境，在体外无菌、适当温度和一定培养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能的方法。

细胞培养（Cell Culture）则是指离散细胞的培养，这些细胞通过酶学的、机械的或化学方法从来源组织中获得，培养物是单个细胞或细胞群。

器官培养（Organ Culture）是指以器官的原基、器官的一部分或整个器官为培养物，应用与组织培养相似的条件，使培养物保持着体内组织部分或全部组织学特征，在体外生存、生长并保持一定的功能。

组织培养与细胞培养并无严格区别，组织培养可出现细胞单一化现象，即趋向变成单一类型细胞，最终也变成了细胞培养。

细胞在培养过程中的生命活动是互相依存的，呈现着一定的“组织”特性。

（一）体外培养方式的分类体外培养可分为原代培养和传代培养。

原代培养，又称初代培养（Primary Culture），即对从生物体内取出的细胞、组织和器官进行实效培养的过程，这样的细胞称为原代细胞，通常只能培养10-50代左右即退化死亡。

传代培养（Passage Culture），是指无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。

原代培养物经首次传代成功后即为细胞系（Cell Line）。

如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line），而已获无限繁殖能力能够持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。

由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞的亚系（Subline）。

（二）体外培养细胞的分型根据离体细胞在培养皿中生长时是否贴壁，可将体外培养细胞分为贴壁型和悬浮型两类。

1.贴壁型细胞：培养细胞需贴附在支持物上生长，大多数细胞属于此型，也称锚着依赖性细胞（anchorage-dependent cells）。

细胞贴壁后，分化现象常变的不显著，易失去原有组织特征，形态上表现单一化。

主要包括①上皮细胞型：细胞呈扁平不规则多角形，中间有胞核，彼此紧密相连成单层膜。

②成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起，起源于中胚层的细胞，如心肌、平滑肌、血管内皮细胞等常呈成纤维细胞型。

③游走细胞型：细胞质常伸出伪足或突起呈活跃的游走或变形运动，贴附于支持物上散在生长，一般不连接成片。

2.悬浮型细胞：某些细胞在培养液中悬浮生长，在培养皿内不贴壁，其生存空间较大，能大量增殖，易进行传代培养。

常见的如血液中的淋巴细胞、白细胞及部分肿瘤细胞等。

组织细胞培养的生存环境和条件（一）无污染环境是保证细胞生存的首要条件。

（二）温度36.5℃±0.5℃。

培养细胞对低温的耐受力比对高温强。

温度达43℃以上，1小时内细胞都将死亡。

（三）气体环境和氢离子浓度95%氧气，5%CO2。

CO2能维持培养基的pH值为7.2~7.4，细胞的耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸性环境中更利于生长。

细胞在生长过程中随着细胞数量增多和代谢活动增强，会不断释放CO2，导致培养基变酸。

（四）体外培养所需基本物质包括糖、氨基酸、促生长因子、各种元素及促细胞贴附物质等。

（五）渗透压多数细胞渗透压为260Osm/kg~320Osm/kg。

（六）培养基包括①合成培养基（Synthetic Medium）：主要来自动物体液或从组织中分离提取制备的成分，其营养性较高，但成分复杂，个体差异较大，在来源上有一定限制。

②天然培养基（Natural Medium）：是按人和动物体内细胞所需成分模拟合成的、配方恒定的一种较理想的培养基。

③无血清培养基（Serum FreeMedium）：成分分为基础培养液和附加成分。

附加成分包括促贴壁附着成分、促生长增殖成分和蛋白酶抑制物等，这类培养基主要应用于研究细胞生长因子、单克隆抗体的制备以及细胞分泌产物等。

（七）附着底物绝大多数培养细胞需附着在适宜的底物上才能生长。

细胞贴附在底物上生长的性质称锚着依赖性。

常见的附着底物有①玻璃：如玻璃培养瓶、盖玻片等。

②一次性塑料：聚苯乙烯、聚四氟乙烯。

可制成薄膜，建成小块后能置入各种平皿中，适于细胞贴附生长，便于取出、染色和做电镜切片。

③微载体：是由聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的微小球体，附着面大，利于大量繁殖细胞。

④饲细胞（Feeder Cell）：可用成纤维细胞或其它细胞长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力但尚存活和有代谢活动，令其作为底物，将其它细胞接种于其上，饲细胞的代谢产物利于其它细胞生长。

可用于特殊细胞培养。

（八）抑制细胞生长因素有毒物质或微生物能抑制细胞生存和生长，因此需清除有毒物质，确保细胞培养的无污染环境。

组织细胞培养的基本操作和技术（一）细胞培养的无菌操作。

1.无菌室：无菌室一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。

为保持无菌状态，无菌室的消毒和防污染是非常必要的。

通常采用每日（使用前）紫外照射（1-2小时），每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。

实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。

2.超净工作台：原理是采用鼓风机驱动空气通过高效过滤器，使空气净化，净化的空气吹入台面空间将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区呈无菌环境。

超净台的平均风速保持在0.32-0.48米/秒左右，过大、过小均不利于保持净化度；使用前最好开启超净台内紫外灯照射10-30分钟，然后让超净台预工作10-15分钟，以除去臭氧，并使工作台面空间呈净化状态；使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。

还要定期用福尔马林熏蒸超净台。

3.常用培养器皿及清洗消毒：细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等。

离体条件下，有害物质可以直接同细胞接触，培养器皿中极少残留物均可对细胞产生毒副作用。

因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。

此外，微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因，目前有多种用于细胞培养的消毒灭菌方法，每种方法都有一定的适应范围。

通常采用过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等方法消毒实验室空气，采用新洁而灭消毒实验室地面，采用高温干热灭菌、高温湿热灭菌、消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿，采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。

（二）细胞培养基本操作技术1.细胞分离技术：将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。

组织取材之后，最好立即培养。

因故不能培养时，应把组织切成1㎜3左右的小块，置于培养液中，4℃贮存；存放时间不易超过24小时。

应严格保持无菌，也要避免受到紫外线照射或接触任何化学试剂及有害药物。

为减少污染，对肿瘤组织或其他病理组织，可用500~1000U/ml的青、链霉素BSS液，漂洗5~10分钟后再做培养处理。

（1）机械解离细胞法：有切割分离法和机械分散法两种。

需先将组织剪成小块，切割分离法是用手术刀切割或剪刀剪切成1mm3左右的组织块，机械分散法是把组织放入注射器针管中挤压或把组织置于不锈钢沙网中用钝器压取。

（2）酶学解离细胞法：在把组织剪成较小体积的基础上，应用生化和化学手段进一步分散组织的方法。

最终使被处理的组织分散成细胞团或单个细胞，加入培养液制成细胞悬液，接种至培养器皿中进行培养。

①胰蛋白酶(Trypsin)法：去除不需要的组织，使用无菌的解剖刀和剪刀把剩余的组织切成3~4mm小片，将组织碎片悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中充分清洗。

沉淀组织碎片，去除上清液，重复清洗2至3次。

将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。

再加入0.25％溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml胰蛋白酶），4℃孵育6-18小时，移弃组织碎片中的胰蛋白酶，37℃孵育20-30分钟，在组织碎片中加入预热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。

通过无菌不锈钢丝网（100～200mm）过滤，分散所有剩余组织。

计数和接种细胞，进行培养。

②胶原酶(Collagenase)法：用无菌解剖刀和剪刀把剩余组织切成3~4mm 小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗组织碎片几次。

加入胶原酶（50～200单位/ml，溶解在HBSS中），37℃孵育4-18小时，同时加入3mM CaCl2增强解离效率。

通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。

如需进一步解聚，可在碎片中加入新鲜的胶原酶重复以上步骤。

通过离心法在HBSS中清洗细胞悬液数次，使用培养基重悬细胞，计数和接种细胞，进行培养。

2.细胞计数法：培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。

当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞数目，即可换算出每毫升细胞悬液中的细胞数目。

细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

3.细胞的冻存与复苏：目前通常采用低温液氮冻存法贮存细胞。

细胞在液氮中，温度达到-196℃，贮存时间几乎是无限的。

用时解冻，细胞仍能生长增殖。

低温液氮冻存的基本原理：在－70℃以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。

在不添加保护剂的条件下冻存细胞时，细胞内外环境中的水会结成冰晶，导致细胞死亡。

但如果向细胞培养液中加入保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结之前透出细胞外。

细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程，在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。

标准的冷冻速度为-1℃~-12℃/min，当温度下降到-25℃时，冷冻速度可增至-5~-10℃/min；当-100℃时则可迅速冻入液氮中。

冻存细胞的复苏：冻存的细胞较脆弱，因此要轻柔操作。

冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。

若细胞对冻存剂（DMSO或甘油）敏感，可离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。

4.细胞运送：选生长状态良好的细胞，待达到80%或90%汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶的颈部（过满易污染），保留少许空间，塞紧瓶塞；如空气过多运，输中气泡运动易使细胞脱落。

妥善包装和运送；一般在不超过四五天到达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响；到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置37℃培养，次日传代。

5.细胞的生长阶段及形态特征观察：传代培养的细胞需每日进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的情况。