重组蛋白长效化策略
重组蛋白药物的研究进展
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齐鲁药事 Qi lu P har maceu tical Af f ai rs 2008 V ol 27 , No 10 转变 , 比如 , N eupog en 向 N eulasta 转变 ; P EG - Intro n A 正 在迅速取代 I ntr on A , 而 P egasys [ 6] 很快地遏 制了 P EG - In tro n A 的发展势头。这提示我 们 , 尽管在市场相对成熟及 饱 和的情况下 , # 重 磅炸 弹∃ 的 突变 体仍 然有 很大 的 机会。 当 然 , 这种机会源于我们对发 病机理、 蛋 白质化 学和生 理功 能 的透彻理解 , 也必须有很好的技术平台对改变后的蛋白进 行 系统、 准确的功能和安全评价。 另一方面 , 加强与国外中小企业的合作。国外大型制 药 巨头都有自己 的产 品研 发体 系 , 与中 国企 业 合作 的机 会 不 大。因此 , 那些北美、 欧洲 的中小 企业高 技术 研发企 业就 有 了与中国医药企业合作的契机 , 因为这些企业的资金同样 有 限 , 他们的钱一般都集中用于研发 , 也希望找到合 作伙伴 , 此 时中国企业也在寻找有核心技术的产品 , 这种优势互补的 合 作能够达成一种双赢的目的。
( Roche 公 司的 Pegasys) 和 PEG 化 的 G % CSF ( Am 融 合蛋白 ( A lbuferon) 已 完成 &期临 床试 的&
重组蛋白[Recombinant Protein]纯化的基本策略
![重组蛋白[Recombinant Protein]纯化的基本策略](https://img.taocdn.com/s3/m/634720d9d05abe23482fb4daa58da0116c171f98.png)
重组蛋白[Recombinant Protein]纯化的基本策略一、融合表达蛋白的纯化：融合表达蛋白可以在原目标分子之外带有GST肽段或（His）6肽段，从而使得可以分别用Glutathione Sepharose凝胶或Chelating Sepharos e凝胶进行亲和色谱分子，一步可以达到~90%的纯度，经过特异蛋白酶切后，再进行离子交换及高分辨凝胶过滤一般便可以达到所需的纯度（95~99%）。
二、包含体表达蛋白的纯化：在E.coli系统表达重组蛋白，表达量高时，常形成包含体，包含体易于与细胞其他组分分离，但需要注意的是蛋白复性的步骤。
一般采用盐酸胍溶解包含体蛋白后，用稀释的办法进行复性，也可以利用凝胶过滤色谱进行复性（已有多种凝胶可以促进蛋白质的复性的报道）。
以下以rhGM-CSF（重组人粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子）的下游纯化工艺为例：E.coli细胞，超声破碎，离心收集包含体，用7mol/L盐酸胍溶解包含体蛋白，作1：70稀释使蛋白复性，加硫酸铵至一定浓度后，上样于 P henyl-Sepharose 6 FF（high sub）色谱柱，活性组分再上Q-Sepharo se FF进行离子交换，最后上Superdex 75 prep grade凝胶进行凝胶过滤色谱，最终获得了纯度较高的rhGM-CSF，同时，DNA及内毒素去除率均很高。
如下表所示：步骤体积（ml）蛋白（mg）内毒素（EU/ml）DNA（pg/ml）起始（复性样品）4344 490 421 180HIC疏水柱 880 220 243 0.46AIEX阴离子交换 620 88 251 0.14GF凝胶过滤 1045 62 9 0.08三、周质表达的蛋白的纯化：可用渗透压休克方法，使周质释放，然后利用扩张床技术将含有菌体的悬液直接上柱（STREAmlINE系列凝胶），菌体穿过而表达的蛋白上柱。
重组蛋白表达体系
目
CONTENCT
录
• 重组蛋白表达体系概述 • 重组蛋白表达体系的组成与构建 • 重组蛋白的表达方式与策略 • 重组蛋白的表达产物检测与分析 • 重组蛋白表达体系的挑战与解决方
案 • 重组蛋白表达体系的未来展望
01
重组蛋白表达体系概述
定义与重要性
定义
重组蛋白表达体系是指通过基因工程技术，将外源基因在宿主细 胞中表达并产生相应蛋白质的过程。
提高表达产物的产量与纯度
高密度培养技术
01
通过优化培养条件，提高宿主细胞的生长密度，从而提高重组
蛋白的产量。
蛋白质纯化技术
02
利用先进的蛋白质纯化技术，如亲和色谱、离子交换等，提高
重组蛋白的纯度。
蛋白质折叠与修饰
03
研究蛋白质折叠与修饰机制，优化重组蛋白的稳定性与功能。
重组蛋白表达体系在生物医药领域的应用前景
01
02
03
04
药物研发
利用重组蛋白表达体系生产具 有生物活性的药物，如单克隆 抗体、酶抑制剂等。
疫苗研发
通过表达病原体抗原或相关蛋 白，用于疫苗的研制和生产。
疾病治疗
利用重组蛋白表达体系生产具 有治疗作用的蛋白质，如生长 因子、细胞因子等。
生物材料
利用重组蛋白表达体系生产具 有特定功能的生物材料，如蛋 白质支架、纳米颗粒等。
表达产物的纯化问题
总结词
表达产物的纯化是重组蛋白表达体系中的另 一个挑战，它涉及到如何有效地分离和纯化 目标蛋白。
详细描述
表达产物的纯化问题通常与目标蛋白的溶解 性、稳定性以及与其他蛋白质的相互作用有 关。为了解决这一问题，研究人员可以采用 多种纯化方法，如离子交换、凝胶过滤、亲
《利用重组蛋白技术提高TaqDNA聚合酶活性的研究》范文
《利用重组蛋白技术提高Taq DNA聚合酶活性的研究》篇一一、引言DNA聚合酶是分子生物学领域中至关重要的酶类，其作用在于催化DNA链的合成。
Taq DNA聚合酶因其高活性、高保真性和在高温下的稳定性，在PCR（聚合酶链式反应）技术中占据重要地位。
然而，为了提高PCR的效率和准确性，进一步增强Taq DNA聚合酶的活性显得尤为重要。
本文旨在探讨利用重组蛋白技术提高Taq DNA聚合酶活性的研究。
二、重组蛋白技术概述重组蛋白技术是一种通过基因工程手段，将特定基因在体外进行克隆、表达、纯化和修饰，从而获得所需蛋白质的技术。
此技术可实现对蛋白质的精确操控，包括改变蛋白质的结构、功能和稳定性等。
在生物医学、生物技术和生物工业等领域，重组蛋白技术都有着广泛的应用。
三、Taq DNA聚合酶的活性提升策略为了提高Taq DNA聚合酶的活性，本研究采用重组蛋白技术，通过以下策略进行：1. 基因克隆与表达：首先，对Taq DNA聚合酶的基因进行克隆，并构建高效表达载体。
通过优化表达条件，如温度、pH值和诱导剂浓度等，实现Taq DNA聚合酶的高效表达。
2. 蛋白质纯化与修饰：采用亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤等纯化方法，对表达的Taq DNA聚合酶进行纯化。
此外，通过定点突变、糖基化等蛋白质修饰手段，提高Taq DNA聚合酶的稳定性和活性。
3. 酶活性评估：采用PCR实验，对纯化后的Taq DNA聚合酶进行活性评估。
通过比较不同条件下酶的活性，筛选出最佳的表达和纯化条件。
四、实验结果与分析1. 基因克隆与表达：成功克隆了Taq DNA聚合酶的基因，并在大肠杆菌中实现了高效表达。
通过优化表达条件，Taq DNA聚合酶的表达量得到了显著提高。
2. 蛋白质纯化与修饰：采用多种纯化方法，成功纯化了Taq DNA聚合酶。
通过定点突变和糖基化等修饰手段，进一步提高了酶的稳定性和活性。
3. 酶活性评估：在PCR实验中，发现经过优化后的Taq DNA聚合酶活性得到了显著提高。
重组蛋白质稳定性的保护与优化技术
重组蛋白质稳定性的保护与优化技术蛋白质是生物体内重要的功能分子，常用于制药、农业和生物工程等领域。
然而，蛋白质的稳定性一直是一个重要的挑战，因为它们容易受到环境的影响而失活或降解。
为了克服这个问题，科学家们开发了一系列技术来保护和优化重组蛋白质的稳定性。
一种常用的技术是改变蛋白质的氨基酸序列，以提高其稳定性。
这可以通过替换易受到蛋白质降解酶作用的特定位点上的氨基酸，或者增加具有保护性的氨基酸残基来实现。
例如，研究人员曾经成功地使用天冬酰胺（Proline）替代易降解的苯丙氨酸（Phenylalanine）残基，从而增加了蛋白质的稳定性。
此外，还可以添加二硫键、引入稳定性较高的蛋白质结构域等方法来改善蛋白质的稳定性。
另一种保护蛋白质稳定性的技术是通过改变环境条件来创造一个有利于蛋白质稳定的环境。
其中最常见的方法是使用保护剂和稳定剂。
保护剂，如甘油、蔗糖和聚乙二醇等，可以在蛋白质溶液中形成保护性的层，降低蛋白质的失活率。
稳定剂，如甲醇和丙醇等，可以增加蛋白质与水分子之间的相互作用，提高蛋白质的稳定性。
此外，调节pH值、离子浓度和温度等环境参数也是一种常用的方法来优化蛋白质的稳定性。
除了上述方法，重组蛋白质的稳定性还可以通过加工和储存技术来保护。
例如，冷冻干燥（冻干）是一种常见的保护蛋白质的方法，它通过去除水分来防止蛋白质的降解和失活。
此外，封装和微胶囊化技术也可以用来保护蛋白质，这样可以形成一个稳定的包裹层，防止蛋白质与外部环境接触。
此外，正确的储存条件和容器选择也对蛋白质的稳定性有重要影响。
虽然已经有多种技术可以用来保护和优化重组蛋白质的稳定性，但是每种技术都有其局限性和适用范围。
因此，科学家们仍然在不断努力寻找更好的方法来提高蛋白质的稳定性。
未来的发展趋势之一是利用蛋白质工程技术来设计和开发更稳定的蛋白质。
蛋白质工程可以通过改变蛋白质的结构和性质，进一步提高蛋白质的稳定性。
例如，可以利用计算机模拟和分子动力学模拟技术预测氨基酸残基之间的相互作用，从而设计出更稳定的蛋白质结构。
重组蛋白表达技术的使用中常见问题
重组蛋白表达技术的使用中常见问题蛋白质是生命体内重要的组成部分，它们参与了几乎所有的生物过程。
为了研究和利用蛋白质的功能，科学家们通过重组蛋白表达技术来大量产生目标蛋白。
然而，在使用重组蛋白表达技术的过程中，常常会遇到一些问题。
本文将详细探讨重组蛋白表达技术使用中的一些常见问题，并提供相应的解决方法。
1. 表达水平低在使用重组蛋白表达技术时，常常会遇到表达水平低的问题。
低表达水平可能由多种原因引起，包括启动子的活性不足、转录过程中的阻塞或降解、翻译后期的限制以及蛋白质的不稳定性等。
解决方法：- 优化启动子选择：选择活性较高的启动子，如T7、CMV或SP6启动子。
- 优化培养条件：优化培养基组分、培养温度、表达宿主菌的载体拷贝数等，以提高蛋白表达水平。
- 优化转化方法：尝试使用电转化、化学转化或峰值冲击转化等方法来提高表达宿主菌的转化效率。
- 优化培养时间：延长培养时间，以便提高目标蛋白的表达水平。
2. 目标蛋白形成包含体在表达过程中，目标蛋白常常形成包含体（inclusion body），即蛋白质以不溶性的聚集体形式存在。
解决方法：- 优化培养条件：调整培养温度、培养基成分，提高溶解蛋白的折叠效率。
- 引入辅助蛋白质：结合引入辅助蛋白质的策略，帮助目标蛋白的正确折叠和溶解。
- 进行亲和纯化：通过抗标签或亲和层析等技术，将包含体中包含的目标蛋白从非特异性蛋白质中进行纯化。
3. 目标蛋白磷酸化或糖基化不足重组蛋白质常常需要进行修饰，包括磷酸化和糖基化等。
然而，有时目标蛋白表达后，修饰的程度不足，影响功能和稳定性。
解决方法：- 优化培养条件：调整培养基中相关原料的浓度，如添加合适的磷酸盐或糖类物质，促进修饰的进行。
- 引入修饰相关基因：将相关调控基因引入到表达宿主菌中，提高修饰相关酶的表达水平。
- 转化进化系统：构建具有修饰相关基因的酵母或细菌转化进化系统，通过长时间的适应培养，提高修饰效率。
4. 目标蛋白的折叠和稳定性问题有些目标蛋白在表达和纯化过程中容易失去活性或不稳定。
蛋白及多肽类药物长效化制剂学技术研究进展
Journal of China Pharmaceutical University2020，51（4）：433-440学报蛋白及多肽类药物长效化制剂学技术研究进展丁源1，陈新2，涂家生1*，孙春萌1（1中国药科大学药用辅料及仿创药物研发评价中心，南京210009；2国家药品监督管理局药品审评中心，北京100022）摘要蛋白及多肽类药物近年来越来越多地应用到疾病的预防、诊断和治疗之中，然而，蛋白及多肽类药物通常需要注射给药且缺乏长效剂型，给需要长期用药的慢性病患者带来困扰。
本文综述了通过制剂学手段对蛋白及多肽类药物进行长效化改造的策略，包括缓释注射剂、植入剂、口服制剂以及经皮给药系统，并总结其缓释机制、研究进展和优缺点，以期为此类药物的剂型改良提供研究思路及理论参考。
关键词蛋白及多肽类药物；长效化；缓控释；剂型改良；进展中图分类号R944文献标志码A文章编号1000-5048（2020）04-0433-08doi：10.11665/j.issn.1000-5048.20200407引用本文丁源，陈新，涂家生，等.蛋白及多肽类药物长效化制剂学技术研究进展［J］.中国药科大学学报，2020，51（4）：433–440.Cite this article as：DING Yuan，CHEN Xin，TU Jiasheng，et al.Progress in technology of long-acting preparations of protein and peptide drugs［J］.J China Pharm Univ，2020，51（4）：433–440.Progress in technology of long-acting preparations of protein and peptide drugsDING Yuan1,CHEN Xin2,TU Jiasheng1*,SUN Chunmeng11Center for Research,Development and Evaluation for Pharmaceutical Excipients and Generic Drugs,China Pharmaceutical University,Nanjing210009;2Center for Drug Evaluation,National Medical Products Administration,Beijing100022,China Abstract As one of the most important biological drugs,protein and peptide drugs have been increasingly used in the prevention,diagnosis and treatment of diseases in recent years.However,most of them need to be injected and lack of long-acting formulations,which brings many troubles to patients suffering from chronic diseases.In this review,we summarized the strategies for engineering long-acting formulations for proteins and peptides via preparation means,including extended-release injection,implant,oral preparations and transdermal drug deliv⁃ery systems,and analyzed their release mechanisms,research advances,advantages and shortcomings,thereby providing potential approaches for promoting the formulation improvement of these drugs.Key words protein and peptide drugs;long-acting performance;extended-and controlled-release;formulation improvement;advancesThis study was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81972894,No.81673364),the Chinese Pharma⁃copoeia Commission"Reform of the Review and Approval System for Drugs and Medical Devices"Project(No.ZG2017-5-03)and the National Science and Technology Major Project for Drug Innovation(No.2017ZX0910*******)蛋白及多肽类药物通常具有特定的三维结构和作用位点，从而能够在体内发挥特异性的治疗作用，与传统药物相比有更好的临床有效性和安全性。
重组蛋白长效化策略
重组蛋白长效化策略
重组蛋白长效化策略是指通过化学修饰或载体构建等方式，延长重组蛋白在体内的半衰期，从而增加其生物活性和疗效的方法。
以下是几种常见的重组蛋白长效化策略：
1. 糖基化修饰：通过添加糖基化修饰，如聚乙二醇（PEG）等，可以增加重组蛋白的体积、改变其形状和电荷，从而降低被清除和降解的速度，延长其血浆半衰期。
2. 蛋白质工程：通过基因工程技术，在重组蛋白中引入特定的氨基酸残基或肽段，如Fc片段、肌肉结合域等，可以增加重
组蛋白与其受体或细胞表面分子的结合能力，延长其在体内的循环时间。
3. 共价结合载体：将重组蛋白与长效载体如聚合物或纳米颗粒等共价结合，在体内形成稳定的复合物，延长其在体内的存在时间。
4. 脂负载系统：将重组蛋白与脂负载系统如脂质纳米颗粒等结合，通过脂负载系统提供的保护性作用，延长重组蛋白的血浆半衰期。
5. 磷酸化修饰：将重组蛋白在体内进行磷酸化修饰，可以增强蛋白的稳定性和溶解度，延长其在体内的循环半衰期。
综上所述，重组蛋白长效化策略可以通过改变重组蛋白的结构和性质，延长其在体内的循环时间，从而提高其治疗效果和生物利用度。
不同的策略可以根据具体的应用需求和目标进行选用。
基因工程的下游技术重组蛋白的表达、纯化和分析
基因工程的下游技术是实现基因功能研究和基因产品开发的关键环节，对于生 命科学研究、生物医药、农业、工业等领域具有重要意义。
基因工程下游技术的分类与流程
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分类
1. 目的基因的克 2. 重组载体转化 3. 表达产物的分 4. 表达产物的分
隆和…
宿主…
离和…
析
基因工程下游技术主要包 括重组蛋白的表达、纯化 和分析等技术。
根据宿主细胞的偏好性， 对重组蛋白基因的密码子 进行优化，以提高重组蛋 白的表达水平。
载体优化
通过改造载体，增加重组 蛋白的表达量和稳定性， 如使用分泌型载体、融合 标签等。
培养条件优化
通过调整培养基成分、温 度、pH等培养条件，提高 重组蛋白的表达水平。
03 重组蛋白的纯化
重组蛋白的分离与纯化方法
详细描述
纯化是重组蛋白制备的关键步骤，通常采用多种分离纯化技术，如离心、过滤、沉淀、离子交换、亲和层析等， 以去除杂质并获得高纯度的目的蛋白。
案例二：重组蛋白的结构与功能分析
• 总结词：重组蛋白的结构与功能分析是了解蛋白性质和功能的重要手段，通过 X射线晶体学、核磁共振等技术，可以解析蛋白质的三维结构，进一步揭示其 生物学功能。
重组蛋白纯化的优化策略
选择合适的亲和配基
针对目的蛋白的特性选择特异性结合的配基，提高亲和 色谱的纯度。
结合多种分离方法
综合运用多种分离技术，如凝胶过滤色谱和反相色谱等 ，提高目的蛋白的纯度和回收率。
ABCD
优化离子交换色谱条件
通过调整离子强度、pH等参数，提高分辨率和纯度。
优化缓冲液和添加剂
选择合适的缓冲液和添加剂，如稳定剂、还原剂等，保 持目的蛋白的稳定性和活性。
重组蛋白药物一般生产工艺与质量控制要点
重组蛋白药物一般生产工艺与质量控制要点
重组蛋白药物是通过基因重组技术在外源宿主细胞中表达的蛋白质药物。
其生产工艺和质量控制要点包括以下几个方面：
1.细胞培养和表达：选择合适的宿主细胞（如CHO细胞、
细菌、酵母等），通过转染或转化技术将目标蛋白的基因
导入细胞中，使细胞能够表达目标蛋白。
2.发酵过程优化：对细胞培养的条件进行优化，包括培养基
成分、温度、pH值、搅拌速率等，以提高目标蛋白的产
量和纯度。
3.蛋白纯化：采用一系列的离心、过滤、层析和纯化技术，
如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，将目标蛋
白从细胞培养物中分离和纯化出来。
4.构建和验证二级结构：通过光谱技术，如红外光谱、紫外
吸收等方法，验证目标蛋白的二级结构，确保其与自然蛋
白相似。
5.结构和活性的确认：利用质谱等分析手段对目标蛋白进行
结构分析，确保其三维结构的正确性。
同时使用生物学活
性和特定的生物学试验来确认目标蛋白的活性。
6.病原体和杂质的清除：利用一系列的技术，如超滤、凝胶
过滤、酸碱处理等，清除生产过程中可能存在的病原体、
杂质和过剩的细胞基质。
7.生产工艺的可重复性和稳定性：建立稳定可行的生产工艺，
并对每一批次的产品进行严格的质量控制，以确保产品的一致性和稳定性。
8.特殊注意事项：由于蛋白质药物的复杂性，还需要关注蛋
白聚集、丧失活性、潜在的免疫原性等问题，并通过相关实验和分析来评估和控制这些问题。
以上是重组蛋白药物生产工艺和质量控制的一般要点，实际的生产过程和质量控制要求会根据具体的药物和工艺进行调整和优化。
重组蛋白纯化基本策略
重组蛋白纯化基本策略捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。
中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。
精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。
分离方法的选择根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。
分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。
总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。
处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。
如上样体积、浓度等。
速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。
回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。
在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。
样品浓缩HIC分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩GF高分辨率（使用Supedex）样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制缓冲液更换（如果需要）样品稀释RPC高分辨率需要有机溶剂在有机溶剂中，有损失生物活性的风险提示：1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。
第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。
2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。
3、 GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。
4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方法5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。
长效重组蛋白药物的研究进展
综述长效重组蛋白药物的研究进展中国生物工程杂志China Biotechnology, 2006, 26(2):79～82戚楠*马清钧（军事医学科学院生物工程所北京100850）摘要重组蛋白药物经静脉和皮下注射后通常半衰期较短，目前延长蛋白药物半衰期的方法主要基于三种原理：1、增大蛋白药物分子量；2、利用血浆药物平衡；3、减少免疫原性。
针对构建突变体、PEG化修饰和与血清白蛋白融合三种延长重组蛋白药物半衰期的方法，及其已上市的和正在研发中的长效重组蛋白药物的特征、半衰期和免疫原性问题进行了综述。
关键词长效重组蛋白药物半衰期分子量药物平衡免疫原性突变体PEG化血清白蛋白中图分类号Q819收稿日期：2005 12 23修回日期：2005 12 26* 电子信箱：qinan_8@重组蛋白药物是生物技术药物中很重要的一类，临床上一般通过静脉和皮下注射给药。
经静脉和皮下注射后常伴有蛋白质降解，导致活性降低，生物利用度低，要达到需要的血药浓度和治疗效果需要反复给药，不仅给患者带来不便，且易产生耐受性，耐药性及免疫原性等不良反应，因此临床上需要研制长效的重组蛋白药物。
目前延长蛋白药物半衰期的方法主要基于三种原理：1、增大蛋白药物的分子量，减少肾小球滤过率；2、利用游离型药物和结合型药物在血浆内形成平衡的特点，缓慢释放游离型蛋白药物，使结合型药物和游离型药物的平衡向游离型药物方向移动；3、减少异源蛋白的免疫原性，从而减少其体内清除率。
现将常用延长半衰期技术应用于重组蛋白药物的进展作一介绍。
1构建突变体通过构建突变体延长蛋白药物半衰期，常用方法有1、增加蛋白药物的糖基化程度，通过糖基化一方面在蛋白药物表面增加了侧链，增加蛋白质稳定性，阻碍了蛋白酶对蛋白药物的降解作用，另一方面使蛋白药物分子量增大，减少了肾小球滤过；2、通过形成缓释的微沉淀物，使释放游离型药物的时间延长。
其已经研制成功并上市的药物如重组人EPO突变体（Amgen公司的Aranesp）和重组人胰岛素的突变体（Aventis公司的Lantus）。
重组蛋白的高效表达及纯化技术研究
重组蛋白的高效表达及纯化技术研究随着生物技术的发展，蛋白表达与纯化技术在医疗、工业以及科学研究等领域中扮演着越来越重要的角色。
其中，重组蛋白的高效表达及纯化技术是蛋白质学研究的关键环节之一。
本文旨在探讨目前被广泛应用的几种重组蛋白表达及纯化技术，以及它们的新进展与应用前景。
一、背景介绍重组蛋白指的是通过基因重组技术将人工合成的DNA片段引导到细胞中，使其在受到特定刺激后大量表达特定功能蛋白的一种新型蛋白质。
由于其具有高度专一性、易制备性以及更高的效力和安全性，越来越多的药物被开发为基于重组蛋白的生物制剂。
二、重组蛋白表达技术1. 原核表达系统原核表达系统是将DNA片段导入大肠杆菌等细菌中，在其形成菌落的过程中进行表达。
该系统的优点在于表达速度快、操作简便、表达产量高。
但同时，由于原核表达与真核细胞中的表达相比，它对于蛋白翻译辅助因子和蛋白修饰等生物特征的模拟程度较差，不利于蛋白的正确折叠，因此该系统表达的蛋白质通常需要经过重新折叠处理。
2. 原核表达系统与原核表达系统相比，真核表达系统更接近真实情况中的表达方式，对于全长的蛋白大多数时候能够实现正确的折叠。
在真核表达系统中，常用的系统包括昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌表达系统等。
其中，哺乳动物细胞表达系统能够实现高产量、高质量的蛋白质表达，因此被广泛应用于蛋白质制备。
三、重组蛋白纯化技术1. 亲和层析法亲和层析法是一种将目标蛋白质从混合物中分离出来的技术。
该技术的依据是一种特定的与目标蛋白质具有相互作用的配体分离柱。
在该技术中，目标蛋白质与配体分离柱上的特定功能团结合，非特异性的蛋白质能够在洗脱过程中被去除。
2. 总体分离法总体分离法是将目标蛋白从混合物中分离出来，采用离心、可溶性和非可溶性的分离方法。
其中，在采用可溶性分离的方式时，常用的方法有两相法、分配层析等。
四、新兴技术及应用前景近年来，3D打印技术的应用逐渐渗透到生物医疗领域，并开始用于制备组织工程器官和人造蛋白质等领域。
2024年重组蛋白药物市场分析现状
2024年重组蛋白药物市场分析现状1. 引言重组蛋白药物是一类利用基因工程技术生产的蛋白质药物，广泛应用于医疗领域。
随着科技的不断进步和生物技术的发展，重组蛋白药物市场也呈现出快速增长的趋势。
本文将对重组蛋白药物市场的现状进行详细分析。
2. 市场规模重组蛋白药物市场在过去十年中得到了快速的增长，并且预计在未来几年内仍将保持较高的增长率。
根据市场研究报告，全球重组蛋白药物市场规模预计将达到1000亿美元以上。
这主要是由于人们对高效、安全和经济的药物治疗的需求不断增长，以及生物技术的快速发展。
3. 市场前景重组蛋白药物市场前景广阔，具有良好的增长潜力。
随着科技的不断进步，越来越多的重组蛋白药物将被开发出来并投入市场。
另外，人们对个性化医疗的需求不断增加，这也为重组蛋白药物市场提供了新的机遇。
4. 主要产品重组蛋白药物市场的主要产品包括生长激素、细胞因子、抗体药物等。
这些产品在治疗癌症、糖尿病、心血管疾病等疾病方面发挥着重要作用。
其中，生长激素在儿童生长激素缺乏以及部分成人缺乏生长激素的治疗中应用广泛，由于其高效、安全的特点，市场需求持续增长。
5. 市场竞争格局重组蛋白药物市场竞争激烈，主要由少数大型跨国制药公司主导。
这些公司拥有强大的研发实力和生产能力，凭借其先进技术和丰富的经验在市场中占据着主导地位。
同时，随着技术的进步，越来越多的公司进入了这个市场，加剧了市场竞争。
6. 市场驱动因素重组蛋白药物市场的增长受到多个因素的驱动。
首先，人口老龄化导致对药物治疗的需求增加。
其次，疾病的发病率不断上升，也对重组蛋白药物提出了更高的需求。
此外，技术的不断进步和生物技术的发展也为市场提供了新的机遇。
7. 市场挑战与风险重组蛋白药物市场在发展过程中也面临一些挑战与风险。
一方面，研发新药物需要耗费大量的时间和资金，市场竞争激烈，失败的风险较高。
另一方面，药物安全性和有效性的监管要求也日益严格，对企业来说是一项不可忽视的风险。
《利用重组蛋白技术提高TaqDNA聚合酶活性的研究》范文
《利用重组蛋白技术提高Taq DNA聚合酶活性的研究》篇一一、引言随着生物科技的迅速发展，基因工程与蛋白质工程已经成为研究的重要领域。
在生物科学中，Taq DNA聚合酶是一种重要的酶，广泛应用于PCR（聚合酶链式反应）技术中。
然而，天然的Taq DNA聚合酶活性往往受到多种因素的限制，如温度、pH值、离子浓度等。
因此，如何提高Taq DNA聚合酶的活性成为了研究的热点。
本文将探讨利用重组蛋白技术提高Taq DNA聚合酶活性的研究，为生物科技的进一步发展提供理论基础和实践经验。
二、研究背景与意义Taq DNA聚合酶是一种从嗜热菌中提取出来的酶，具有耐高温、快速、高保真的特点，是PCR技术中的关键酶。
然而，其活性受环境因素影响较大，且产量有限。
为了提高Taq DNA聚合酶的活性和产量，研究者们采用了多种方法，其中，重组蛋白技术是一种有效的手段。
通过基因工程手段，我们可以对Taq DNA聚合酶的基因进行改造，以提高其活性及稳定性。
这一研究不仅有助于提高PCR技术的效率，还能推动生物科技的发展。
三、研究方法本研究采用重组蛋白技术，对Taq DNA聚合酶的基因进行改造。
具体步骤如下：1. 基因克隆：首先从嗜热菌中提取Taq DNA聚合酶的基因，并将其克隆到表达载体中。
2. 基因改造：通过定点突变、删除或添加特定序列等方法，对Taq DNA聚合酶的基因进行改造。
3. 表达与纯化：将改造后的基因在适当的宿主细胞中进行表达，然后通过一系列的纯化步骤得到纯度较高的Taq DNA聚合酶。
4. 活性检测：通过PCR实验检测改造后Taq DNA聚合酶的活性。
四、实验结果经过一系列的实验，我们得到了以下结果：1. 基因改造后，Taq DNA聚合酶的活性得到了显著提高。
与未改造的Taq DNA聚合酶相比，改造后的酶在PCR反应中的效率更高，产物量更大。
2. 通过X射线晶体学和核磁共振等技术手段，我们发现改造后的Taq DNA聚合酶在结构上更加稳定，更能够抵抗环境因素的影响。
具长效性重组人血清白蛋白_粒细胞刺激因子融合蛋白的理化特性研究_富岩
DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.03.001 ·论著· 具长效性重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白的理化特性研究富岩，韩国，富俞淞，杨小楠，邢静，于在林【摘要】目的对符合制药要求的高纯度重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白原料药开展理化特性研究。
方法利用基因工程技术构建了可高效表达重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白（rHSA/GCSF）的毕赤酵母工程菌，rHSA/GCSF直接分泌到组分简单的无机盐培养基中，而后经特别建立的高效分离纯化工艺进行分离纯化。
通过理化分析手段，首次获得 rHSA/GCSF 的多项理化特性指标和结果。
结果 rHSA/GCSF 原料药的蛋白质纯度达到 98% 以上；肽质量指纹图谱匹配率为 84%；N-端氨基酸序列前 15 个氨基酸与理论序列相符；质谱分子量测定结果为 85305 D，与理论分子量85 215 D 值相近；自由巯基含量为 2.4；融合蛋白经圆二色光谱分析比对表明 HSA和 GCSF 各自的空间构象未变；等电点（pI）约为 5.8；融合蛋白为非糖基化蛋白、紫外光谱呈现典型蛋白质光谱；原料药中的细菌内毒素、宿主蛋白质、外源性DNA、甲醇和甘油的残留量符合作为药物的要求。
融合蛋白的免疫学鉴别为阳性；体外细胞学生物比活性测定结果值为 1.5 × 107 IU/mg，与单体 rGCSF 的等摩尔比没有显著差异。
结论研究获得的方法和结果可作为指导《注射用重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白》原料药的质量标准和制检规程的基础。
【关键词】血清白蛋白；粒细胞集落刺激因子；毕赤酵母；重组融合蛋白质类 中国医药生物技术, 2011, 6(3):161-172人粒细胞刺激因子又称人粒细胞集落刺激因子（human granulocyte colony-stimulating factor，hGCSF）是一种多肽细胞生长因子，可特异地作用于粒系造血祖细胞，调节粒细胞的增殖与分化，增强粒系终末分化细胞的功能和增加成熟粒细胞的产出[1-2]。
蛋白多肽类药物长效化技术研究策略
生物技术进展２０２１年㊀第１１卷㊀第３期㊀３０４~３１０ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１进展评述Ｒｅｖｉｅｗｓ㊀收稿日期:２０２０￣１２￣１６ꎻ接受日期:２０２１￣０３￣０１㊀基金项目:河北省重点研发计划项目(１８２７２４０３Ｄ)ꎮ㊀联系方式:庞丽然Ｅ￣ｍａｉｌ:ｐａｎｇｌｉｒａｎ＠１６３.ｃｏｍꎻ∗通信作者贺丞Ｅ￣ｍａｉｌ:ｈｅｃｈｅｎｇ１１１１＠１６３.ｃｏｍ蛋白多肽类药物长效化技术研究策略庞丽然ꎬ㊀贺丞∗ꎬ㊀魏敬双ꎬ㊀高健华北制药集团新药研究开发有限责任公司ꎬ抗体药物研制国家重点实验室ꎬ石家庄０５００１５摘㊀要:多肽/蛋白质类药物普遍存在体内半衰期短的问题ꎬ使其应用受到了限制ꎮ近年来ꎬ蛋白质半衰期的研究取得了很大的进展ꎬ许多技术已经被提出并测试延长治疗性蛋白的作用时间ꎬ如与其他蛋白基因融合(免疫球蛋白域或血清蛋白ꎬ如白蛋白)㊁与聚合物结合(ＰＥＧ化修饰㊁聚唾液酸化㊁ＨＥＰ化等)ꎮ这些技术主要基于本身较长的半衰期及循环机制调控以延长多肽/蛋白质类药物的半衰期ꎮ针对上述的多种长效化方式及相关产品进行了综述与讨论ꎬ以期为此类药物的长效化研究提供思路ꎮ关键词:长效ꎻ半衰期ꎻＰＥＧ修饰ꎻ重组多肽ꎻＦｃ融合ꎻ糖基化ＤＯＩ:１０.１９５８６/ｊ.２０９５￣２３４１.２０２０.０１６０中图分类号:Ｒ９１４.２㊀㊀㊀文献标识码:ＡＲｅｓｅａｒｃｈＳｔｒａｔｅｇｙｏｎＬｏｎｇ￣ａｃｔｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＰｅｐｔｉｄｅＤｒｕｇｓＰＡＮＧＬｉｒａｎꎬＨＥＣｈｅｎｇ∗ꎬＷＥＩＪｉｎｇｓｈｕａｎｇꎬＧＡＯＪｉａｎＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｔｉｂｏｄｙＲｅｓｅａｒｃｈ＆ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬＮｅｗＤｒｕｇＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｏｍｐａｎｙＬｔｄ.ꎬＮｏｒｔｈＣｈｉｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏｒｐｏｒｔａｔｉｐｏｎꎬＳｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００１５ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:Ｐｅｐｔｉｄｅ/ｐｒｏｔｅｉｎｄｒｕｇｓｇｅｎｅｒａｌｌｙｈａｖｅｓｈｏｒｔｈａｌｆ￣ｌｉｆｅｉｎｖｉｖｏꎬｗｈｉｃｈｌｉｍｉｔｔｈｅｉｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ.Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓꎬｇｒｅａｔｐｒｏｇｒｅｓｓｈａｓｂｅｅｎｍａｄｅｉｎｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｈａｌｆ￣ｌｉｆｅ.Ｍａｎｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｈａｖｅｂｅｅｎｐｒｏｐｏｓｅｄａｎｄｔｅｓｔｅｄｔｏｅｘｔｅｎｄｔｈｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓꎬｓｕｃｈａｓｆｕｓｉｏｎｗｉｔｈｏｔｈｅｒｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｓ(ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｄｏｍａｉｎｏｒｓｅｒｕｍｐｒｏｔｅｉｎꎬｓｕｃｈａｓａｌｂｕｍｉｎ)ꎬａｎｄｂｉｎｄｉｎｇｗｉｔｈｐｏｌｙｍｅｒｓ(ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎꎬｐｏｌｙｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎꎬｈｅｐｙｌａｔｉｏｎꎬｅｔｃ.).Ｔｈｅｓｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓａｒｅｍａｉｎｌｙｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｉｒｌｏｎｇｈａｌｆ￣ｌｉｆｅａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｔｏｐｒｏｌｏｎｇｔｈｅｈａｌｆ￣ｌｉｆｅｏｆｐｅｐｔｉｄｅ/ｐｒｏｔｅｉｎｄｒｕｇｓ.Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒꎬｔｈｅａｂｏｖｅ￣ｍｅｎｔｉｏｎｅｄｌｏｎｇ￣ａｃｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄａｎｄｄｉｓｃｕｓｓｅｄꎬｉｎｏｒｄｅｒｔｏｐｒｏｖｉｄｅｒｅｓｅａｒｃｈｉｄｅａｓｆｏｒｔｈｅｌｏｎｇ￣ａｃｔｉｎｇｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｓｕｃｈｄｒｕｇｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｌｏｎｇ￣ａｃｔｉｎｇꎻｈａｌｆ￣ｌｉｆｅꎻＰＥＧｙｌａｔｉｏｎꎻｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅꎻＦｃｆｕｓｉｏｎꎻｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ㊀㊀治疗性多肽和蛋白质具有结合力高㊁特异性强㊁溶解度高㊁毒性低的特点ꎬ大量的蛋白质和多肽疗法进入了医药市场[１]ꎮ但是除抗体类药物外ꎬ大多数蛋白类药物半衰期较短ꎬ必须通过频繁给药或提高剂量才能达到预期的治疗效果ꎬ这样不仅给病人带来巨大的痛苦和潜在的风险ꎬ也给病人带来了巨大的经济负担ꎮ因此ꎬ为了延长治疗肽和蛋白质的半衰期ꎬ提高其药代动力学/药效学性质ꎬ人们在化学改造㊁基因工程和药物动力学等方面进行了大量的研究ꎬ已开发了多种有效的长效策略ꎮ１㊀决定半衰期的重要因素多肽和蛋白质通常比小分子更不容易穿过上皮细胞ꎬ更易被宿主代谢ꎬ所以大多数生物药物都是通过皮下或静脉注射给药的ꎮ蛋白质疗法在临床应用中面临的最大挑战之一是其在血清中的快速降解ꎬ以及由于酶降解㊁肾清除㊁肝代谢和免疫原性而导致的快速消除[２]ꎮ除了单克隆抗体具. All Rights Reserved.有长达一周的血清半衰期外ꎬ大多数蛋白类药物很快就会从体内消失ꎬ半衰期短ꎮ蛋白质的去除率依赖于多种因素ꎬ比如尺寸㊁分子量㊁表面电荷等[３]ꎮ蛋白质分子的大小和疏水性使其易于肾脏滤过和肝脏代谢ꎮ肾滤过阈值约为５０~６０ｋＤꎬ生物制药分子量在６０ｋＤ以下的通过肾脏过滤ꎮ另一方面ꎬ生物体内广泛存在各种蛋白水解酶ꎬ负责蛋白质破坏的蛋白酶体具有特异性识别几乎所有外来蛋白质的能力ꎬ同时能够避免对细胞成分的任何不必要的破坏ꎻ生物药物在细胞膜上的渗透性很差ꎬ而细胞摄取途径通常导致溶酶体中的药物降解ꎮ因此ꎬ半衰期延长策略的成功与否取决于该技术能否操纵一个或多个这些因素ꎮ２㊀聚合物类对治疗性蛋白/多肽的修饰２.１㊀聚乙二醇(ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎꎬＰＥＧ)修饰聚乙二醇化(ＰＥＧ)是２０世纪７０年代一种很受欢迎的蛋白质修饰技术ꎮ聚乙二醇本身是一种不带电的亲水聚合物ꎬ不可生物降解ꎬ大部分无毒性[４]ꎮＰＥＧ链是由环氧乙烷(ＣＨ２￣ＣＨ２￣Ｏ)的重复单位构成的分子ꎮ肽链共价连接在一个或多个高分子量ＰＥＧ链上ꎬ赖氨酸和多肽链的Ｎ￣末端的氨基酸残基是最常用的ＰＥＧ化位点ꎮ延长半衰期的作用是通过隐藏肽的抗原决定因素ꎬ使抗体不能认识到它是一个异物ꎬ并增加蛋白质的大小ꎬ使它不会被肾脏轻易清除ꎮ高度灵活的聚乙二醇分子很容易附着在治疗分子上ꎮ聚乙二醇化也有助于吸收ꎬ增强蛋白质的水溶性ꎬ并掩盖分子避免蛋白水解或降解[５]ꎮＰＥＧ一般认为是安全的ꎬ然而并不是百分之百安全ꎬ因为它是不可被生物降解的ꎬ具有免疫原性ꎮ从目前已上市的几种ＰＥＧ化药物的情况来看ꎬ长效化效果明显[６]ꎮ非格司亭(ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ)是一种重组蛋氨酸人粒细胞集落刺激因子(Ｇ￣ＣＳＦ)ꎬ在化疗期间能够刺激中性粒细胞的供应预防胎儿中性粒细胞减少症(ＦＮ)ꎬ需每日注射ꎮ聚乙二醇化的非格司亭为乙二醇化非格司亭ꎬ它只需要每个周期注射一次[７]ꎻＥｎｚｏｎ开发的Ｏｎｃａｓｐａｒꎬ是ＰＥＧ化的Ｌ￣天东酰胺酶ꎬ半衰期比原Ｌ￣天东酰胺酶延长了１６倍[８]ꎮＡｍｇｅｎ的短效化ＧＣＳＦ在一个化疗周期需要多次注射ꎬ而其长效化的ＰＥＧ￣ＧＣＳＦ(ｎｅｕｌａｓｔａ)一个化疗周期中只需给药１次即可维持药效[９]ꎮ国内上市的ＰＥＧ化生物药物有石药集团的聚乙二醇化重组人粒刺激因子(ＰＥＧ￣ｒｈＧ￣ＣＳＦ)㊁长春金赛的聚乙二醇化重组生长激素ＰＥＧ￣ｒｈＧＨ等ꎮ２.２㊀改性的ＰＥＧ修饰在过去的几十年里ꎬ研究人员一直在努力研发ＰＥＧ偶联疗法ꎬ将聚乙二醇修饰和共轭到其他分子上ꎮ２.２.１㊀糖基化￣ＰＥＧ修饰㊀传统上ꎬＰＥＧ通过共价键连接到氨基酸反应基团上与蛋白质结合ꎮ新的糖基化￣ＰＥＧ修饰方法将ＰＥＧ连接到Ｏ￣聚糖上ꎮ因此ꎬ它由糖基转移酶位点定向聚乙二醇化ꎮ该方法可以使形成的异构体最小化ꎬ同时能够提高ＰＥＧ延长半衰期的性能[１０]ꎮ２.２.２㊀生物素化的ＰＥＧ修饰㊀近年来ꎬ通过将聚乙二醇与链霉亲和素偶联得到了一种改性聚乙二醇[１１]ꎮ研究表明ꎬ采用生物素化－聚乙二醇技术ꎬ可以改善循环停留时间ꎮ它具有巨大的潜力ꎬ可用于蛋白质和肽治疗的药物动力学增强剂ꎮ３㊀重组多肽类对治疗性蛋白/多肽的修饰近年来ꎬ蛋白质半衰期延长的新技术不断涌现ꎬ包括非结构多肽链ꎮ就像聚乙二醇ꎬ多肽聚合物附着到蛋白质上ꎬ增加它们的水动力半径ꎬ使它们不易于肾滤过ꎮ但与聚乙二醇不同ꎬ多肽聚合物可生物降解ꎬ无毒㊁无免疫原性㊁亲水ꎬ属中性聚合物ꎮ另外ꎬ多肽聚合物的合成技术简单ꎬ效益也很高[１２]ꎮ３.１㊀非结构多肽ＸＴＥＮＸＴＥＮ是Ａｍｕｎｉｘ公司开发的蛋白质聚合物ꎬ用途广泛ꎬ可替代非生物降解的聚合物ꎬ用于延长半衰期ꎮＸＴＥＮ是一种非结构多亲水性㊁可生物降解的蛋白质聚合物ꎬ由数量有限的单体组成ꎮＸＴＥＮ具有多肽的性质ꎬ使其有望用于延长半衰期[１３]ꎮ与化学聚合物不同ꎬＸＴＥＮｓ没有特定的结构ꎮ和聚乙二醇一样ꎬＸＴＥＮ也能延长蛋白质的半衰期ꎬ增加分子的大小和水动力半径ꎬ这说明ꎬＸＴＥＮ是很好的ＰＥＧ替代品ꎮＸＴＥＮ由大肠杆菌表达ꎬ包含Ａ㊁Ｅ㊁Ｇ㊁Ｐ㊁Ｓ和Ｔ的氨基酸序列库ꎮ已有研究将ＸＴＥＮ多肽与Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ㊁胰高血糖素(Ｇｃｇ)㊁胰高血糖素样肽２(ＧＬＰ２)类似物[１４￣１５]ꎬ５０３庞丽然ꎬ等:蛋白多肽类药物长效化技术研究策略. All Rights Reserved.膜联蛋白等进行融合ꎬ测试评估其效果ꎬ表明ＸＴＥＮ能够增强药物的半衰期和降低免疫原性[１６]ꎮ３.２㊀脯氨酸－丙氨酸－丝氨酸(ＰＡＳ)ＰＡＳ是慕尼黑工业大学开发的另一种多肽聚合物ꎬ工作原理与ＰＥＧ类似ꎬ具有生物可降解的多肽分子的所有特性[１７]ꎮＰＡＳ是一种１００~２００重复序列的非结构肽聚合物ꎬ是由脯氨酸㊁丙氨酸和丝氨酸这３种氨基酸随机排列而成的重复序列ꎮＰＡＳ聚合物对血清蛋白酶有抗性ꎬ但仍然存在可被肾脏蛋白酶降解的风险ꎮＰＡＳ多肽是无毒的ꎬ缺乏Ｔ细胞表位ꎬ在动物实验无免疫原性征象[１８]ꎮＰＡＳ多肽已被广泛应用于治疗多肽和蛋白质ꎬ包括激素㊁细胞因子㊁抗体片段与酶[１９]ꎮ研究表明生物制药的半衰期也可以通过改变ＰＡＳ聚合物的长度很容易地调整ꎬ来实现特定的应用[１９￣２０]ꎮ最初有３种蛋白作为模型药物进行了测试:重组Ｆａｂ片段㊁干扰素α２ｂ(ＩＦＮα２ｂ)[２１]和人类生长因子(生长激素ｈＧＨ)ꎮ不同的ＰＡＳ序列与Ｆａｂ片段结合ꎬ使半衰期增加２~２５倍ꎮｒＦａｂ本身单独半衰期只有１.３４ｈꎬＰＡＳ修饰后半衰期为２.７１~３７.００ｈꎮ研究显示ＰＡＳ修饰的ＩＦＮ半衰期增加了５~３０倍ꎬｈＧＨ半衰期增加９４倍ꎮ除此还有多种生物活性蛋白与２００~６００个残基的ＰＡＳ融合ꎬ比如ＩＦＮβ激动剂㊁小鼠瘦素[２２]和人铁蛋白[２３]ꎮ３.３㊀类弹性蛋白多肽ＥＬＰ另一种多肽融合技术是类弹性蛋白多肽(ｅｌｐｙｌａｔｉｏｎ)ꎮ就像ＸＴＥＮ和ＰＡＳꎬＥＬＰ也是含有Ｖ￣Ｐ￣Ｇ￣ｘ￣Ｇ重复序列的随机序列ꎬ主要存在于弹性蛋白中ꎬｘ指的是除脯氨酸以外的任何氨基酸[２４]ꎮ由于它与弹性蛋白具有较高的相似性ꎬ这使得它更容易被人类的弹性酶识别降解ꎬ赋予了它可生物降解的特性ꎮＥＬＰ像ＰＥＧ及其他多肽聚合物一样ꎬ通过增加水动力半径以延长半衰期ꎬ已被用于延长肽和蛋白质的半衰期[２５￣２６]ꎬ包括ＩＬ￣１受体拮抗剂㊁ＩＬ￣４㊁ＩＬ￣１０㊁ＧＬＰ￣１和ＨＩＶ中和抗体等ꎮ有趣的是ꎬＧＬＰ￣１￣ＥＬＰ融合蛋白在室温和体温之间表现出溶解－不溶解相变ꎮ可形成一个具有缓释特性的注射存库ꎬ可在单次注射后ꎬ使小鼠的血糖水平降低维持５ｄ[２７]ꎮ据报道描述ꎬＩＬ￣１受体拮抗剂￣ＥＬＰ融合蛋白也会有类似的结果ꎬ注射后形成一个药物存库[２８]ꎮ３.４㊀富含甘氨酸的聚多肽(ＨＡＰ)ＨＡＰ修饰是一种富含甘氨酸(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎ多肽的重复序列的活性分子ꎬ由１００~２００的重复残基组成ꎮＨＡＰ修饰在动物模型中显示对Ｆａｂ的半衰期呈上升趋势ꎮ２００个ＨＡＰ残基偶联到Ｆａｂ残基显示在体内有较长时间的半衰期(６ｈ)ꎮ但研究遇到了一个重大难题是(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎ的溶解度与半衰期之间的矛盾:ＨＡＰ溶解度依赖于链长ꎬ链长增加会大大降低溶解度ꎮ然而较短的链不能很有效地提高半衰期ꎬ因此这种技术没有得到进一步发展ꎮ３.５㊀明胶样蛋白(ＧＬＫ)明胶样蛋白(ＧＬＫ)是一类具有生物活性的重组多肽ꎬ可用于延长半衰期ꎬ它是由(Ｇｌｙ￣ＸＹ)ｎ的重复序列组成ꎬ其中Ｘ和Ｙ指除Ｃｙｓ除外任何天然的氨基酸ꎬｎ是在６０~１５００个氨基酸残基之间(最好是２００~１０００)ꎬ分子量为６~１５０ｋＤ(最好是２０~８０ｋＤ)ꎮ通过基因融合制备的不同ＧＬＫ修饰的Ｇ￣ＣＳＦꎬ使其在大鼠中的半衰期从１ ７６ｈ延长到１０ｈꎮ４㊀天然蛋白或蛋白结构域对治疗性蛋白/多肽的修饰㊀㊀有一些天然的蛋白质分子具有超长的半衰期ꎬ因此血清白蛋白和转铁蛋白等蛋白首先被认为是延长其他治疗性蛋白半衰期的基团ꎮ转铁蛋白的半衰期较长是由于与网格蛋白依赖的转铁蛋白受体结合ꎬ而白蛋白的长半衰期是新生儿Ｆｃ受体(ＦｃＲｎ)介导循环的结果ꎮｐＨ依赖的ＦｃＲｎ受体介导的循环作用机制也适用于人免疫球蛋白ＩｇＧ抗体[２９￣３０]ꎮ４.１㊀与白蛋白结合白蛋白具有一些独特的特性ꎬ如血浆半衰期约１９ｄꎬ负电荷表面具有多价结合位点等ꎬ这使该分子成为理想的肽类药物的运载工具和半衰期延长剂的候选物ꎮＡｌｂｉｇｌｕｔｉｄｅ(Ｔａｎｚｅｕｍ)是第一个直接与ＨＳＡ融合的治疗蛋白ꎬ它在２０１４年被ＦＤＡ批准用于治疗Ｔ２ＤＭ[３１]ꎮＡｌｂｕｔｒｅｐｅｎｏｎａｃｏｇａｌｆａ(Ｉｄｅｌｖｉｏｎ)是一种重组蛋白人凝血因子ＩＸ(ＦＩＸ)融合蛋白ꎬ于２０１６年获得ＦＤＡ批准用于血６０３生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.友病Ｂ患者的出血治疗与预防ꎮＡｌｂｕｔｒｅｐｅｎｏｎａｃｏｇａｌｆａ蛋白的半衰期为９０~１０４ｈꎬ比原蛋白ＦＩＸ的半衰期(１８~３４ｈ时)长５倍ꎮ４.１.１㊀与白蛋白的非共价结合㊀在辅助分子的帮助下ꎬ比如通过非共价键连接脂肪链ꎬ实现白蛋白与治疗性肽间接结合ꎮ白蛋白是研究充分的转运蛋白ꎬ能够有效并可逆地结合一系列内源性配体包括脂肪酸㊁胆红素和少数外源性配体ꎬ如青霉素㊁华法林㊁安定等ꎮ使用脂肪酸作为配体也被称为 脂化 ꎮ白蛋白与这些分子结合提高了它们的生物利用度ꎮ利用该技术开发的两个著名的多肽药物是地特胰岛素(ｌｅｖｅｍｉｒ )和利拉鲁肽(ｖｉｃｔｏｚａ )[３２￣３３]ꎮ４.１.２㊀与白蛋白的共价偶联㊀治疗性蛋白药物与白蛋白分子的共价结合是另一种延长蛋白半衰期的途径ꎮ它可以通过蛋白质和白蛋白的化学结合来实现ꎮ直接将蛋白药物与转基因白蛋白或白蛋白衍生物而不是内源性白蛋白结合ꎬ进一步为延长半衰期提供了灵活条件ꎮ化学偶联的优点是治疗分子与白蛋白的连接位点不再局限于Ｎ端或Ｃ端ꎮＰＣ￣ＤＡＣＴＭ是一种体外ＨＳＡ预耦合技术ꎬ将蛋白质/多肽连接子复合物在体外与ＨＳＡ蛋白进行偶联ꎬ直接形成治疗分子白蛋白复合物ꎮ研究者通过该技术对艾塞那肽进行修饰ꎬ然后再与重组人血白蛋白结合ꎮ艾塞那肽是一种天然存在的肽激素ꎬ对治疗糖尿病具有很好的作用ꎮ但半衰期只有３３ｍｉｎꎬ糖尿病患者需一天注射一次ꎮ通过ＰＣ￣ＤＡＣＴＭ可以延长艾塞那肽的血浆半衰期ꎬ从而使药物作用时间延长ꎮ该药物在体内的半衰期可达到７ｄꎬ因此临床上可以做到患者每周只需注射一次ꎬ极好地增加了患者的使用便捷性并能更稳定的控制血糖ꎮ白蛋白衍生物是一类对延长血清半衰期具有广泛应用前景的重组蛋白ꎮ４.１.３㊀与白蛋白的基因融合㊀与共价结合一样ꎬ基因融合技术也能制备与白蛋白结合的融合蛋白ꎮ这提供了一个更简单的程序ꎬ由于制造过程发生在生物体或细胞系内ꎬ并完全折叠成功ꎬ可直接收集蛋白[３４]ꎮ治疗肽可在白蛋白的一端(Ｎ或Ｃ端)或两端(双特异性白蛋白融合)与白蛋白结合ꎮＨＳＡ融合的蛋白药物是非糖基化还是糖基化蛋白决定了采用酵母或ＣＨＯ细胞表达ꎬ成本低且纯化方便ꎬ使得其具有作为药物长效化载体的经济效益性ꎮＨＳＡ融合蛋白的主要优点是其免疫原性低㊁作为惰性蛋白能增加蛋白稳定性[３５]ꎮ４.２㊀Ｆｃ融合ＩｇＧ偶联蛋白延长半衰期主要是基于Ｆｃ域融合ꎮ结构上ꎬＩｇＧ的恒定区域Ｆｃ区为二价ꎬ为药物结合提供了灵活性[３６]ꎮ从概念上讲ꎬ二价结合是亲和效应的一个额外优点ꎮ蛋白质分子可以添加到Ｆｃ中区域融合位点(Ｎ端或Ｃ端)或插入环路形成[３７]ꎮ首个Ｆｃ融合蛋白依那西普(Ｅｎｂｒｅｌ)１９９８年获得ＦＤＡ批准用于治疗类风湿性关节炎ꎮ多肽的药代动力学特征可以通过基因融合到Ｆｃ结构域的两个分支上而得到改善ꎬ从而产生双价结构融合蛋白ꎮＤｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ(Ｔｒｕｌｉｃｉｔｙ)ꎬＧＬＰ￣１受体激动剂每周注射一次ꎬ在２０１４年被批准用于治疗２型糖尿病(Ｔ２ＤＭ)ꎮＤｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ由两个具有多个突变的相同ＧＬＰ￣１分子组成(Ａ８Ｇ/Ｇ２２Ｅ/Ｒ３６Ｇ)ꎬ通过一个小肽链融合到ＩｇＧ４￣Ｆｃ区(Ｆ２３４Ａ/Ｌ２３５Ａ)ꎮＤｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ的半衰期延长至５ｄ左右ꎬ与埃克西纳替德(ｅｘｅｎａｔｉｄｅ)㊁利拉格鲁肽(ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ)和利克西纳替德(ｌｉｘｉｓｅｎａｔｉｄｅ)相比半衰期要长得多ꎬ这些药物必须每日服用１~２次[３８]ꎮＦｃ作为半衰期延长手段的另一个应用是单分子Ｆｃ的利用ꎮＥｆｒａｌｏｃｔｏｃｏｇ￣α(ｅｌｏｃｔａｔｅ)包括一个凝血因子ⅧＢ域与Ｆｃ二聚体融合ꎬ并被批准用于治疗血友病Ａꎬｅｆｒａｌｏｃｔｏｃｏｇ￣α半衰期为１９ｈꎬ而重组因子Ⅷ延长了１.５倍ꎮ两种用于治疗Ｅｆｔｒｅｎｏｎａｃｏｇ￣α(Ａｌｐｒｏｌｉｘ)的单价Ｆｃ融合蛋白被ＦＤＡ批准用于治疗血友病Ｂ[３９]ꎬ由单一ＦＩＸꎬ融合到ＩｇＧ１的Ｆｃ二聚体ꎮＥｆｔｒｅｎｏｎａｃｏｇ￣α的半衰期为５３~８２ｈꎬ比重组ＦＩＸ(１９ｈ)长３~５倍[４０￣４１]ꎮ除了延长半衰期外ꎬＦｃ融合有时还能改善蛋白质的生理机能ꎬ如增加溶解性和稳定性ꎮ在Ｆｃ介导的半衰期延长的制剂药物中ꎬＡＤＣＣ具有抗体依赖性细胞毒性ꎬＣＤＣ具有互补依赖性细胞毒性ꎬ这些问题通过ＣＨ３￣ＣＨ３杂化得到了解决ꎮ４.３㊀转铁蛋白融合血清转铁蛋白能够与铁分子可逆结合并将其转运到组织ꎮ转铁蛋白在血清中的半衰期是７~１０ｄ(非糖基化Ｔｆ为１４~１７ｄ)ꎬ它作为融合分子是延长蛋白质半衰期的良好候选物[４２]ꎮ有一项研究有关丙胰岛素与转铁蛋白融合(ＰｒｏＩＮＳ￣Ｔｆ)ꎮＰｒｏＩＮＳ￣Ｔｆ融合蛋白在老鼠体内ꎬ显示具有较长时７０３庞丽然ꎬ等:蛋白多肽类药物长效化技术研究策略. All Rights Reserved.间的半衰期ꎬ能够缓慢持续地降糖ꎮＰｒｏＩＮＳ￣Ｔｆ血清中的半衰期为７.２９ｈꎬ而ＰｒｏＩＮＳ半衰期只有０ ５ｈ[４３]ꎮ５㊀碳水化合物对治疗性蛋白/多肽的修饰在生物系统中ꎬ糖基化起着维护蛋白质的稳定性及防止酶降解的作用ꎮ糖基化是蛋白质与碳水化合物的共价修饰ꎮ蛋白质的固有性质是由连接在它链上的糖分子改变ꎬ最终改变其四级结构的稳定性和对蛋白酶的抗性ꎮ这种自然保护系统可用于设计新的延长半衰期的生物疗法ꎮ此外ꎬ寡糖基化合物还具有增大尺寸㊁通过在蛋白质中添加负电荷来降低肾清除㊁调节受体介导的内吞作用㊁防止蛋白水解降解等作用ꎬ使糖基化成为延长治疗半衰期的常用方法[４４]ꎮ糖基化位点的引入增加了肽或蛋白质的负电荷ꎬ导致肾清除速度减慢[４５]ꎮ商用ＥＰＯ类似物ꎬＤａｒｂａｐｏｉｅｔｉｎα含有两个额外的Ｎ糖ꎬ其半衰期为２６.３ｈꎬ是原生半衰期的３倍ꎮ５.１㊀聚唾液酸化(ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ)天然产生的唾液酸聚合物(ＰＳＡ)是碳水化合物链ꎬ可生物降解ꎬ在自然界高度亲水ꎬ在体内并没有确定的受体ꎮ因此ꎬ翻译后修饰的治疗肽和蛋白质末端唾液酸能改善药物的药代动力学ꎬ降低免疫原性ꎬ从而改善他们的整体效率[４６]ꎮＪａｉｎ等[４７]研究发现ꎬ多唾液酸化胰岛素对于糖尿病的治疗具有明显的治疗价值ꎮ他们发现与正常胰岛素相比ꎬ胰岛素与２２ｋＤＰＳＡ聚合物结合ꎬ体内治疗显示它能较长时间地降低血糖水平ꎬ延长药物作用时间ꎮ类似的结果也发生在其他几项蛋白疗法研究中ꎬ如抑肽酶和ＩｇＧ免疫球蛋白ꎮ聚唾液酸化的丁酰胆碱酯酶(ｂＣｈＥ)ꎬ使它在小鼠体内半衰期从３ｈ延长到１４ｈꎮ多种多唾液酸生物治疗药物正在临床开发中ꎬ如ＰＳＡ￣ＥＰＯ(ＥｒｅｐｏＸｅｎ)㊁ＰＳＡ￣ＤＮａｓｅⅠ(ＰｕｌｌｍｏＸｅｎ)㊁ＰＳＡ￣ＲＦⅧ等ꎮ５.２㊀ＨＥＰｙｌａｔｉｏｎ肝素前体(ＨＥＰ)是一种天然多糖ꎬ水溶性好ꎮＨＥＰ作为肝素的前体ꎬ它被机体认为是体内物质ꎬ因此不会产生任何免疫原性问题[４８]ꎮＷｅｉ等[４９]用肝素前体代替ＰＥＧ与重组人粒集落刺激因子(Ｇ￣ＣＳＦ)结合ꎬ在小鼠体内长时间重复剂量给药ꎬ并不会引起毒性反应及免疫原性反应ꎬ肝素前体是一种安全的ＰＥＧ替代品ꎮ因此ꎬ它被认为可用于延长半衰期ꎬ并且可做为生物降解的一个很好的选择ꎮ肝素前体及其衍生物因具有作为多种药物制剂的潜力备受关注ꎮ肝素前体在血液中的半衰期为１５ｈ~８ｄꎬ这取决于分子量和给药途径ꎮ６㊀展望长效蛋白药物具有极大临床优势ꎬ延长半衰期已成为许多生物疗法发展的一个重要策略ꎬ诸多长效蛋白药物已成功开发上市ꎮ长效创新药使给药频次大大降低㊁依从度更高㊁治疗效果更优ꎮ随着生物技术的发展ꎬ也给长效化带来了新的思路ꎬ开发其他剂型及给药途径也日益受到关注ꎮ研究人员开发了各类药物传递系统(ＤＤＳ)ꎬ包括缓释注射剂㊁植入剂㊁微球注射剂[５０]㊁脂质体注射剂[５１]及纳米粒注射剂[５２]等ꎮ目的是通过载体控制药物的释放㊁提高药物的稳定性ꎬ同时提高难溶药物的溶解性及靶向性ꎮ研究者也尝试通过口服或经皮给药替代注射给药途径ꎮ在长效策略研发过程中也有一些挑战需要解决ꎬ临床安全和免疫原性问题一直存在ꎮ对任何延长半衰期的策略进行充分的ＰＫ和ＰＤ研究ꎬ消除副作用ꎬ同时也要综合考虑药物特性㊁生物因素㊁临床需求㊁生产成本等各方面因素ꎮ从长远来看ꎬ蛋白及多肽类药物的长效化具有重要的临床意义和广阔的市场前景ꎮ虽然许多新颖的延长半衰期的策略仍处于临床前阶段ꎬ但是可以预测越来越多的此类技术将会克服发展障碍ꎬ并在未来的临床试验中得到评估ꎬ研发出活性更好且更加长效的蛋白多肽类药物ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＫＥＳＩＫ￣ＢＲＯＤＡＣＫＡＭ.Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｄｅｖｅｌ￣ｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ａｐｐｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.ꎬ２０１８ꎬ６５(３):３０６－３２２.[２]㊀ＤＩＡＯＬꎬＭＥＩＢＯＨＭＢ.Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ￣ｉｃ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓ[Ｊ].Ｃｌｉｎ.Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ.ꎬ２０１３ꎬ５２(１０):８５５－８６８. [３]㊀ＫＯＮＴＥＲＭＡＮＮＲＥ.Ｈａｌｆ￣ｌｉｆｅｅｘｔｅｎｄｅｄｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ[Ｊ].Ｅｘｐｅｒｔ.Ｏｐｉｎ.Ｂｉｏｌ.Ｔｈｅｒ.ꎬ２０１６ꎬ１６(７):９０３－９１５. [４]㊀ＪＥＶŠＥＶＡＲＳꎬＫＵＮＳＴＥＬＪＭꎬＰＯＲＥＫＡＲＶＧ.ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｊ.ꎬ２０１０ꎬ５(１):１１３８０３生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.－１２８.[５]㊀ＺＨＡＮＧＣꎬＤＥＳＡＩＲꎬＰＥＲＥＺ￣ＬＵＮＡＶꎬｅｔａｌ..ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎｏｆｌｙｓｉｎｅｒｅｓｉｄｕｅｓｉｍｐｒｏｖｅｓｔｈｅｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｗｈｉｌｅｒｅｔａｉｎｉｎｇｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ９(８):１０３３－１０４３.[６]㊀ＳＷＩＥＲＣＺＥＷＳＫＡＭꎬＬＥＥＫＣꎬＬＥＥＳꎬｅｔａｌ..ＷｈａｔｉｓｔｈｅｆｕｔｕｒｅｏｆＰＥＧｙｌａｔｅｄｔｈｅｒａｐｉｅｓ?[Ｊ].Ｅｘｐｅｒｔ.Ｏｐｉｎ.Ｅｍｅｒｇ.Ｄｒｕｇｓꎬ２０１５ꎬ２０(４):５３１－５３６.[７]㊀ＡＲＶＥＤＳＯＮＴꎬＫＥＬＬＹＪＯꎬＹＡＮＧＢＢ.Ｄｅｓｉｇｎｒａｔｉｏｎａｌｅａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｐｅｇｆｉｌｇｒａｓｔｉｍａｓａｌｏｎｇ￣ａｃｔｉｎｇｇｒａｎｕ￣ｌｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙ￣ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ[Ｊ].ＢｉｏＤｒｕｇｓꎬ２０１５ꎬ２９(３):１８５－１９８.[８]㊀ＦＵＣＨꎬＳＡＫＡＭＯＴＯＫＭ.ＰＥＧ￣ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ[Ｊ].ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎ.Ｐｈａｒｍ.ꎬ２００７ꎬ８(１２):１９７７－１９８４.[９]㊀ＭＯＬＩＮＥＵＸＧ.Ｔｈｅｄｅｓｉｇｎａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｐｅｇｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ(ＰＥＧ￣ｒｍｅｔＨｕＧ￣ＣＳＦꎬＮｅｕｌａｓｔａ)[Ｊ].Ｃｕｒｒ.Ｐｈａｒｍ.Ｄｅｓ.ꎬ２００４ꎬ１０(１１):１２３５－１２４４.[１０]㊀ＳＴＥＮＮＩＣＫＥＨＲꎬＫＪＡＬＫＥＭꎬＫＡＲＰＦＤＭꎬｅｔａｌ..ＡｎｏｖｅｌＢ￣ｄｏｍａｉｎＯ￣ｇｌｙｃｏＰＥＧｙｌａｔｅｄＦＶＩＩＩ(Ｎ８￣ＧＰ)ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓｆｕｌｌｅｆｆｉｃａｃｙａｎｄｐｒｏｌｏｎｇｅｄｅｆｆｅｃｔｉｎｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃｍｉｃｅｍｏｄｅｌｓ[Ｊ].Ｂｌｏｏｄꎬ２０１３ꎬ１２１(１１):２１０８－２１１６.[１１]㊀ＭＯＺＡＲＦＳꎬＣＨＯＷＤＨＵＲＹＥＨ.ＩｍｐａｃｔｏｆＰＥＧｙｌａｔｅｄｎａｎｏ￣ｐａｒｔｉｃｌｅｓｏｎｔｕｍｏｒｔａｒｇｅｔｅｄｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙ[Ｊ].Ｃｕｒｒ.Ｐｈａｒｍ.Ｄｅ￣ｓｉｇｎꎬ２０１８ꎬ２４(２８):２４９７－２５０８.[１２]㊀ＳＴＲＯＨＬＷＲ.Ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓｆｏｒｈａｌｆ￣ｌｉｆｅｅｘｔｅｎｓｉｏｎｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃｓａｓａｓｔｒａｔｅｇｙｔｏｍａｋｅｂｉｏｂｅｔｔｅｒｓ[Ｊ].Ｂｉｏｄｒｕｇｓꎬ２０１５ꎬ２９(４):２１５－２３９.[１３]㊀ＰＯＤＵＳＴＶＮꎬＳＩＭＢＣꎬＫＯＴＨＡＲＩＤꎬｅｔａｌ..Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｏｆｉｎｖｉｖｏｈａｌｆ￣ｌｉｆｅｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｐｅｐｔｉｄｅｓｖｉａｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｊｕ￣ｇａｔｉｏｎｔｏＸＴＥＮｐｒｏｔｅｉｎｐｏｌｙｍｅｒｓ[Ｊ].ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ.Ｄｅｓ.Ｓｅｌ.ꎬ２０１３ꎬ２６(１１):７４３－７５３.[１４]㊀ＧＥＥＴＨＩＮＧＮＣꎬＴＯＷꎬＳＰＩＮＫＢＪꎬｅｔａｌ..Ｇｃｇ￣ＸＴＥＮ:ａｎｉｍｐｒｏｖｅｄｇｌｕｃａｇｏｎｃａｐａｂｌｅｏｆｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａｗｉｔｈｏｕｔｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｂａｓｅｌｉｎｅｂｌｏｏｄｇｌｕｃｏｓｅ[Ｊ/ＯＬ].ＰＬｏＳＯＮＥꎬ２０１０ꎬ５(４):ｅ１０１７５[２０２１－０４－０６].ｈｔｔｐｓ:ｄｏｉ.ｏｒｇ/１０.１３７１/ｊｏｕｒｎａｌ.ｐｏｎｅ.００１０１７５.[１５]㊀ＡＬＴＥＲＳＳＥꎬＭＣＬＡＵＧＨＬＩＮＢꎬＳＰＩＮＫＢꎬｅｔａｌ..ＧＬＰ２￣２Ｇ￣ＸＴＥＮ:Ａｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｉｍｐｒｏｖｅｄｓｅｒｕｍｈａｌｆ￣ｌｉｆｅａｎｄｅｆｆｉｃａｃｙｉｎａｒａｔＣｒｏｈｎ ｓｄｉｓｅａｓｅｍｏｄｅｌ[Ｊ/ＯＬ].ＰＬｏＳＯＮＥꎬ２０１２ꎬ７(１１):ｅ５０６３０[２０２１－０４－０６].ｈｔｔｐｓ://ｄｏｉ.ｏｒｇ/１０.１３７１/ｊｏｕｒｎａｌ.ｐｏｎｅ.００５０６３０.[１６]㊀ＤＩＮＧＳꎬＳＯＮＧＭꎬＳＩＭＢＣꎬｅｔａｌ..ＭｕｌｔｉｖａｌｅｎｔａｎｔｉｖｉｒａｌＸＴＥＮ￣ｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｊｕｇａｔｅｓｗｉｔｈｌｏｎｇｉｎｖｉｖｏｈａｌｆ￣ｌｉｆｅａｎｄｅｎ￣ｈａｎｃｅｄｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ[Ｊ].Ｂｉｏｃｏｎ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２０１４ꎬ２５(７):１３５１－１３５９.[１７]㊀ＳＣＨＬＡＰＳＣＨＹＭꎬＢＩＮＤＥＲＵꎬＢÖＲＧＥＲＣꎬｅｔａｌ..ＰＡＳｙｌａ￣ｔｉｏｎ:ａｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｔｏＰＥＧｙｌａｔｉｏｎｆｏｒｅｘｔｅｎｄｉｎｇｔｈｅｐｌａｓｍａｈａｌｆ￣ｌｉｆｅｏｆｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ.Ｄｅｓ.Ｓｅｌ.ꎬ２０１３ꎬ２６(８):４８９－５０１.[１８]㊀ＧＥＢＡＵＥＲＭꎬＳＫＥＲＲＡＡ.ＰｒｏｓｐｅｃｔｓｏｆＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ ｆｏｒｔｈｅｄｅｓｉｇｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｐｅｐｔｉｄｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓｗｉｔｈｅｘｔｅｎｄｅｄｈａｌｆ￣ｌｉｆｅａｎｄｅｎｈａｎｃｅｄａｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｒｇ.Ｍｅｄ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２０１８ꎬ２６(１０):２８８２－２８８７.[１９]㊀ＢＩＮＤＥＲＵꎬＳＫＥＲＲＡＡ.ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ:ａｖｅｒｓａｔｉｌｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｔｏｅｘｔｅｎｄｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙ[Ｊ].Ｃｕｒｒ.Ｏｐｉｎ.ＣｏｌｌｏｉｄＩｎｔｅｒｆａｃｅＳｃｉ.ꎬ２０１７ꎬ３１:１０－１７.[２０]㊀ＡＨＭＡＤＰＯＵＲＳꎬＨＯＳＳＥＩＮＩＭＥＨＲＳＪ.ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎａｓａｐｏｗ￣ｅｒｆｕｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ[Ｊ].Ｃｕｒｒ.ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ.ꎬ２０１８ꎬ１５(３):３３１－３４１.[２１]㊀ＳＨＡＭＬＯＯＡꎬＲＯＳＴＡＭＩＰꎬＭＡＨＭＯＵＤＩＡ.ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎｅｎ￣ｈａｎｃｅｓｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙꎬｐｏｔｅｎｃｙꎬａｎｄｐｌａｓｍａｈａｌｆ￣ｌｉｆｅｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα￣２ａ:ａｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｙｎａｍｉｃｓｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ/ＯＬ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｊ.ꎬ２０２０ꎬ１５(８):３８５[２０２１－０４－０６].ｈｔｔｐｓ://ｄｏｉ.ｏｒｇ/１０.１００２/ｂｉｏｔ.２０１９００３８５.[２２]㊀ＢＯＬＺＥＦꎬＭＯＲＡＴＨＶꎬＢＡＳＴＡꎬｅｔａｌ..Ｌｏｎｇ￣ａｃｔｉｎｇＰＡＳｙ￣ｌａｔｅｄｌｅｐｔｉｎａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓｏｂｅｓｉｔｙｂｙｐｒｏｍｏｔｉｎｇｓａｔｉｅｔｙａｎｄｐｒｅｖｅｎ￣ｔｉｎｇｈｙｐｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｌｅｐｔｉｎ￣ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｌｅｐ(ｏｂ/ｏｂ)ｍｉｃｅ[Ｊ].Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙꎬ２０１６ꎬ５７(１):２３３－２４４.[２３]㊀ＦＡＬＶＯＥꎬＴＲＥＭＡＮＴＥＥꎬＡＲＣＯＶＩＴＯＡꎬｅｔａｌ..Ｉｍｐｒｏｖｅｄｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｆｅｒｒｉｔｉｎ￣ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓｂｅａｒｉｎｇｐｒｏｌｉｎｅꎬｓｅｒｉｎｅꎬａｎｄａｌａｎｉｎｅｅｌｅｍｅｎｔｓ[Ｊ].Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２０１６ꎬ７(２):５１４－５２２. [２４]㊀ＭＡＣＥＷＡＮＳＲꎬＣＨＩＬＫＯＴＩＡ.Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｅｌａｓｔｉｎ￣ｌｉｋｅｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓｉｎｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙ[Ｊ].Ｊ.ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅꎬ２０１４ꎬ１９０:３１４－３３０.[２５]㊀ＹＥＢＯＡＨＡꎬＣＯＨＥＮＲꎬＲＡＢＯＬＬＩＣ.Ｅｌａｓｔｉｎ￣ｌｉｋｅｐｏｌｙｐｅｐ￣ｔｉｄｅｓ:ａｓｔｒａｔｅｇｉｃｆｕｓｉｏｎｐａｒｔｎｅｒｆｏｒｂｉｏｌｏｇｉｃｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１６ꎬ１１３(８):１６１７－１６２７.[２６]㊀ＦＬＥＴＣＨＥＲＥＥꎬＹＡＮＤꎬＫＯＳＩＢＡＡＡꎬｅｔａｌ..Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ￣ｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｅｌａｓｔｉｎ￣ｌｉｋｅｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓａｎｄｔｈｅｉｎｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｃｙｃｌｅｉｎｔｈｅｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｉｎｄｕｓｔｒｙｓ[Ｊ].ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐ.Ｐｕｒｉｆ.ꎬ２０１９ꎬ１５３:１１４－１２０.[２７]㊀ＡＭＩＲＡＭＭꎬＬＵＧＩＮＢＵＨＬＫＭꎬＬＩＸꎬｅｔａｌ..Ａｄｅｐｏｔ￣ｆｏｒｍｉｎｇｇｌｕｃａｇｏｎ￣ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ￣１ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｒｅｄｕｃｅｓｂｌｏｏｄｇｌｕｃｏｓｅｆｏｒｆｉｖｅｄａｙｓｗｉｔｈａｓｉｎｇｌｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＣｏｎｔｒｏｌＲｅ￣ｌｅａｓｅꎬ２０１３ꎬ１７２:１４４－１５１.[２８]㊀ＳＨＡＭＪＩＭＦꎬＢＥＴＲＥＨꎬＫＲＡＵＳＶＢꎬｅｔａｌ..Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｒｍａｌｌｙｒｅ￣ｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌａｓｔｉｎ￣ｌｉｋｅｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅａｎｄｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ￣１ｒｅｃｅｐｔｏｒａｎ￣ｔａｇｏｎｉｓｔ:ｓｕｓｔａｉｎｅｄｒｅｌｅａｓｅｏｆａｌｏｃａｌａｎｔｉ￣ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｔｈｅｒａ￣ｐｅｕｔｉｃ[Ｊ].Ａｒｔｈｒ.Ｒｈｅｕｍ.ꎬ２００７ꎬ５６:３６５０－３６６１.[２９]㊀ＳＯＣＫＯＬＯＳＫＹＪＴꎬＳＺＯＫＡＦＣ.ＴｈｅｎｅｏｎａｔａｌＦｃｒｅｃｅｐｔｏｒꎬＦｃＲｎꎬａｓａｔａｒｇｅｔｆｏｒｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙａｎｄｔｈｅｒａｐｙ[Ｊ].Ａｄｖ.ＤｒｕｇＤｅｌ.Ｒｅｖ.ꎬ２０１５ꎬ９１:１０９－１２４.[３０]㊀ＷＡＲＤＥＳꎬＯＢＥＲＲＪ.ＴａｒｇｅｔｉｎｇＦｃＲｎｔｏｇｅｎｅｒａｔｅａｎｔｉｂｏｄｙ￣ｂａｓｅｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓｔｒｅｎｄｓ[Ｊ].Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.Ｓｃｉ.ꎬ２０１８ꎬ３９(１０):８９２－９０４.[３１]㊀ＢＬＡＩＲＨＡꎬＫＥＡＴＩＮＧＧＭ.Ａｌｂｉｇｌｕｔｉｄｅ:ａｒｅｖｉｅｗｏｆｉｔｓｕｓｅｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ[Ｊ].Ｄｒｕｇｓꎬ２０１５ꎬ７５(６):６５１－６６３.[３２]㊀ＫＡＰＩＴＺＡＣꎬＮＯＳＥＫＬꎬＪＥＮＳＥＮＬꎬｅｔａｌ..Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅꎬａｏｎｃｅ￣ｗｅｅｋｌｙｈｕｍａｎＧＬＰ￣１ａｎａｌｏｇꎬｄｏｅｓｎｏｔｒｅｄｕｃｅｔｈｅｂｉｏ￣ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｏｒａｌｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅꎬｅｔｈｉｎｙｌｅｓｔｒａｄｉｏｌ/ｌｅｖｏｎｏｒｇｅｓｔｒｅｌ[Ｊ].Ｃｌｉｎ.Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.ꎬ２０１５ꎬ５５(５):４９７－５０４.[３３]㊀ＬＡＵＪꎬＢＬＯＣＨＰꎬＳＣＨＡＦＦＥＲＬꎬｅｔａｌ..Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｔｈｅｏｎｃｅ￣ｗｅｅｋｌｙｇｌｕｃａｇｏｎ￣ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ￣１(ＧＬＰ￣１)ａｎａｌｏｇｕｅｓｅｍａ￣ｇｌｕｔｉｄｅ[Ｊ].Ｊ.Ｍｅｄ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２０１５ꎬ５８(１８):７３７０－７３８０. [３４]㊀ＳＬＥＥＰＤ.Ａｌｂｕｍｉｎａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙ[Ｊ].９０３庞丽然ꎬ等:蛋白多肽类药物长效化技术研究策略. All Rights Reserved.Ｅｘｐｅｒｔ.Ｏｐｉｎ.ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ.ꎬ２０１５ꎬ１２(５):７９３－８１２. [３５]㊀ＲＯＧＥＲＳＢꎬＤＯＮＧＤＹꎬＬＩＺＪ.Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｎｏｖｅｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙａｎｄｔｈｅｒａｐｙ[Ｊ].Ｃｕｒｒ.Ｐｈａｒｍ.Ｄｅｓ.ꎬ２０１５ꎬ２１(１４):１８９９－１９０７.[３６]㊀ＲＡＴＨＴꎬＢＡＫＥＲＫꎬＤＵＭＯＮＴＪＡꎬｅｔａｌ..Ｆｃ￣ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄＦｃＲｎ:ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｉｎｓｉｇｈｔｓｆｏｒｌｏｎｇｅｒ￣ｌａｓｔｉｎｇａｎｄｍｏｒｅｅｆｆｅｃ￣ｔｉｖｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ[Ｊ].Ｃｒｉｔ.Ｒｅｖ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１５ꎬ３５(２):２３５－２５４.[３７]㊀ＪＡＦＡＲＩＲꎬＺＯＬＢＡＮＩＮＮＭꎬＲＡＦＡＴＰＡＮＡＨＨＳꎬｅｔａｌ..Ｆｃ￣ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｈｅｒａｐｙ:ａｎｕｐｄａｔｅｄｖｉｅｗ[Ｊ].Ｃｕｒｒ.Ｍｅｄ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２０１７ꎬ２４(１２):１２２８－１２３７.[３８]㊀ＳＣＨＥＥＮＡＪ.Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ(ＬＹ￣２１８９２６５)ｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓ[Ｊ].ＥｘｐｅｒｔＲｅｖ.Ｃｌｉｎ.Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.ꎬ２０１６ꎬ９(３):３８５－３９９.[３９]㊀ＤＵＣＯＲＥＪＭꎬＭＩＧＵＥＬＩＮＯＭＧꎬＰＯＷＥＬＬＪＳ.Ａｌｐｒｏｌｉｘ(ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＦａｃｔｏｒＩＸＦｃｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ):ｅｘｔｅｎｄｅｄｈａｌｆ￣ｌｉｆｅｐｒｏｄｕｃｔｆｏｒｔｈｅｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｈｅｍｏｐｈｉｌｉａＢ[Ｊ].Ｅｘｐｅｒｔ.Ｒｅｖ.Ｈｅｍａｔｏｌ.ꎬ２０１４ꎬ７(５):５５９－５７１.[４０]㊀ＨＯＹＳＭ.Ｅｆｔｒｅｎｏｎａｃｏｇａｌｆａ:ａｒｅｖｉｅｗｉｎｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａＢ[Ｊ].Ｄｒｕｇｓꎬ２０１７ꎬ７７(１１):１２３５－１２４６.[４１]㊀ＭＩＧＵＥＬＩＮＯＭＧꎬＰＯＷＥＬＬＪＳ.Ｃｌｉｎｉｃａｌｕｔｉｌｉｔｙａｎｄｐａｔｉｅｎｔｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｏｎｔｈｅｕｓｅｏｆｅｘｔｅｎｄｅｄｈａｌｆ￣ｌｉｆｅｒＦＩＸＦｃｉｎｔｈｅｍａｎ￣ａｇｅｍｅｎｔｏｆｈｅｍｏｐｈｉｌｉａＢ[Ｊ].Ｐａｔｉｅｎｔ.Ｐｒｅｆｅｒ.Ａｄｈｅｒｅｎｃｅꎬ２０１４ꎬ８:１０７３－１０８３.[４２]㊀ＳＯＮＯＤＡＨꎬＭＯＲＩＭＯＴＯＨꎬＹＯＤＥＮＥ.Ａｂｌｏｏｄ￣ｂｒａｉｎ￣ｂａｒｒｉｅｒ￣ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇａｎｔｉ￣ｈｕｍａｎｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒａｎｔｉｂｏｄｙｆｕ￣ｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｆｏｒｎｅｕｒｏｎｏｐａｔｈｉｃｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓＩＩ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｔｈｅｒ.ꎬ２０１８２６(５):１３６６－１３７４.[４３]㊀ＷＡＮＧＹꎬＳＨＡＯＪꎬＺＡＲＯＪＬꎬｅｔａｌ..Ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ￣ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎａｓａｎｏｖｅｌｌｏｎｇ￣ａｃｔｉｎｇｉｎｓｕｌｉｎａｎａｌｏｇｆｏｒｔｈｅｉｎｈｉ￣ｂｉｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃｇｌｕｃｏｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｄｉａｂｅｔｅｓꎬ２０１４ꎬ６３(５):１７７９－１７８８.[４４]㊀ＣｏｓｔａＡＲꎬＲｏｄｒｉｇｕｅｓＭＥꎬＨｅｎｒｉｑｕｅｓＭꎬｅｔａｌ..Ｇｌｙｃｏｓｙｌａ￣ｔｉｏｎ:ｉｍｐａｃｔꎬｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｄｕｒｉｎｇｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｃｒｉｔ.Ｒｅｖ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１４ꎬ３４(４):２８１－２９９.[４５]㊀ＫＩＭＣＨＩ￣ＳＡＲＦＡＴＹＣꎬＳＣＨＩＬＬＥＲＴꎬＨＡＭＡＳＡＫＩ￣ＫＡＴＡＧＩＲＩＮꎬｅｔａｌ..Ｂｕｉｌｄｉｎｇｂｅｔｔｅｒｄｒｕｇｓ:ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒｍａｃｏｌ.Ｓｃｉ.ꎬ２０１３ꎬ３４(１０):５３４－５４８.[４６]㊀ＧＬＡＮＴＳＣＨＮＩＧＨꎬＢＡＵＥＲＡꎬＢＥＮＡＭＡＲＡＫꎬｅｔａｌ..Ｅｖａｌ￣ｕａｔｉｏｎｏｆｆａｃｔｏｒⅧｐｏｌｙｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ:ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｌｏｎｇｅｒ￣ａｃｔ￣ｉｎｇｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｔｈｅｒａｐｙｉｎｍｉｃｅａｎｄｍｏｎｋｅｙｓ[Ｊ].Ｊ.Ｐｈａｒｍａ￣ｃｏｌ.Ｅｘｐ.Ｔｈｅｒ.ꎬ２０１９ꎬ３７１(１):９５－１０５.[４７]㊀ＪＡＩＮＳꎬＨＲＥＣＺＵＫ￣ＨＩＲＳＴＤＨꎬＭＣＣＯＲＭＡＣＫＢꎬｅｔａｌ..Ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌａｔｅｄｉｎｓｕｌｉｎ:ｓｙｎｔｈｅｓｉｓꎬｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｖｉｖｏ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｉｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ａｃｔａꎬ２００３ꎬ１６２２(１):４２－４９.[４８]㊀ＤＥＡＮＧＥＬＩＳＰＬ.Ｈｅｐａｒｏｓａｎꎬａｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌｌｙｇｏｏｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇｖｅｈｉｃｌｅｆｏｒｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｉｎｊｅｃｔａｂｌｅｔｈｅｒａ￣ｐｅｕｔｉｃｓ[Ｊ].ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎ.ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ.ꎬ２０１５ꎬ１２(３):３４９－３５２[４９]㊀ＪＩＮＧＷꎬＲＯＢＥＲＴＳＪＷꎬＧＲＥＥＮＤＥꎬｅｔａｌ..Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｒｏｓａｎ￣ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ￣ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ:ａｎａｔｕｒａｌｓｕｇａｒ￣ｂａｓｅｄｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙｓｙｓｔｅｍｔｏｔｒｅａｔｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ[Ｊ].Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ２７(１１):１０５２－１０６１. [５０]㊀ＭＡＧＨ.Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｄｒｕｇｓｆｏｒｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙ:ｓｔｒａｔｅｇｙꎬｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎꎬａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｊ.ＣｏｎｔｒｏｌＲｅｌｅａｓｅꎬ２０１４ꎬ１９３:３２４－３４０.[５１]㊀ＯＫＵＮ.ＩｎｎｏｖａｔｉｏｎｓｉｎｌｉｐｏｓｏｍａｌＤＤＳｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉ￣ｃａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｖａｒｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ[Ｊ].Ｂｉｏｌ.Ｐｈａｒｍ.Ｂｕｌｌ.ꎬ２０１７ꎬ４０(２):１１９－１２７.[５２]㊀ＳＡＫＡＩ￣ＫＡＴＯＫ.Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆａｎａｌｙｔｉｃａｌｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒｅｖａｌｕａ￣ｔｉｏｎｏｆｎａｎｏ￣ＤＤＳｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＹａｋｕｇａｋｕＺａｓｓｈｉ.ꎬ２０１９ꎬ１３９(２):２５５－２６０.０１３生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.。
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略前言重组蛋白的制备在蛋白结构分析和医疗应用领域十分重要。
药物蛋白的研究需要高纯度的重组蛋白来进行药物动力学和物理化学的研究[1]。
重组蛋白在检测酶活、连接配体、蛋白相互作用等生物学领域广泛应用。
已经表达出多种重组蛋白被证明有很大的应用潜力[2,3]。
通过基因工程改造的方法已经获得了许多性状优良的宿主菌表达系统，尤其是通过大肠杆菌可以大量表达外源基因编码的重组蛋白[4]。
但是仍然有两个问题制约着大肠杆菌表达系统对重组蛋白的表达：一个是表达量低，还有一个就是表达错误折叠的蛋白包涵体[5]。
蛋白的表达和纯化工艺一直在发展进步，但是超过30%的重组蛋白为不具有生物活性的包涵体，严重影响了重组蛋白的生产应用[6,7]。
在理想条件下，重组蛋白由强启动子进行表达，产生大量的具有生物学活性的可溶性重组蛋白。
但是，强启动子会导致重组蛋白的过表达,从而影响宿主菌体的生长并产生包涵体[8]。
在某些条件下可以通过变性、复性的方法使包涵体恢复活性[9]，但是复性后的蛋白是否能够完全恢复活性仍然未可知。
一般来讲，可以通过表达条件的优化来促进蛋白的可溶性表达，比如：诱导温度、培养基组成、宿主菌的种类。
还可以通过多种方案来解决蛋白不溶的问题：蛋白重新折叠[10]，构建融合蛋白[11]。
另外想要进一步增加蛋白可溶性可以与分子伴侣共表达[8]或者低温诱导[12]。
本文对目前主要的促进蛋白可溶表达的方法进行了比较全面的总结。
1.大肠杆菌表达系统的构建1.1选择表达宿主菌对于大规模的表达重组蛋白，一般选择胞内表达或者周质空间表达。
与周质空间表达相比，胞内表达的表达量更高，因此应用更为广泛。
在实验研究和实际生产中，已经有很多大肠杆菌表达系统广泛应用于。
在表达体系中较为常用的大肠杆菌为B菌株和K12菌株及它们的衍生菌株（表1[13]）。
美国国立研究院已经认证了K12菌株的标准性以及安全的使用方案，因此K12菌株在生产应用中具有极大的优势。
重组蛋白疫苗指导原则
重组蛋白疫苗指导原则重组蛋白疫苗是目前应用最广泛的疫苗之一，具有安全、稳定、易于生产等优点，被广泛应用于预防多种传染病。
但是，对于不同类型的疫苗，其指导原则也有所不同。
今天我们将重点介绍“重组蛋白疫苗指导原则”，以帮助大家更好地了解该类型疫苗应用的规范。
第一步：优化疫苗组分在设计重组蛋白疫苗时，需要选择具有代表性和高度抗原性的病原体蛋白作为疫苗原料，并通过合理的技术手段，将其纯化、结构化，形成高质量的重组蛋白。
同时还需要考虑适宜的辅料、佐剂等组分，以提高疫苗抗原性和免疫效果。
第二步：确定免疫方案重组蛋白疫苗的免疫方案一般由疫苗剂量、接种次数、接种时间和接种途径等因素组成。
在这一步中，需要根据临床试验数据、动物实验数据以及流行病学调查结果等多方面的信息，确定最优化的免疫方案。
同时还需要注意不同年龄段和感染状态的人群可能存在免疫差异，需要有针对性地制定免疫计划。
第三步：进行临床试验在充分考虑疫苗安全性、有效性和良好耐受性的基础上，需要进行临床试验，以评估疫苗的药理学、毒理学、免疫学和安全性等方面的性能。
同时还需要确定合适的试验对象、试验方案和数据评价标准，以确保试验结果准确可靠。
第四步：制定应用规范在充分评估和论证的基础上，需要对重组蛋白疫苗的应用规范进行制定，明确疫苗的适应症、免疫方案、接种途径、免疫计划和剂量、不良反应及其处理等方面的内容，以指导临床应用和推广。
同时还需要建立健全的技术规范、质量标准和监管措施，以确保疫苗的质量和安全性。
综上所述，“重组蛋白疫苗指导原则”是一个系统性的过程，需要包括优化疫苗组分、确定免疫方案、进行临床试验和制定应用规范等步骤。
只有在每个步骤都得到充分的认真论证和详细执行，才能保证疫苗的质量和安全性，并为疾病预防和控制做出贡献。
重组蛋白疫苗指导原则
重组蛋白疫苗指导原则
重组蛋白疫苗是一种常见的疫苗类型，其制备过程利用基因工程技术将病原体表面的重要抗原蛋白体外合成，然后经过纯化、修饰等处理制成疫苗。
在制备重组蛋白疫苗时，需要遵循以下指导原则：
1.选择合适的抗原蛋白：应选择病原体表面或内部结构中的重要抗原蛋白，以确保疫苗能够有效地激发免疫反应。
2.优化蛋白表达和纯化：应选用高效的表达系统和适当的纯化方法，以确保获得高纯度、高活性的重组蛋白。
3.加强蛋白修饰：应加强蛋白的修饰，如糖基化、磷酸化等，以增强其免疫原性和稳定性。
4.评价疫苗安全性：应进行充分的安全性评价，包括评估疫苗对宿主细胞和免疫系统的影响，以及疫苗接种后出现的不良反应和副作用。
5.优化疫苗免疫效果：应进行充分的免疫效果评价，包括评估疫苗在动物模型中的保护效果和人体免疫学反应，以及疫苗接种后产生的免疫记忆。
6.制定疫苗使用方案：应制定合理的疫苗使用方案，包括疫苗接种时间、剂量、接种途径等，以最大限度地提高疫苗的免疫效果。
总之，制备重组蛋白疫苗需要综合考虑多方面的因素，以确保疫苗的安全性、有效性和稳定性。
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重组蛋白长效化策略
引言：
重组蛋白是一种通过基因工程技术制备的蛋白质，具有广泛的应用前景。
然而，由于其天然蛋白质结构的特点，其生物活性往往受到限制，导致其在体内的半衰期较短，降低了其药效。
为了克服这一问题，研究人员提出了各种重组蛋白长效化策略，以延长其在体内的稳定性和活性。
本文将介绍几种常见的重组蛋白长效化策略，并讨论其原理和应用。
一、聚乙二醇化（PEGylation）
聚乙二醇化是一种常用的重组蛋白长效化方法。
其原理是将聚乙二醇（PEG）共价结合到蛋白质表面，形成PEG蛋白共轭物。
PEG的存在可以增加蛋白质的体积，减少其与其他生物分子的相互作用，从而延长其在体内的循环半衰期。
此外，PEG还可以保护蛋白质免受蛋白酶的降解。
二、Fc片段结合
Fc片段结合是一种通过结合免疫球蛋白G（IgG）Fc片段来延长重组蛋白在体内稳定性的方法。
Fc片段具有较长的半衰期，并且在体内稳定存在。
因此，将重组蛋白与Fc片段结合可以使其具有类似的稳定性和半衰期。
这种策略已经成功应用于多种重组蛋白药物的研发。
三、融合蛋白
融合蛋白是将重组蛋白与其他稳定的蛋白质结构域融合在一起的方法。
通过融合蛋白的方式，可以利用其他蛋白质的稳定性和活性来增强重组蛋白的稳定性。
例如，将重组蛋白与人血清白蛋白（HSA）融合可以提高其在体内的半衰期，并增强其稳定性。
四、多价化
多价化是一种将多个相同或不同的重组蛋白结合在一起形成多肽或蛋白复合物的方法。
多价化可以通过增加蛋白质的分子量和复杂性来延长其在体内的循环半衰期。
此外，多价化还可以增强蛋白质与受体结合的亲和力，提高其药效。
五、修饰蛋白结构
修饰蛋白结构是一种通过改变重组蛋白的氨基酸序列或结构来延长其在体内的稳定性和活性的方法。
例如，将重组蛋白的氨基酸序列中的酰化位点突变为不易被酶降解的氨基酸，可以提高其抗降解能力。
此外，通过改变蛋白质的空间结构，如引入二硫键等，也可以增强其稳定性。
结论：
重组蛋白长效化是提高重组蛋白在体内稳定性和活性的关键策略之一。
通过聚乙二醇化、Fc片段结合、融合蛋白、多价化和修饰蛋白结构等方法，可以延长重组蛋白的半衰期，增强其稳定性和药效。
这些重组蛋白长效化策略为重组蛋白药物的研发和临床应用提供了
重要的技术支持。
未来，随着科学技术的不断进步和创新，相信会有更多的重组蛋白长效化策略被开发出来，为重组蛋白的应用领域带来更大的突破和发展。