超高效液相色谱
超高效液相色谱法
• 理论情况下，配备1.7 μm颗粒的UPLC系 统能产生半峰宽小于1秒的检测峰。这给 UPLC检测带来了挑战。首先，检测器必须 具有较高的采样速率，以在检测峰通过时 捕捉足够的数据点，从而对分析物的检测 峰进行准确而可重现的识别（和积分）
• 检测器必须有最小的扩散体积，以确保分 离效率不降低。检测器的光学部件也必须 具有能体现UPLC灵敏度优势的性能指标。 从概念上讲，对于不同的检测技术，UPLC 检测的灵敏度应是HPLC分离灵敏度的2-3 倍（图5）。例如，质谱检测会极大得益于 UPLC的性能特征,使与UPLC相连的质谱仪 的灵敏度至少提高3倍
• 源于更小颗粒的额外效率可带来更多的明 显益处。更短的色谱柱或更高的流速加快 了速度，同时小颗粒也提高了分辨率。对 于任何给定的分离，都可通过调节这些变 量而达到速度和分辨率的最佳组合
该头发的直径约等于12个5 μm的颗粒，33个1.7 μm的颗粒。
• 图4显示出了目前实验室常用的5 μm颗粒与建议 用于UPLC柱的更小的1.7 μm颗粒的明显差异。 目前，非多孔型1.5 μm颗粒已经上市。虽然这类 颗粒效率较高，但它们的缺点是表面积较小。表 面积小会导致载样量小和保留时间短。为了与 HPLC保持相近的保留时间和载样量，UPLC必须 使用多孔型颗粒。
• 在提到“蛋白组学”或“代谢组学”时，与没有“组” 的差别从分析的角度说就是样品量极大，需要在 短时间分析成千上万的样品。UPLC不损失分离 度的高速度优点在里就能充分体现。多生化样品 及天然产物都十分复杂，
Waters UPLC 超高效液相色谱
超高效液相色谱仪 Nexera UHPLC LC-30A
• UPLC需要一种新颖的耐高压多孔型颗粒。填充 床的均匀性也是至关重要的；特别是当较短的色 谱柱用以保持分辨率的稳定，而同时又要达到加 快分离速度的目标时。另一项要求是色谱柱的内 表面必须足够光滑，以便于填充较小颗粒。应重 新设计色谱柱两端的筛板，使之既能留住小颗粒 又能避免堵塞。
超高效液相色谱仪参数
超高效液相色谱仪参数1、工作环境：1.1环境温度摄氏4-40度.1.2环境湿度20-80%.1.3电压230V（-10%,+8%）2、性能指标2.1四元梯度系统2.1.1流速范围：涵盖所列范围0.000l-5.0000ml∕min,步进以0.000lml∕min为增量2.1.2流量精度：≤0.075%2.1.3溶剂数量：＞42.1.4最高操作压力：＞60MPa2.1.5泵体类型：微体积（柱塞体积≤10μL）双柱塞往复并联泵2.1.6安全机制：高压、低压报警、漏液报警等2.1.7流速准确度:+1.0%2.1.8梯度混合精度：≤0.1%RSD2.1.9溶剂压缩性补偿：可自动,连续进行2.1.10梯度组成范围：0.0-100.0%,0.1%步进2.1.11真空脱气机：N5通道2.1.12物理双泵头：便于维护，独立控制面板：可脱离工作站独立操作2.2样品管理系统2.2.1样品数量:NIoO位L5∕2ml样品瓶2.2.2进样量设定范围:O.lgL~100μL（标准值），可以增加至≥2000uL2.2.3进样方式：全量进样，环路进样2.2.4进样次数：样品1—99次进样2.2.5进样精度：＜0.3%RSD2.2.6进样线性:＞0.9992.2.7样品污染度：≤0.004%2.2.8控温范围：4-40℃2.2.9控温准确度：±ΓC2.3柱温箱2.3.1温度控制类型：强制空气循环，具有液体及气体传感器2.3.2温度控制范围：室温∙10C~85C2.3.3温度准确度：+ΓC2.3.4可放置色谱柱尺寸及数量：≥100mmx6根；30OmmX3根2.3.5色谱柱最小可用1.7μ粒径2.4二极管阵列检测器2.4.1波长范围：190~800nm2.4.2光源：笊灯和鸨灯2.4.3波长准确度：±1nm2.4.4波长精密度：≤0.1nm2.4.5狭缝宽度1.2nm、8nm2.4.6标准池:光程:10mm,池体积:12pL、耐压:12MPa2.4.7web控制：可进行参数设置，日志管理，消耗品管理2.4.8具有智能峰解卷积、智能动态范围扩展功能2.4.9流通池可温控：25~40℃、步进2.4.10UV截止功能：内置UV截止滤光片（开/关可选）2.4.11IPH值范围1~142.5荧光检测器2.5.1波长范围：200~650nm2.5.2光源：岚灯2.5.3光谱带宽：＜20nm2.5.4波长准确度：±2nm2.5.5波长精度：＜0.2nm256灵敏度：水拉曼峰S/N8000或以上（暗背景）2.5.7标准池：体积12μL,最大耐压2Mpa,选配半微量池：体积3μL,最大压力2MPa3、色谱软件3.1软件和仪器主机为同一品牌产品3.2可以双向连接（仪器控制和数据采集）本厂的各种泵和检测器（例如：紫外、示差、二极管阵列、蒸发光散射、荧光、质谱）3.3原厂源代码级全中文版3.4标配数据库3.5多级操作界面：操作者可根据需要，选择不同操作界面，适合初学使用、常规实验分析和专家级分析。
超高效液相色谱系统简介
1
发展背景
2
理论基础
3
仪器组成
4
实际应用及展望
20世纪90年代，高效液相色谱发展的目标应该是 降低成本、走向更低的价格以获得更广泛的应用 实际上，高效液相色谱的技术没有到达极限，用 户对HPLC有更高的要求 超高效液相色谱是用高效液相色谱的极限 作为自己的起点
UPLC(Ultra Performance Liquid Charomatography) UHPLC(Ultra High Performance Liquid Charomatography) UFLC(Ultra Fast Liquid Charomatography) …………
BEH(Ethylene Bridge Hybrid)
应用 与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离
度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。因此UPLC在代谢 组学分析、天然产物的分析及其他一些生化领域有较 多应用。
使用UPLC与质谱检测器连接，会对天然产物分析， 特别是中药研究领域的发展是一个极大的促进。
因此，建立UPLC系统需要解决的主要问题： 1、提高色谱柱的性能； 2、高压溶剂输送单元（超过15,000psi,约103MPa）； 3、高速检测器；优化流动池以解决高速检测及扩散问 题； 4、完善的系统整体性设计。
输液泵压力： 6,000psi(42MPa)→15,000psi(103MPa) 色谱柱填料粒径： 5μm → 1.7μm 检测器流动池体积： 10μL→500nL 其他
氨基酸分析
HPLC 40min
UPLC 10min
天然产物分析
展望 发展更小粒径填料 与质谱仪联用 痕量及复杂天然产物、代谢产物的分析 发展国产超高效液相色谱
色谱分析(中国药科大学)超高效液相色谱(UPLC)
超高效液相色谱(UPLC)超高效液相色谱技术（ultra performance liquid chcromatography，简称UPLC）是一种综合了小颗粒填料、非常低系统体积(死体积)及快速检测手段等全新的检测技术。
在全面提升HPLC的速度、灵敏度及分离度的同时，保留其原有的实用性及原理。
基于小颗粒技术的UPLC，并非普通HPLC系统改进而成。
它不但需要耐压、稳定的小颗粒填料（可达1.7µm），而且需要耐压的色谱系统(>15,000psi)、最低交叉污染的快速进样器、快速检测器及优化的系统体积等诸多方面的保障，以充分发挥小颗粒技术优势。
这就需要对系统所有硬件和软件的进行全面创新。
世界第一个商品化UPLC产品是Waters ACQUITY UPLC TM超高效液相色谱系统，它于2004年3月投入市场。
图1：填料技术的沿革1．小颗粒填料改善分离的理论与科学基础液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。
颗粒大小的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产生直接影响。
由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。
事实上，上述规律的理论基础是著名的Van Deemeter方程。
Van Deemeter方程是色谱科学家预测颗粒度变化而引起的色谱变化的根本依据。
Van Deemeter曲线（见图2）预测最佳柱效与相应的流动相流速。
由Van Deemeter方程得知：随着颗粒度减小，相应的理论塔板高度（HETP）也下降，得到的柱效会更高。
还应该注意到1.7 µm颗粒的HETP最小值区域扩大了（见图2），这表明可以在比大颗粒更宽的流量范围内得到最高的柱效，结果可以不损失高分离度的同时来适当提高流动相的流速（分析速度）。
小颗粒填料为色谱分离带来如此的高柱效和速度优势，使得利用小颗粒技术成为色谱科学家梦寐以求的目标。
然而HPLC系统的设计，一直难于发挥出最小颗粒的优点。
小颗粒技术的运用，不但要求仪器在超出目前限度（6000 psi/ 400 bar）的压力下工作，同时要求仪器系统的死体积要更小，以便不影响梯度性能，而且还要检测器能高速检测出峰宽只有几秒的色谱峰。
超高效液相色谱串联质谱法快速测定
超高效液相色谱串联质谱法快速测定贝类中3种腹泻性贝类毒素许均图，陈德斌，陈 燕，唐春玲（广州华鑫检测技术有限公司，广东广州 510663）摘 要：建立了应用EMR-Lipid小柱净化结合超高效液相色谱串联质谱法快速测定贝类样品中3种腹泻性贝类毒素的分析方法。
样品用80%乙腈溶液提取，以安捷伦Captival EMR-Lipid小柱净化，经超高效液相色谱串联质谱分析测定，采用大气压电喷雾负离子电离，选择反应监测模式，基质匹配外标法定量。
实验结果表明，3种腹泻性贝类毒素的检出限为0.5～1.0 μg·kg-1，回收率为82.6%～107.1%，相对标准偏差为3.5%～9.9%。
该方法操作简单、灵敏度高、回收率和精密度较好，适合应用于日常贝类样品中腹泻性贝类毒素的监测。
关键词：腹泻性贝类毒素；贝类；超高效液相色谱串联质谱Rapid Determination of Three Diarrhoeal Shellfish Poisons in Shellfish by Ultra-Performance Liquid ChromatographyTandem Mass SpectrometryXU Juntu, CHEN Debin, CHEN Yan, TANG Chunling(Guangzhou Huaxin Testing Technology Co., Ltd., Guangzhou 510663, China) Abstract: A method for rapid determination of three diarrhoeal shellfish poisons in shellfish samples by EMR-Lipid column purification combined with ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was established. The sample was extracted with 80% acetonitrile solution, purified with Agilent Captiva EMR-Lipid column, analyzed by ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, ionized by atmospheric pressure electrospray negative ions, selected reaction monitoring mode, and quantified by matrix matching external standard method. The results showed that the detection limits of three diarrhoeal shellfish toxins were 0.5～1.0 μg·kg-1, the recovery was 82.6%～107.1%, and the relative standard deviation was 3.5%～9.9%. The method is suitable for monitoring diarrhoeal shellfish poisons in shellfish samples because of the advantages of simple operation, goodsensitivity and recoveries.Keywords: diarrhoeal shellfish poisons; shellfish; ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry腹泻性贝类毒素（Diarrhetic Shellfish Poisoning，DSP）是由原甲藻属和有毒赤潮藻类鳍藻属的藻类产生的脂溶性多环醚类生物活性毒素[1]。
超高效液相色谱原理
超高效液相色谱原理：分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。
在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数，凝胶色谱法为渗透参数。
但一般情况可用分配系数来表示。
在条件一定，样品浓度很低时时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。
这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。
因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。
超高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。
超高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。
高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。
由于HPLC具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用，流出组分易收集等优点，因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。
超高效液相色谱主要类型:1.液液分配色谱分离原理：分配色谱法的原理与液液萃取相同，都是分配定律。
2.液固吸附色谱分离原理：液固色谱是基于各组分吸附能力的差异进行混合物分离的，其固定相是固体吸附剂。
3.键合相色谱分离原理：正键合相色谱分离远离：使用的是极性键和固定性，溶质在此类固定相上的分离机理属于分配色谱。
畜禽中瘦肉精分析瘦肉精是盐酸克伦特罗的俗称，将其添加到饲料中可使动物生长速率、饲料转化率和胴体的瘦肉率提高10%以上,并降低其脂肪含量。
UPLC超高效液相色谱入门指南沃特世
首先，导入采集到的色谱数据；其次，进行基线校正以消除背景干扰；接着，进行峰识 别与积分以确定各色谱峰的保留时间和峰面积；最后，根据标准曲线进行定量分析，得
到各组分的浓度信息。
结果解读与报告生成
结果解读
根据处理后的色谱数据和定量分析结果， 可以解读出样品中各组分的含量和相关信 息。需注意检查数据的合理性和准确性。
妥善处理。
核实实验室是否遵守环保法规 和相关标准，如废水、废气、 噪声等排放是否符合环保要求。
个人防护措施和应急处理能力培训
对实验人员进行个人防护知识培训，包括如何正确佩戴和使用个人防护装备，如防护服、护目镜、手 套等。
提供应急处理能力培训，包括如何应对实验过程中可能出现的突发情况，如化学品泄漏、火灾等。
避免污染和交叉污染措施
使用高质量的试剂和溶剂， 减少杂质和污染物的引入。
对于不同性质的样品，要 采用不同的进样器和色谱 柱，避免交叉污染的发生。
ABCD
定期清洗进样器、色谱柱 和检测器等部件，避免残 留物对后续分析的影响。
在更换样品或溶剂时，要 彻底清洗相关部件，确保 无残留物对后续分析造成 干扰。
生物分析
要点二
食品分析
UPLC可用于生物样品（如血液、尿液等）中生物标志物的检 测和分析。
UPLC可用于食品添加剂、营养成分等的检测和分析。
沃特世UPLC技术特点
高品质色谱柱
先进的仪器设计
沃特世提供多种类型的高品质色谱柱，满足 不同分离需求，确保分析结果的准确性和可 靠性。
沃特世UPLC仪器设计先进，操作简便，具有 高度的稳定性和可靠性，确保长时间运行的 稳定性和准确性。
分离系统
即色谱柱，是实现样品中各组分分离的关 键部分。
高效液相色谱质谱联用技术在药物分析中的应用
2、高效液相色谱质谱联用技术 在药物分析中的应用
（1）药品质量检测：高效液相色谱质谱联用技术可用于对新药、仿制药以及 中药的质量进行全面检测，包括对药物中各种成分的定性定量分析、立体构型 测定等。此外，该技术还可用于筛选和优化药物候选物，提高药物研发效率。
（2）药品浓度测量：在临床药物治疗中，准确的药物浓度对于治疗效果至关 重要。高效液相色谱质谱联用技术可实现对患者血清、尿液等生物样本中药物 浓度的精确测定，为临床医生提供准确的药物治疗方案依据。
3、药物代谢研究
液相色谱质谱联用技术可以用于药物代谢的研究。通过对药物在体内的代谢过 程进行监测，可以了解药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄情况，有助于药 物的优化设计和新药研发。
四、结论
液相色谱质谱联用技术在药物分析中具有广泛的应用前景。它不仅可以用于药 物成分的分析、质量控制和代谢研究，还可以为新药研发提供有力的技术支持。 随着技术的不断发展和完善，液相色谱质谱联用技术在药物分析中的应用将会 越来越广泛。
（2）上机分离：将处理后的样品通过输液泵注入色谱柱，利用高压液体流将 样品分离成不同组分；
（3）检测：将分离后的组分进入质谱仪，通过离子化、质量分析和检测器进 行检测。关键技术：高效液相色谱质谱联用技术的关键技术包括色谱分离和质 谱检测。
（1）色谱分离：通过选择合适的色谱柱填料和流动相组成，优化色谱分离条 件，提高目标物与杂质的分离效果；
4、药物代谢产物鉴定：UPLC-MS还可以用于药物代谢产物的鉴定。通过分析 药物在生物体内的代谢产物，可以了解药物的代谢途径和机制，为药物的设计 和优化提供参考。
五、总结
超高效液相色谱质谱联用技术是一种强大的分析工具，它在药物分析领域的应 用已经越来越广泛。随着科技的不断进步，我们有理由相信，这种技术将在未 来的药物分析中发挥更大的作用，为药物研发、质量控制以及临床应用提供更 多的支持。
高效液相色谱分离模式及检测
● 试剂：乙腈(JDH.色谱纯);磷酸、磷酸二氢钾(GR,国药集团化学试剂有限公司);三聚氰胺标准物质 (中国计量科学研究院),实验用水为高纯水,电阻率为18.25 MΩ·cm-1。
● 称取100.0mg三聚氰胺标准物质,用水完全溶解后定容至100m L,混匀,此为三聚氰胺标准储备液, 三聚氰胺浓度为1.00g/L。用水逐级稀释三聚氰胺标准储备液至1.00mg/L,此为三聚氰胺标准溶液。 分别移取标准溶液0.50m L、1.00m L、2.00m L、5.00m L、10.00m L、25.0m L、50.0m L 和100.0m L至100m L容量瓶中,并用水定容至刻线,此标准工作溶液三聚氰胺含量分别为5μg/L、 10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、250μg/L、500μg/L、1000μg/L
测蛋白质的重要方法。并且,人们的研究证明HPIEC与RP-HPLC都是分离膜蛋白的首选方法
分离模式3
● 高效凝胶过滤色谱
● 凝胶过滤色谱也称体积排阻色谱(Size exclusion chromatography,SEC), 是根据分子相对大小进 行分离的一种色谱技术。相对于吸附性液相色谱技术而言,SEC的分辨力和样品负载力都很低。 SEC又是一种温和的技术,可用来平衡柱及分离样品的缓冲液范围较广。所以近年来关于利用SEC 分离蛋白质的报道也不少。例如,Bunger H等成功的分离出疏水性肺的表面活性剂蛋白SP-B、 SP-C[8];另外SEC特别适合对蛋白质分子量的研究,利用SEC能够快速分离出人血清白蛋白HAS 的降解产物,结合特定的检测器即可测定其单体和二聚体的分子量
检测方法2
● 三聚氰胺迁移量的高效液相色谱 (HPLC) 分析方法标准溶液的制备:分别以3%乙酸, 10%乙醇溶 液、20%乙醇溶液、50%乙醇溶液、95%乙醇溶液6种食品模拟液将标准储备液逐级稀释为质量 浓度为:0mg/L、0.5mg/L、1.5mg/L、2.5mg/L、3.5mg/L、5.0mg/L 6种系列标准溶液, 保存于 4℃冰箱
超高效液相色谱(uplc)
超高效液相色谱(UPLC TM)：重新定义液相色谱分离科学的能力随着首次成功地使用小颗粒得到惊人的分离能力而进入了一个新的时空。
这个新的色谱领域，所谓超高效液相色谱（UPLC TM），与传统的HPLC技术相比提供了更高的效率，因而具有更强的分离能力。
作为世界第一个商品化UPLC TM产品的Waters ACQUITY UPLC TM超高效液相色谱系统，利用创新技术进行整体设计，大幅度地改善了液相色谱的分离度、样品通量和灵敏度。
UPLC TM的商品化，是分离科学和技术的巨大进步，液相色谱亦由此进入了全新的时代。
基于1.7 μm小颗粒技术的UPLC TM，与人们熟知的HPLC技术具有相同的分离原理。
不同的是：UPLC TM不仅比传统HPLC具有更高的分离能力，而且结束了人们多年不得不在速度和分离度之间取舍的历史。
使用UPLC TM可以在很宽的线速度、流速和反压下进行高效的分离工作，并获得优异的结果。
小颗粒分离的理论与科学基础图1：填料技术的沿革液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。
颗粒度的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产品直接影响。
由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。
事实上，上述规律的理论基础是著名的范德米特(van Deemeter)方程――这是全世界所有从事色谱研究的科学家熟知的理论。
由此得到的范德米特(van Deemeter)曲线，亦是色谱科学家预测颗粒度变化而引起的色谱变化的根本依据。
该曲线预测最佳柱效与相应的流动相流速。
由曲线得知：随着颗粒度减小，相应的理论塔板高度（HETP）也下降，得到的柱效会更高。
还应该注意到1.7 μm颗粒的HETP最小值区域扩大了，这表明可以在比大颗粒更宽的流量范围内得到最高的柱效，结果可以不损失高分离度的同时来优化流速（分析速度）。
小颗粒为色谱分离带来如此的高柱效和速度优势，使利用小颗粒技术成为色谱科学家梦寐以求的目标。
然而HPLC系统的设计，一直苦于难于发挥出最小颗粒的优点。
超高效液相色谱柱
超高效液相色谱柱
超高效液相色谱柱，简称UHPLC柱，是一种用于分离复杂混合物的高灵敏度、高分离性以及高精密度的柱填料。
它使用高流动速率，以及微小的孔径大小和细长的柱体，能够更快地将混合物分离出来。
UHPLC柱具有极高的分离效率和良好的精确度，且分析时间更短，并且对样品的要求也比传统的液相色谱柱要求更低，因此被广泛用于生命科学领域的分析检测中。
UHPLC柱的工作原理是利用液体的压力来把混合物分离开，基本过程是将样品加入柱内，然后通过柱腔内的驱动力，利用液相色谱的原理，将样品里的不同组分慢慢分离出来，最后收集分离出来的每一组分。
UHPLC柱具有细长柱体，小孔径以及高流速，使得它具有更高的分离效率，而且分离时间更短。
UHPLC柱的优点是分离效率高、分离快、灵敏度高、精确度高。
由于它分离更快，因此可以避免部分组分降解或凝固，防止样品组分的损失。
即使是一种复杂的混合液，也可以在更短的时间内完成分离，从而节省大量的时间和人力资源。
它的灵敏度很高，可以更准确地检测出来，精确度也更高，因此它可以提供更准确的数据。
然而，UHPLC柱也有一些缺点。
由于柱体很细，孔径很小，因此运行时易于堵塞，容易造成故障，需要定期维护和清洗，以保证柱的性能。
另外，UHPLC柱的价格高于传统的液相色谱柱，因此不太适合小型实验室的使用。
总之，UHPLC柱是一种高效的色谱柱，具有极高的分离效率和精确度。
它可以更快更准确地将混合物分离出来，而且分析时间更短，在不同的分析检测中有着广泛的应用。
但是由于它价格昂贵，容易堵塞，所以仍然有一定的局限性。
高效液相色谱和超高效液相色谱
高效液相色谱和超高效液相色谱高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC），是现代分析化学中常用的分离技术。
它们可以对复杂的混合物进行分离和定量分析，广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析、生物分析等领域。
本文将从原理、仪器、方法和应用等方面，介绍高效液相色谱和超高效液相色谱的基本知识。
一、原理高效液相色谱和超高效液相色谱的原理基本相同，都是利用样品在流动相中的分配系数差异，通过固定相和流动相的作用，将混合物中的化合物分离出来。
不同的是，超高效液相色谱采用了更小的颗粒固定相，使得流动相可以更快地通过固定相，从而提高了分离效率和分离速度。
在高效液相色谱和超高效液相色谱中，样品首先被注入流动相中，然后通过固定相的柱子。
固定相通常是一种多孔的固体材料，如硅胶、C18等。
样品中的化合物在流动相中的分配系数不同，因此在通过固定相时，会被分离出来。
分离出来的化合物，会在检测器中被检测到，从而实现分离和定量分析。
二、仪器高效液相色谱和超高效液相色谱的仪器基本相同，主要由注射器、流动相泵、柱子、检测器和计算机控制系统等组成。
（一）注射器注射器是将样品引入流动相中的关键部分。
常用的注射器有手动注射器和自动进样器。
手动注射器通常用于小样品量的分析，而自动进样器可以实现高精度、高效率的样品进样。
（二）流动相泵流动相泵是将流动相送入柱子中的装置。
其主要功能是控制流动相的流速和流量，并确保流动相的稳定性。
常用的流动相泵有恒压流量泵和梯度流量泵。
恒压流量泵可以保持恒定的流量，适用于等浓度的流动相。
梯度流量泵可以实现不同浓度的流动相混合，从而实现更好的分离效果。
（三）柱子柱子是高效液相色谱和超高效液相色谱的核心部分，用于固定相的分离。
常用的柱子材料有硅胶、C18、C8等。
色谱分析(中国药科大学) 超高效液相色谱(UPLC)
色谱分析（中国药科大学）超高效液相色谱(UPLC)超高效液相色谱(UPLC)超高效液相色谱技术（ultra performance liquid chcromatography，简称UPLC）是一种综合了小颗粒填料、非常低系统体积(死体积)及快速检测手段等全新的检测技术。
在全面提升HPLC的速度、灵敏度及分离度的同时，保留其原有的实用性及原理。
基于小颗粒技术的UPLC，并非普通HPLC系统改进而成。
它不但需要耐压、稳定的小颗粒填料（可达 1.7µm），而且需要耐压的色谱系统(>15,000psi)、最低交叉污染的快速进样器、快速检测器及优化的系统体积等诸多方面的保障，以充分发挥小颗粒技术优势。
这就需要对系统所有硬件和软件的进行全面创新。
世界第一个商品化UPLC产品是Waters ACQUITY UPLC TM超高效液相色谱系统，它于2004年3月投入市场。
图1：填料技术的沿革1．小颗粒填料改善分离的理论与科学基础液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。
颗粒大小的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产生直接影响。
由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。
事实上，上述规律的理论基础是著名的Van Deemeter方程。
Van Deemeter方程是色谱科学家预测颗粒度变化而引起的色谱变化的根本依据。
Van Deemeter曲线（见图2）预测最佳柱效与相应的流动相流速。
由Van Deemeter 方程得知：随着颗粒度减小，相应的理论塔板高度（HETP）也下降，得到的柱效会更高。
还应该注意到1.7 µm颗粒的HETP最小值区域扩大了（见图2），这2表明可以在比大颗粒更宽的流量范围内得到最高的柱效，结果可以不损失高分离度的同时来适当提高流动相的流速（分析速度）。
小颗粒填料为色谱分离带来如此的高柱效和速度优势，使得利用小颗粒技术成为色谱科学家梦寐以求的目标。
然而HPLC系统的设计，一直难于发挥出最小颗粒的优点。
超高效液相色谱质谱法测定水中联苯胺
超高效液相色谱质谱法测定水中联苯胺
一、联苯胺的概述
1、联苯胺是一种有机物质，它由氮结合在苯环中形成的胺基团构成，其分子
式为C6H5NH2，分子量为93.13。
2、联苯胺在有机合成中是重要的原料，已广泛应用于医药、日化、农药等领域，
但有些联苯胺是环境污染物，其主要危害是具有强烈的嗅觉矿物质，容易污染水体，对人体和生物健康有不良影响。
二、超高效液相色谱质谱法
1、超高效液相色谱质谱法是将高效液相色谱技术与质谱技术相结合的一种分
析技术，可以快速准确地测定复杂样品中微量有机物质的组成结构和含量。
2、超高效液相色谱质谱法能够实现定性和定量，可以检测有机物中微量元素，可
以以高灵敏度快速准确测定。
由于具有高灵敏度、高准确度和高稳定度等优点，因此已成为现代分析中重要的检测手段。
三、测定水中联苯胺
1、样品处理：将所要测试的水样放入一定体积的容器中，然后用提取液进行
抽样，提取液的体积一般是10-20倍于水样体积，然后经离心机进行离心，收集上清液后用于检测分析。
2、实验步骤：①在环境温度下按加样方法和所需的溶剂组态将水样加入检测室，
按定量加入回收剂；②调节高、低压头，将色谱仪控制在设定条件下，配制系统
并进行洗脱；③采集流动相中 et ou含量最高的峰，分析其构成；最后，根据参照
物的相对浓度确定联苯胺的浓度。
四、总结
超高效液相色谱质谱法是一种有效的检测方法，可用于测定水中联苯胺的含量。
这种方法具有高灵敏度、高准确度和高稳定度的优点，并能以可接受的成本和时间完成测试，且可避免发生物化反应等情况，因此是现代分析中重要的技术。
超高效液相色谱(Ultra Performance LC )
主讲人：芮雯
ACQUITY UPLC™
超高效液相色谱（Ultra Performance LC™） 是分离科学中的一个全新类别，它借助于 HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非 常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增 加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。
今天的HPLC
Minutes
恒定柱长时；UPLC™的灵敏度提高1.7倍（170%）！ 恒定L/dp时；UPLC™的灵敏度提高三倍（300%）！
0.050 0.040 0.030 AU
0.020 0.010
0.000 0.050 0.040 0.030
5.0 µm
0.020 0.010 0.000 0.00 0.024 0.020
2 d p
填料颗粒尺寸的演变 70年代早期
40µm薄壳非多孔基质上涂布 100~500 psi 1000塔板数/米 1m长色谱柱
10 min
70年代末期 10µm不规则微多孔填料 1000~2500 psi 25,000塔板数/米 3.9×300mm
10 min
从80年代到现在 3.5~5µm球形微多孔填料 1500~4000 psi 50,000~80,000塔板数/米 3.9×300mm
%
5.22 5.43
15.40 22.61 20.51 2.60 0.62 9.39 11.13 13.75
23.86 33.22 32.78 18.21
44.46 45.79 48.06 43.88 34.96 35.89 42.52 36.99 39.51 52.14
56.48 59.42 61.06 61.54 65.85 53.99
HPLC 3.5µm
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重现性不
相上下
UPLC 34次进样分析烷基芳酮混合物保留时间的重现性
UPLC的耐受性
稳定性试验的条件：
从10到90%甲醇的1分钟梯度1000次进样 C 温度：55º 最大压力：8500psi 流速：1.3ml/min.
0.35 0.30 0.25 AU 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0.00 0.25 0.50 0.75 Minutes 1.00 1.25 1.50 1.75
60% 更快 30% 更灵敏 70% 更高分离度
5.0 µm
15.00
1.7 µm
7.00
在改进获得信息质量的前提下提高分析速度
Ultra Performance LC™
速度、灵敏度与分离度的结合
生产力：每次实验得到更多信息
0.012 0.010 0.008 0.006
0.004 0.002 0.000 -0.002 0.00
如化妆品中违禁品的检测
高分辨串联质谱QTOF micro
灵敏度高(pg-fg级)
和选择性强得到的
质谱谱图数据完整、 品质高。因而，在
天然产物，新药开
发，药代研究和蛋 白质组学领域的定
性、定量分析研究
方面占有重要地位。
从HPLC-MS到UPLC-MS 灵敏度明显提高
4.2 超高效液相色谱的展望
配备了针内进样探头和压力辅助进样技术；
（5）仪器整体系统优化设计：色谱工作站配 备了多种软件平台，实现超高效液相分析方法与 高效液相分析方法的自动转换。
分析速度快
超高 效液 相色 谱的 优点
灵敏度高
分离度好
UPLC的速度提高了！
0.24 1. Thiourea2. 0.046 - 0.088 - toluene 3. propylbenzene - 0.137 4. butylbenzene - 0.182 5. hexylbenzene - 0.360
一分钟以内！
3.UPLC仪器介绍
检测器：
• 光学及/或质谱检测器 • 可调紫外或光电二极管矩阵 • 为UPLC™专门优化的流动池 • 高速检测
色谱柱管理：
• 创新的枢轴转动设计 • 置色谱柱出口直接到检测器
样品管理器：
• 低扩散XYZZ’形式 • 快速进样周期 • 低交叉污染 • 样品盘及/或样品瓶 • 可选样品组织器
UPLC可以更快的速度和更高的质量完成以往HPLC的工
作，为用户节省宝贵的时间和日常溶剂消耗，从而获得最
大的投资回报。
UPLC的高分离度可从容面对复杂组份（如蛋白质与代谢 组学等生化领域、天然产物）分离的挑战。
UPLC的高灵敏度可检测更加痕量的目标化合物。 UPLC的快速分析大量样品，实现高通量。
针内针装置
减少死体 积，降低谱 带扩展 快速自动 取样 低扩散、 低交叉污染 外针刺破密封，内针插入样品容器底部吸取样品可 达到微量取样（µL取样）
4.1 超高效液相色谱的应用
药物分析 如天然产物中复杂组分的分析
生化分析 如蛋白质、多肽、代谢组学等生化样品 食品分析 如食品中农药残留的检测 环境分析 如水中微囊藻毒素的检测 其他
3.1.2 色谱柱硬件
筛板、柱管和连
接件，可在超过 140MPa压力下 装填，保证色谱 柱高柱效和长寿 命。
可记录进样次数、最大反 压及温度
智能芯片自动下载关键参
数到色谱柱历史文件 信息不可删除
含有该色谱柱独特的分析
证书 eCord 装置
3.2 超高效液相色谱的输液系统
3.2.1 二元溶剂管理系统
两元溶剂管理：
• 高压混合 • 两元梯度 • 四溶剂选择 • 在线脱气 • 低扩散设计 • UPLC的耐压能力
3.1 超高效液相色谱的C18色谱柱
dp
固定相粒度直径可达1.7µm
色谱柱长可达3-5cm
3.1.1 色谱柱颗粒化学
改善了高pH稳定性
改善了硅胶的柱效和反压
改善了低pH稳定性
在杂化的碳-硅基质内具有桥式乙烷的1.7µm颗粒 三官能团键合C18配体
HPLC 3.5µm
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 M inutes 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00
AU
0.012 0.010 0.008 0.006
AU
0.004 0.002 0.000 -0.002 0.00
UPLC™ 1.7µm
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 M inutes 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00
UPLC analysis
HPLC: Waters Acquity UPLC system coupled with a photodiode array detection method. Column: An Acquity UPLC BEH C18 column (1006 2.1 mm/ID, with 1.7μm particle size), also from Waters, was used. The column temperature was maintained at 47℃. Chromatographic conditions: A (3%ACN, 2% acetic acid, 95% water) and B (85% ACN, 2% acetic acid, 13% water), with a flow rate of 0.7 mL/min, giving a maximum back pressure of 10 400 psi, which is within the capabilities of the UPLC. The injection volume was 2.5μL. The 6.5 min gradient was as follows: 0 min, 100% A, 3 min, 90% A (curve 6), 4 min, 90% A, 6.5 min, 25% A (curve 6). Finally, the column was washed with 100% B for 3 min and equilibrated with 100% A for 3 min. All the samples were filtered through 0.22μm nylon filters fromScharlab.
超高效液相色谱
目录
1 绪论
2
理论基础
3
仪器介绍 应用和展望
实例
4
3
1.绪论
站在当今世界科技前沿的液相色谱的需求:首先是改进生
产力的需求，因为大量的样品需要在很短的时间内完成；其
次是在生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对 分离能力提出了更高的要求；第三是在与质谱等检测技术联 用时，也提出了更高的要求。 因此，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术
ACQUITY UPLC™ C18 色谱柱 2.1×30mm 1.7µm
黑色：第一次进样 红色：第1000次进样
3.3 超高效液相色谱的高速检测器
UPLC光导检测器流通池示意图
采样速度快 能减少谱带扩展 以保持柱效 灵敏度比HPLC提 高2-3倍
流通池体积小、池壁全折射而不损失光能量
3.4超高效液相色谱的自动进样器
高压混合 二元梯度 四溶剂选择 在线脱气 低扩散设计 耐高压
3.2.2 UPLC超高压输液泵的特性
与普通HPLC
的高压梯度
系统相比， UPLC的梯度
性能稳定
当梯度陡度为1%，梯度范围为90%-100%时，超高压输液 泵的梯度运行曲线
UPLC的重现性
其精确度、
可靠的梯
度性能与 HPLC的
Minutes
恒定柱长时；UPLC™的灵敏度提高1.7倍（170%）！ 恒定L/dp时；UPLC™的灵敏度提高三倍（300%）！
0.050 0.040 0.030 AU
0.020 0.010
0.000 0.050 0.040 0.030
5.0 µm
0.020 0.010 0.000 0.00 0.024 0.020
角度的改进已经不行，或者说必须从理论高度对液相色谱重
新认识。由此，UPLC（超高效液相色谱）概念得以提出， 将HPLC的极限作为自己的起点。
超高效液相色谱技术的实现，主要是依靠以
下几个方面的进步：
（1）小颗粒、高性能微粒固定相的出现； （2）超高压输液泵的使用； （3）高速采样速度的灵敏检测器； （4）使用低扩散、低交叉污染自动进样器，
UPLC
2. toluene - 1.034
™
3. propylbenzene - 1.742 4. butylbenzene - 2.413
HPLC
样品的组份数：5 5µm颗粒度 完全分离时间：6.00分钟
5. hexylbenzene - 5.058
0.20
0.16
0.12
0.08
0.04
0.00
使用1.7µm颗粒度的填 料增加灵敏度
Ultra Performance LC™
速度、灵敏度与分离度的结合
0.050 0.040 0.030 AU 0.020 0.010 0.000 0.00 0.050 0.040 0.030 AU 0.020 0.010 0.000 0.00 1.00 2.00 3.00 Minutes 4.00 5.00 6.00 2.00 4.00 6.00 8.00 Minutes 10.00 12.00
可看到更多 的样品信息
1.7 µm
1.00 2.00 3.00
AU