(完整word版)酶工程
第5章 酶工程1
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第5章 酶工程
包埋法的优缺点
• 优点:在于它是一种反应条件温和、很少改变酶结 构但是又较牢固的固定化方法。 • 缺点:因空间位阻会影响大分子底物的酶活性,有 时有漏出现象;只有小分子底物和产物可以通过高 聚物网架扩散,对那些底物和产物是大分子的酶并 不适合。
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第5章 酶工程
固定化酶的模式图
• 酶因其来源不同,用途不同,分离纯化 的步骤也不同。
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第5章 酶工程
酶的纯化过程,可分为三个阶段:
(1) 粗提
*
样品的收集 → 细胞的破碎 → 浸提全部蛋白 → 离心除杂→ 浓缩
(2) 部分纯化
初步纯化,可使用各种柱层析(色谱)
(3) 精制
酶的进一步精制纯化,可用制备式电泳或HPLC等
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第5章 酶工程
(1)酶液的粗提
1.细胞的破碎(超声波、机械研磨、匀浆机等) 2.缓冲液浸提(PBS、Tris-HCl等) 3.离心分离 4.浓缩 为防止酶的失活,在提取酶时应注意:
1.温度,尽可能在低温下(0-4度)进行。 2.缓冲液的pH值,多数为中性,以维持酶的稳定性和溶解度。 3.盐浓度适中,避免发生盐析。 4.适度搅拌,避免剧烈搅拌和产生泡沫。
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第5章 酶工程
(2)酶的纯化
• • • • 酶分子电荷性质 酶分子大小和形状 酶分子专一性结合 „„
• • • •
离子交换层析 凝胶过滤(分子筛) 亲和层析 „„
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第5章 酶工程
层析法的基本原理
• 利用混合物中各组分物理化学性质的差异(如吸附
力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等), 使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同,并
酶工程
酶工程:又称酶工艺,是围绕酶所特有的催化性能使其在工业、农业医疗保健事业及其其它各方面发挥作用的应用技术,主要为酶制剂的生产和应用。
酶工程的主要内容:1酶的发酵和产2酶的分离纯化3酶和细胞的固定化4酶的分子修饰5酶的发应动力学和反应器6酶电板/酶传感器7酶的应用8有机介质中的酶反应9抗体酶,人工酶和模拟酶使用微生物进行酶生产时,利用微生物的优点:1微生物的种类多,酶种丰富,菌株易诱变2微生物生长繁殖快,易提取酶3培养基价格便宜,微生物培养不受季节,地理限制4发酵生产易自动控制5易获得工程菌,提高酶产率,开发新酶培养基营养成分:碳源,氮源,无机盐,微量元素,生长因子,产酶促进剂发酵条件对产酶的影响因素:温度,PH,通气量,搅拌,泡沫,湿度提高酶产量的方法:1选育优良的产酶细胞株系2添加诱导物3控制阻遏物浓度4添加表面活性剂5添加产酶促进剂提高植物细胞产物产量的途径:1选择高产出的细胞株2代谢途径的调节3控制细胞生长和分化程度4诱导物或加入前体5两相培养及次生产物的释放6毛状根(发根)培养技术酶发酵动力学:研究在发酵过程中细胞生长速度,产物生成以及环境因子对这些速度的影响。
酶的分离纯化:包括三个基本环节:一是抽提,即把酶从材料转入溶剂中来制成酶溶液;二是纯化,即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来;三是制剂,即将酶制成各种剂型。
三个基本原则:1、注意防止酶的变性失活:(1)除少数情况外,所有操作必须在低温下进行,特别是有机溶剂存在时更要特别小心;(2)大多数酶在PH<4或PH>10的条件下不稳定,故不能过酸过碱(3)酶溶液常易形成泡沫而使酶变性,故应防止泡沫的形成(4)重金属能引起酶失活,有机溶剂能使酶变性,微生物污染,蛋白质使酶变性,都必须予以防止2、酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能除去,因此,在不破坏所需酶的条件下,可使用各种“激烈”手段。
此外,由于酶和它的底物,抑制剂等具有亲和性,当这些物质存在时,酶的理化性质和稳定性发生了一定变化,从而提供了更多条件和方法可供采用3、酶具有催化活性,检测酶活性,跟踪酶的来龙去脉,为选择适当的方法和条件提供了直接依据。
(完整word版)酶工程考试复习题及答案
酶工程考试复习题及答案一、名词解释题1.酶活力: 是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力的大小可用在一定条件下,酶催化某一化学反应的速度来表示,酶催化反应速度愈大,酶活力愈高,反之活力愈低。
2.酶的专一性: 是指一种酶只能对一种底物或一类底物起催化作用,对其他底物无催化作用的性质,一般又可分为绝对专一性和相对专一性。
3.酶的转换数:是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数,即是每摩尔酶每分钟催化底物转变为产物的摩尔数,是酶的一个指标。
4.酶的发酵生产:是指通过对某些特定微生物进行发酵培养后,利用微生物生长发酵过程中特定的代谢反应生成生产所需要的酶,最后通过提取纯化过程得到酶制剂的过程称为酶的发酵生产。
5.酶的反馈阻遏:6.细胞破碎:是指利用机械、物理、化学、酶解等方法,使目标细胞的细胞膜或细胞壁得以破坏,细胞中的目标产物得以选择性或全部释放便于后续收集和分离的过程称为细胞破碎。
7.酶的提取: 是指在一定的条件下,用适当的溶剂处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂中的过程,也称作酶的抽提,是酶分离纯化过程常用的手段之一。
8.沉淀分离:是通过改变某些条件,使溶液中某种溶质的溶解度降低,从溶液中沉淀析出,而与其他溶质分离的方法,常用语酶的初步提取与分离。
9.层析分离: 亦称色谱分离,是一种利用混合物中各组分的物理化学性质的差别,使各组分以不同程度分布在两个相中,其中一个相为固定的(称为固定相),另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分由于与固定相和流动相作用力的不同以不同速度移动,从而达到分离的物理分离方法。
10.凝胶层析: 又称为凝胶过滤,分子排阻层析,分子筛层析等。
是指以各种多孔凝胶为固定相,在流动相冲洗过程中混合物中所含各种组分的相对分子质量和分子大小不同,在固定相凝胶微孔中移动的距离不同,从而依次从层析柱中分离出来,达到物质分离的一种层析技术。
11.亲和层析: 是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力,将混合物装入层析柱中利用流动相的冲洗作用和目标分子与固定相配基亲和作用力不同而使生物分子分离纯化的技术。
第2章 酶工程
2 酶的活力测定
1个酶活力国际单位是指在特定条件下, 1min内生成1μmol产物的酶量(或转化1 μmol 底物的酶量)。
第二节 酶和细胞固定化
酶固定化技术发展史
20世纪60年代,以色列科学家发现酶的固定化现象。 1969年,千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于生产L-氨 基酸,开创了固定化酶应用于工业生产的先例; 1971年召开的第一届国际酶工程会议上,建议采用统一的 英文名称Immobilized Enzyme; 1973年,固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶连续生产L天冬氨酸。 1986年,利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄 糖氧化酶等相继获得成功。
葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等,活化生成亚
氨基碳酸酯衍生物,然后再与酶分子上的
氨基偶联,制成固定化酶。
任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰
法来活化。
烷基化和芳基化法
以卤素为功能团的载体可与酶蛋白分子上的氨基、
巯基、酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固
定化。
此法常用的载体有卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基 的衍生物。
网格型:包埋在高分子凝胶细微网格中。
将块状聚合形成的凝胶切成小块,或直接包埋在珠 状聚合物中,后者可以使固定化酶机械强度提高 10倍,并改进酶的脱落的情况。 常用的材料: 聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子物 质 淀粉、明胶、胶原、海藻酸和角叉胶等天然高分子 物质。
微囊型:包埋在高分子半透膜中。 膜既能形成类似细胞内的环境,又能阻止酶 的脱落或直接与微囊外的环境接触; 小分子底物能迅速通过膜与酶作用,产物也 能扩散出来。
对于无机载体,可用直接法和涂层法(用 活化物的聚合物如白蛋白或葡聚糖涂层)。
第一章酶工程(1)
瓜蛋白酶,用于除去啤酒中的蛋白质浑浊。 • 此后,酶的生产和应用逐步发展。然而在50年
代以前停留在从微生物,动物或植物中提取酶, 加以利用阶段.由于当时生产力落后,生产工艺 较繁杂,难以进行大规模工业化生产。
第一章酶工程(1)
• 60年代,是固定化酶技术迅速发展的时期。1969年,日本 的千烟一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基 酸生产L-氨基酸。出现了“酶工程”这个名词来代表有效 利用酶的科学技术领域。
第一章酶工程(1)
• 1971年第一届国际酶工程学术会议在美国召开,当时 的主题即是固定化酶,进一步开展了对微生物细胞 固定化的研究。
相对专一性:一种酶能够催化一类结构相似 的物质进行某种相同类型的反应(键专一性 和基团专一性)
第一章酶工程(1)
酶的专一性的确定
选择底物,确定最适条件 确定米氏常数
测试其它可能底物,确定专一性
第一章酶工程(1)
二、酶的催化效率
• 酶转换数Kcat:每个酶分子每分钟催化底物转 化为产物的分子数。也即是每摩尔酶每分钟催 化底物转化为产物的摩尔数。
• 酶的催化反应的速度比非酶反应高108-1020 倍,比非酶催化剂高107-1013倍。
?
酶可以使反应所需的活化能显著降低
第一章酶工程(1)
三、酶催化作用的条件
• 酶催化一般在常温、常压、pH近中性的 条件下进行。
第一章酶工程(1)
第三节 影响酶催化作用的因素
第一章酶工程(1)
• 1、底物浓度的影响
• 1896年,日本的高峰让吉首先从米曲霉中制得高 峰淀粉酶,用作消化剂,开创了有目的的进行酶生产 和应用的先例。
《酶工程实验》word版
实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义,测定过氧化氢酶的米氏常数。
二、实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2,未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定,根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶,以1/ν~1/[S]作图求Km三、实验器材1.锥形瓶100~150ml(×6)。
2.吸管1.0ml(×2)、0.5ml(×2)、2.0ml(×2)、5ml(×2)、10.0ml(×1)。
3.温度计(0~100℃)。
4.微量滴定管5ml(×1)。
5.容量瓶1000ml(×1)。
四、实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液(Ph7.0)取磷酸二氢钾 0.68g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml,用水稀释至100ml,即得。
2、酶液:称取马铃薯5g,加上述缓冲液10ml,匀浆,过滤。
3、0.02mol/L KMnO4:称取KMnO4(AR)3.2g,加蒸馏水1000ml,煮沸15min,2d后过滤,棕色瓶保存。
4、0.004mol/L KMnO4:准确称取恒重草酸钠0.2g,加250ml冷沸水及10ml浓硫酸,搅拌溶解,用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色,水浴,加热至65℃,继续滴定至溶液微红色并30s不褪,算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。
5、0.05 mol/L H2O2:取30% H2O223ml加入1000ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度(约0.2mol/L),用标准KMnO4(0.004mol/L)标定其准确浓度,稀释成0.05mol/L(标定前稀释4倍,取2.0ml,加25% H2SO42.0ml,用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色)。
6、25% H2SO4五、操作取锥形瓶6只,按下表顺序加入试剂:表一过氧化氢酶米氏常数的测定管号试剂0123450.05mol/L H2O2/ml蒸馏水/ml酶液/ml9.50.51.008.500.51.258.250.51.677.830.52.57.00.55.004.500.5先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水,加酶液后立即混合,依次记录各瓶的起始反应时间。
酶工程实验大纲
湖北大学酶工程实验(0818800193)实验教学大纲(第2版)生命科学学院生化教研室2014年7月前言课程名称:酶工程实验实验学时:16学时适用专业:生物工程课程性质:必修一、实验课程简介酶工程是生物工程的主要内容之一,是现代酶学和生物工程学相互结合而发展起来的一门新的技术学科.它将酶学、微生物学的基本原理与化工、发酵等工程技术有机结合起来,并随着酶学研究的迅速发展,特别是酶的广泛应用而在国民生产生活中日益发挥着越来越重要的作用。
酶工程实验课是生物工程等本科实验教学的一个重要组成部分,通过实验教学可以加强学生对酶工程基本知识和基本理论的理解,掌握现代酶学与相关技术的有关的基本的实验原理与技能。
在实验过程中要求学生自己动手,分析思考并完成实验报告。
酶工程实验性质有基础性、综合性、设计(创新)性三层次。
二、课程目的本实验课程主要根据酶工程的三大块内容即酶的生产、酶的改性与酶的应用来设计安排实验,通过这些实验内容,使学生深入理解酶工程课程的基本知识;巩固和加深所学的基本理论;掌握酶工程中基本的操作技能。
同时,通过实验培养学生独立观察、思考和分析问题、解决问题和提出问题的能力,养成实事求是、严肃认真的科学态度,以及敢于创新的开拓精神;并在实验中进一步提高学生的科学素养。
三、考核方式及成绩评定标准考核内容包括实验过程中的操作情况,实验记录及结果的准确性,实验报告的书写及结果分析,思考题的回答情况,仪器设备的使用情况及遵守实验室规章制度的情况等,根据这些方面进行成绩评判和记录,综合给出实验总成绩。
四、实验指导书及主要参考书1.魏群:生物工程技术实验指导,高等教育出版社,2002年8月。
2.禹邦超:酶工程(附实验),华中师范大学出版社,2007年8月五、实验项目实验项目一览表(可选)实验类型:演示性、验证性、综合性、设计性、其它实验一双酶法制备淀粉糖(3课时)一、实验原理目前国内外淀粉糖的生产大都采用双酶法。
酶工程
第一章酶工程1、什么是酶工程?酶工程研究的主要内容有哪些?酶工程(Enzyme Engineering)又称为酶技术。
酶工程是酶制剂的大批量生产和应用的技术。
它从应用的目的出发,将酶学理论与化学工程相结合研究酶,并在一定的反应装置中利用酶的催化特性,将原料转化为产物的一门新技术。
包括下列主要内容:酶的产生;酶的制备;酶和细胞固定化;酶分子修饰;有机介质中的酶反应;酶传感器(酶电极);酶反应器;抗体酶、人工酶和模拟酶;酶技术的应用2、酶分为哪几类?酶的组成和结构特点是什么?1.氧化还原酶(Oxidoreductase)包括脱氢酶(Dehydrogenase) 、氧化酶(Oxidase) 、过氧化物酶、细胞色素氧化酶等。
2.转移酶(Transferase⏹包括酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶等。
3.水解酶(Hydrolase)脂肪酶、糖苷酶、肽酶等,水解酶一般不需辅酶。
4.裂合酶(Lyase)这类酶可脱去底物上某一基团留下双键,或可相反地在双键处加入某一基团。
如醛缩酶、脱氨酶、脱羧酶5异构酶(Isomerase)此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化,分别进行外消旋、差向异构、顺反异构等6连接酶(合成酶)(Ligase or Synthetase)这类酶关系很多生命物质的合成,其特点是需要三磷酸腺苷等含高能磷酸键的物质作为结合能源,有的还需金属离子辅因子。
分别形成C-O键(与蛋白质合成有关)、C-S键(与脂肪酸合成有关)、C-C键和磷酸酯键。
7.核酶(Ribozyme⏹核酸酶是唯一的非蛋白酶。
它是一类特殊的RNA,能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。
3、目前公认的酶的作用机制有哪些?1)锁和钥匙模型(2)诱导契合模型4、酶作为催化剂的显著特点是什么?影响酶活性的因素有哪些?四、影响酶活力的因素激活剂酶浓度底物浓度pH温度抑制剂失活作用是指由于一些物理因素和化学试剂部分或全部破坏了酶的三维结构,即引起酶蛋白变性,导致部分或全部丧失活性。
(完整word版)酶工程_试题及答案
《酶工程》试题一参考答案:一、填空题(每空1分,共28分)1、日本称为“酵素”的东西,中文称为酶,英文则为Enzyme,是库尼(Kuhne)于1878年首先使用的。
其实它存在于生物体的细胞内与细胞外。
2、1926年,萨姆纳(Sumner)首先制得脲酶结晶,并指出酶的本质是蛋白质。
他因这一杰出贡献,获1947年度诺贝尔化学奖.3、目前我国广泛使用的高产糖比酶优良菌株菌号为As3.4309,高产液化酶优良菌株菌号为BF7。
658。
在微生物分类上,前者属于霉菌,后者属于细菌。
4、1960年,查柯柏(Jacob)和莫洛德(Monod)提出了操纵子学说,认为DNA分子中,与酶生物合成有关的基因有四种,即操纵基因、调节基因、启动基因和结构基因。
5、借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用,制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法.6、酶的分离纯化方法中,根据目的酶与杂质分子大小差别有凝胶过滤法,超滤法和超离心法三种。
7、由于各种分子形成结晶条件的不同,也由于变性的蛋白质和酶不能形成结晶,因此酶结晶既是纯化手段,也是纯化标志。
名词术语的解释与区别(每组6分,共30分)1、酶生物合成中的转录与翻译酶合成中的转录是指以核苷三磷酸为底物,以DNA链为模板,在RNA聚合酶的作用下合成RNA分子。
酶合成中的翻译是指以氨基酸为底物,以mRNA为模板,在酶和辅助因子的共同作用下合成蛋白质的多肽链。
2、诱导与阻遏酶合成的诱导是指加入某种物质使酶的合成开始或加速进行的过程;酶合成的阻遏作用则是指加入某种物质使酶的合成中止或减缓进行的过程.这些物质分别称为诱导物及阻遏物。
3、酶回收率与酶纯化比(纯度提高比)酶的回收率是指某纯化步骤后酶的总活力与该步骤前的总活力之比。
酶的纯化比是之某纯化步骤后的酶的比活力与该步骤前的比活力之比.4、酶的变性与酶的失活酶的变性是指酶分子结构中的氢键、二硫键及范德华力被破坏,酶的空间结构也受到破坏,原来有序、完整的结构变成了无序,松散的结构,失去了原有的生理功能.酶的失活则是指酶的自身活性受损(包括辅酶、金属离子受损),失去了与底物结合的能力。
现代生物技术第五章酶工程汇总.
基因工程 转基因动物 转基因植物
基因工程菌
发酵工程
酶 菌体细胞 固定化菌体细胞
酶工程
细胞工程
酶
细胞
酶工程与发酵工程、基因工程、细胞工程的关系
一、酶工程的内容
1.酶工程的分类: (1)化学酶工程:自然酶、化学修饰酶、固 定化酶、化学人工酶的研究和应用。 (2)生物工程酶: ①用基因工程技术大量生产酶(克隆酶); ②修饰酶基因产生遗传修饰酶(突变酶); ③设计新酶基因,合成自然界不曾有的酶 (新酶)。
(4)酶分子改造
酶分子改造可以从两个方面进行: (1)用蛋白质工程技术对酶分子结构基因进行 改造,期望获得一级结构和空间结构较为合 理的具有优良特性、高活性的新酶(突变酶)。 (2)用化学法或酶法改造酶蛋白的一级结构, 或者用化学修饰法对酶分子中侧链基团进行 化学修饰.以便改变酶学性质。这类酶在酶 学基础研究上和医药上特别有用。
(9)酶技术的应用
在医学、食品、发酵、纺织、制革、化学分析、氨 基酸合成、有机酸合成、半合成抗生素合成、能源 开发以及环境工程等方面的应用都很广泛。 ①运用酶技术生产有重要价值的产品。 ②利用酶制剂改进生产工艺,提高产品质量和产率, 降低生产成本。
二、酶工程的意义、发展及展望
1.酶工程的研究意义
(6)酶传感器
又称为酶电极。酶电极是由感受器(如固定 化酶)和换能器(如离子选择性电极)所组成的 一种分析装臵,用于测定混合物溶液中某种 物质的浓度,其研究内容包括:酶电极的种 类、结构与原理;酶电极的制备、性质及应 用。
(7)酶反应器
酶反应器是完成酶促反应的装臵。其研究内 容包括:酶反应器的类型及特性;酶反应器 的设计、制造及选择等。
酶工程第一篇主要内容
第一章绪论(A)一、酶(enzyme)是由生物体产生的具有催化功能的生物大分子。
分类:蛋白类酶、核酸类酶二、酶工程:酶的生产与应用的技术过程三、酶工程的主要任务:经过预先设计,通过人工操作, 获得人们所需的酶,并通过各种方法使酶充分发挥其催化功能。
三、酶工程的主要内容包括:酶的生产;酶的提取与分离纯化;酶分子修饰;酶固定化;酶的非水相催化;酶分子定向进化;酶反应器和酶的应用四、酶发展史1878年,库尼Kunne首次将酵母中进行乙醇发酵的物质称为酶(enzyme),该词源于希腊文,意为”在酵母中”。
1926年,萨姆纳Sumner首次从刀豆中分离纯化出脲酶结晶,证明其有蛋白质性质.1971年,在美国举行了第一届国际酶工程学术会议,会议的主题是固定化酶。
1982年,切克Cech等人发现RNA也具有催化活性。
1983年,阿尔特曼Altman等人发现核糖核酸酶P的RNA部分具有该整体酶的催化活性,而该酶的蛋白质部分无催化活性。
Cech和Altman因发现RNA具有催化活性而共同获得1989年诺贝尔化学奖.第二节酶的命名和分类一、蛋白类酶的分类与命名(一)推荐名(习惯命名)通式:底物的名称+催化反应的类型+“酶”字说明:对于水解酶类,其催化的为水解反应,在命名时可省去说明反应类型的“水解”字样,只在底物名称之后加上酶。
(二)系统命名通式:酶作用底物+酶作用基团+催化反应类型+“酶”字酶分类:1、氧化还原酶类、2、转移酶类、3、水解酶类、4、裂合酶类、5、异构酶类、6、合成酶类(三)蛋白类酶(P酶)的分类原则为:1、按照酶催化作用的类型,将蛋白酶分为6大类,分别为氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类、合成酶类。
2、每个大类中,按照酶催化作用的底物、化学键或基团的不同,分为若干亚类。
3、每一亚类中再分为若干小类。
4、每一小类中包含若干个具体的酶根据系统命名法,每一种具体的酶,除了有一个系统名称以外,还有一个系统编号(四码编号)。
酶工程文档
第一章 酶工程基础一.酶的催化特点(一)酶和一般催化剂的共性:1、用量少而催化效率高;2、它能够改变化学反应的速度,但是不能改变化学反应平衡。
3、酶能够稳定底物形成的过渡状态,降低反应的活化能,从而加速反应的进行。
(二)酶催化作用特性:1、高效性;2、专一性;3、调节性 1. 高效性:酶加速反应的机理是降低反应的活化能。
活化能:底物分子从初态转变到活化态所需的能量。
2.专一性:又称为特异性,是指酶在催化生化反应时对底物的选择性。
3.调节性:1. 酶浓度的调节 2 激素调节 3. 共价修饰调节 4. 限制性蛋白水解作用与酶活力调控 5. 抑制剂的调节 6. 反馈调节 7. 金属离子和其他小分子化合物的调节 第二节 酶的活力测定1、 酶活力与酶促反应速度酶活力:在一定条件下,酶催化某一反应的反应速酶促反应速度:单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量单位:浓度/单位时间 2、酶的活力单位(U ) 1国际单位(IU 单位):在最适反应条件下,每分钟催化1umol 底物转化为产物所需的酶量,称一个国际单位(IU ),1 IU = 1umol /min 1单位催量(Katal, Kat 单位):在最适反应条件下,每秒钟催化1mol 底物转化为 产物所需的酶量,称Kat 单位。
1 Kat=1mol/s=60mol/min=6X 107 IU3、酶的比活力:每毫克酶蛋白所具有的酶活力。
单位:U/mg 蛋白质。
酶的比活力=酶活力单位/mg (蛋白质或RNA ) 酶的比活力是分析酶的含量与纯度的重要指标。
酶提纯过程中,总蛋白减少,总活力减少,比活力增高。
酶的纯化倍数: 酶的回收率: ×100%第三节 酶反应动力学一、米氏方程:反应速度与底物浓度关系的数学方程式,即氏方程Km 即为米氏常数,Vmax 为最大反应速度 1. Km 值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度,单位是mol/L 。
Chapter 1 酶与酶工程(整理)
第一章酶与酶工程第一节酶的底子概念与开展史〔一〕酶与酶工程酶〔enzyme〕:由活细胞发生的具有生物催化功能的生物大分子。
酶工程(enzyme engineering):酶的出产、应用的技术过程。
★酶工程已在工业、农业、医药、食品等方面有广泛应用,并在资源、能源、环保等方面起着举足轻重的作用。
〔二〕酶的开展史1、酶在古代的应用★早在4000年前的周朝,我国人们就不自觉地将酶的催化作用应用于酿酒、制酱工业。
★一种古老的酶技术〔酒曲〕从远古时代被用于豆成品调味料 (豆面酱) 和发酵饮料 (米酒、酒精) 的出产,而且一直沿用到今天。
★蒸过的米参加霉菌混合物就能得到酒曲,这项技术世代相传。
2、酶学研究的历史★最早的酶学尝试:1783年,意大利科学家Spallanzani发现鸟的胃液能分解消化肉类。
斯帕兰扎尼〔Spallanzani〕他用本身饲养的山鹰做了一个十分耐人寻味的尝试。
他将一块生肉塞进一个上面布满许多孔眼的金属小管子里,管子两端盖紧,不使肉掉下来,然后迫使山鹰吞下小管。
过一段时间再设法取出小管。
小管依然完好无损,盖子仍牢牢地固定在小管上,但是管中的肉不见了,只留下一些淡黄色的液体,这使斯巴兰沙尼惊讶不已。
这恐怕要算最早的酶学尝试。
虽然他未说明此物为酶,但后来有人还是把他看作是酶的最早发现者。
★酶水解作用的发现: 1814年,德国物理学家 Kirchhoff研究了酶的水解现象。
基尔霍夫〔Kirchhoff〕发现淀粉经稀酸加热后可水解为葡萄糖,而某些谷物种子在发酵时也能生成复原糖。
假设把种子抽芽时的水提取物加到泡在水里的谷物中,也能发生不异的水解反响,很显然,活的谷物种子的水解能力取决于包含在此中的水溶性物质,这种水溶性物质脱离了生物体后仍能阐扬作用。
★最早的酶制剂:1833年,法国化学家Payen和Persoz得到了diastase。
佩恩〔Payen〕和帕索兹 (Persoz) 他们从麦芽的水抽提物中,用酒精沉淀得到一种可使淀粉水解成可溶性糖的物质,称之为淀粉酶〔diastase['daiəsteis]〕。
酶工程重点【范本模板】
酶活力:指在一定条件下,酶所催化的反应初速度,在外界条件相同的情况下,反应速度越大,意味的酶活力越大.酶工程:酶的生产与运用的技术过程,其主要任务是通过人工操作,获得人们所需要的酶,并通过各种方法使酶发挥其催化功能。
酶的生物合成:主要指细胞内RNA和蛋白质的合成过程。
分解代谢物阻遏作用:指某些物质(主要是葡萄糖和其他容易利用的碳源)经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶(主要是诱导酶)生物合成的现象。
发酵动力学:是研究发酵过程中细胞生长速率,产物生成速率,基质消耗速率以及环境因素对这些速率的影响规律的科学.溶氧速率:指单位体积的发酵液在单位时间内溶解的氧的量.耗氧速率:指单位体积培养液中的细胞在单位时间内的耗氧量.动植物细胞培养产酶:指通过特定技术获得优良的动物和植物细胞,然后在人工控制条件的反应器中进行细胞培养,以获得所需酶的技术过程。
酶的提取与分离纯化:指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来,再与杂质分开,而获得所要求的酶制品的技术过程。
沉淀分离:通过改变某些条件或添加某种物质,使酶的溶解度降低,而从溶液中沉淀析出,与其他溶质分离的技术过程。
离心分离:借助于离心机旋转所产生的离心力,使大小不同,不同密度的物质分离的技术过程。
层析分离:利用混合液中各组分的性质(分子的大小和形状,分子极性,吸附力,分子亲和力,分配系数等)的不同,使各组分以不同比例分布在两相中.点泳:带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程。
酶分子修饰:通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变酶的催化特性的技术过程.分子内交联修饰:采用双功能基团化合物(又称双功能试剂)与在酶分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联,从而提高酶的稳定性的修饰方法。
固定化酶:固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。
交联法:指借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用,制成网状结构的固定化酶的方法.固定化细胞:固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动(生长繁殖,新陈代谢)的细胞。
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6707酶工程.doc湖北省高等教育自学考试大纲课程名称:酶工程(EnzymeEngineering)课程代码:6707第一部分课程性质与目标课程性质与特点本课程为生物工程学生的必修课程之一,是一门重要的专业理论课。
其目的在于使学生在学习生物化学、微生物学的基础上,系统掌握酶生产和应用的基本理论、基本技术和研究方法。
通过本课程的学习,使学生掌握酶工程的基本理论和技术,了解酶工程领域的最新研究动态进展。
课程目标与基本要求通过学习应该掌握以下基本内容:1.酶生物合成的代谢调控机制和酶发酵生产技术2.酶分离纯化的常规方法3.酶的固定化方法4.化学酶工程5.非水相酶催化6.核酶7.酶抑制剂8.酶在医药、农业、轻化工领域的应用与本专业其他课程的关系酶工程为生物工程专业自考生的必修课程,是当代生物工程学科的重要领域之一。
先修课程主要为微生物学、生物化学。
第二部分考核内容与考核目标酶工程基础一、学习目的与要求要求学生识记酶工程的定义、研究内容及学科的发展历程。
了解酶工程的发展方向和趋势。
二、考核知识点与考核目标重点酶工程的定义(识记)酶工程的研究内容(识记)次重点酶工程的发展方向和趋势(理解)酶的发酵工程一、学习的目的与要求要求学生掌握酶生物合成的代谢调控的几种方式,包括操纵子学说、分解代谢物阻遏作用、酶生物合成的诱导作用、酶生物合成的反馈阻遏作用。
掌握酶发酵工艺条件及其控制,理解酶发酵动力学。
二、考核知识点与考核目标1、重点(1)酶生物合成模式(理解)(2)分解代谢物的阻遏作用(应用)(3)酶生物合成的诱导作用(应用)(4)酶生物合成的反馈阻遏作用(应用)2、次重点(1)发酵工艺条件及控制方法(应用)(2)发酵工艺控制的理论依据(理解)3、一般产酶动力学(理解)酶的分离工程学习目的与要求要求学生掌握酶的分离纯化的整个流程以及各个操作单元的特点。
考核知识点与考核目标重点酶的分离纯化的流程(理解)酶的精制(应用)次重点酶的膜分离技术(应用)酶的沉淀分离技术(应用)一般(1)细胞分离(识记)(2)细胞破碎和酶提取(识记)第四章固定化酶与固定化细胞一、学习目的与要求要求学生掌握酶和菌体固定化的方法,了解固定化酶和菌体的应用情况。
第五章第四节酶工程简介.doc
第五章第四节酶工程简介教学目标1.知识方面(1)酶工程的概念以及酶制剂的生产和应用的基础知识(知道)。
(2)使学生了解酶工程发展的概况。
(3)一些酶工程与基因工程,细胞工程和发酵工程之间具有相互交叉渗透的关系(知道)。
2.态度观念方面(1)通过酶制剂在人们社会生活中的应用的学习,激发学生学习兴趣,培养学生理论联系实际的科学态度。
(2)通过了解生物工程在世界经济中的重要地位及未来发展前景,增强学生科技是第一生产力的认识。
3.能力方面通过收集有关酶制剂在社会生活中的应用情况的资料、信息,培养学生获取信息的能力。
重点、难点分析1.重点:(1)通过学习使学生了解酶制剂生产中,酶的产生、提取和分离纯化,加工等生产过程及其简单原理是本节教学的重点之一。
(2)通过讨论引导学生了解酶工程与基因工程、细胞工程、发酵工程之间,具有相互交叉渗透的关系也是本节的教学重点内容。
2.难点:(1)酶制剂生产中诸如酶的提取、固定化等原理,由于涉及到很多其他学科的知识,学生较难理解。
因此,生产酶制剂的原理是本节的教学难点。
(2)酶制剂的应用中诸如尿糖试纸、酶传感器等的原理比较抽象,学生也很难理解,因此,酶制剂的应用及其原理也是教学难点。
教学模式启发讲解与学生讨论相结合。
教学手段酶制剂的标本,投影片等。
课时安排一课时。
设计思路1.前期知识准备:(1)酶的概念及特性。
(2)酶的种类:胞内酶、胞外酶、组成酶、诱导酶。
2.通过对酶在生活中应用实例的讨论使学生了解酶工程的概念。
3.通过教师启发讲解使学生了解酶制剂的生产、提取和分离纯化以及固定化酶的相关知识。
4.通过事例分析总结出社会生活中酶制剂的用途。
5.通过讨论使学生了解生物工程各分支领域之间的关系。
6. 通过对生物工程未来的畅想使学生加深科学技术是第一生产力的认识。
重点提示1.有关酶工程的资料学生接触的不是很多,可以让学生通过网络下载一些有关酶生产、运用方面的资料,经筛选后印发给大家。
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名词解释1。
酶工程:又叫酶技术,是酶制剂的大规模生产和应用的技术。
2。
自杀性底物:底物经过酶的催化后其潜在的反应基团暴露,再作用于酶而成为酶的不可逆抑制剂,这种底物叫自杀性底物??3.别构酶;调节物与酶分子的调节中心结合后,引起酶分子的构象发生变化,从而改变催化中心对底物的亲和力,这种影响被称为别构效应,具有别构效应的酶叫别构酶4。
诱导酶:有些酶在通常的情况下不合成或很少合成,当加入诱导物后就会大量合成,这样的酶叫诱导酶5。
Mol 催化活性:表示在单位时间内,酶分子中每个活性中心转换的分子数目6。
离子交换层析9比活力11葡萄糖效应13产酶动力学15双向凝胶电泳20固定化细胞21酶化学修饰1.酶的转换数:酶的转换数Kp.又称为摩尔催化活性,是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数.2.酶的催化周期:酶进行一次催化所用的时间。
3.固定化酶的比活力:指每克干固定化酶所具有的6活力单位数,它是酶制剂纯度的一个指标。
4.抗体酶:又称催化行抗体。
是一类具有生物催化功能的抗体分子。
抗体是由抗原诱导产生的抗原特异结构免疫球蛋白,要使机体具有生物催化功能,只要在抗体的可变区赋予酶的催化特性,以及酶的高效催化能力。
是通过人工设计采用现代生物技术而获得的一类新的生物催化剂,有些是自然界原本不存在的。
5.端粒酶:是一种核酸核蛋白,包含蛋白质和RNA两种基本成分.其RNA组分包含有构建端粒的重复序列的核苷酸摸板序列,在合成端粒的过程中,端粒酶以其本身的RNA组分为摸板把端粒的重复序列加到染色体DNA的末端上,使端粒延长。
6.核酶:核酸类酶。
为一类具有生物催化功能的核糖核酸分子。
它可以催化本身RNA剪切或剪接作用,还可以催化其他RNA,DNA多糖,酯类等分子进行反应。
7.KS分段盐析:指在一定温度和PH值条件下,通过改变离子强度使不同的酶和蛋白质分离的方法.8.B分段盐析:指在盐和离子强度条件下,通过改变温度和PH使不同的酶或蛋白质分离的方法.9.凝胶层析:又称凝胶过滤,分子排阻层析,分子筛层析等。
是以各种多孔凝胶作为固定相,利用流动相中各组分相对分子质量不同达到物质分离的一种层析技术。
10.亲和层析:利用生物分子与配基间所具有的专一而不可逆的亲和力使生物分子分离纯化的方法。
11.等电聚焦电泳:又称等电点聚焦或电聚焦.指在电泳系统中,加进两性电解质载体.当接通直流电时,两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的PH梯度,当酶或其他两性电解质进入这个体系时,不同的两性电解质即移到与其等电点相当的PH位置上,从而使不同等电点的物质得以分离,这种电泳技术叫做等电聚焦电泳。
12.超临界流体:当压力和温度到达某一特定数值时,液体和气体物理特性就会趋于相同,该数值称为超临界点。
当压力和温度超过其超临界点时,两相变为一相,处于这一状态的流体称为超临界流体。
13.反胶束:反胶束又称反胶团,指在大量与水不相混溶的有机溶剂中,含有少量的水溶液,加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴.14.胶束体系:胶束又称为正胶束或胶束团,是在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂,加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。
15.水活度:指体系中水的逸度与纯水逸度之比。
16.梯度凝胶电泳:采用由上而下浓度逐渐升高,孔径逐渐减小的梯度凝胶进行电泳。
梯度凝胶用梯度混合装置制成,主要用于测定球蛋白类组分的分子质量。
17.双水相萃取:利用溶质在两个互不相溶的水相中溶解不同而达到分离的技术.18.固定化酶:指固定在一定载体上,并在一定的空间范围内进行催化反应的酶固定化酶,即保持了酶的催化特性,又克服了游离酶的不足之处,具有增加稳定性可反复或连续使用及易于和反应产物分开等显著优点。
19.分子印记技术:是模拟抗体,抗原相互作用的一种人工生物模拟技术,是制备对某一化合物具有特异性聚合物过程。
20.密度梯度离心:是样品在密度梯度介质中进行离心,使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。
是非题(每题1分,共10分)1、酶是具有生物催化特性的特殊蛋白质(╳)2、酶的分类与命名的基础是酶的专一性.(√)3、酶活力指在一定条件下酶所催化的反应速度,反应速度越大,意味着酶活力越高。
(√)5、培养基中的碳源,其唯一作用是能够向细胞提供碳素化合物的营养物质.(╳)6、膜分离过程中,膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒成分或分子通过,而把大于其孔径的颗粒截留.(√)7、在酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶之间都是互配的分子对,在酶的亲和层析分离中,可把分子对中的任何一方作为固定相.(√)8、角叉菜胶也是一种凝胶,在酶工程中常用于凝胶层析分离纯化酶。
(╳)二、填空题二填空题(每空1 分,共计30 分)1。
决定酶催化活性的因素有两个方面,一是,二是。
2。
求Km 最常用的方法是 .3。
多底物酶促反应的动力学机制可分为两大类,一类是,另一类是 .4.可逆抑制作用可分为 .6.酶活力的测定方法可用________ 反应法和________ 反应法。
7.酶制剂有四种类型即________ 酶制剂,____________酶制剂,______酶制剂。
8。
通常酶的固定化方法有_______ 法,___ 法,____ 法,____ 法。
9。
酶分子的体外改造包括酶的________修饰和_________________修饰.10.模拟酶的两种类型是_______酶和__________酶 .11.抗体酶的制备方法有__________法和_____法。
1、日本称为“酵素”的东西,中文称为酶,英文则为Enzyme,是库尼(Kuhne)于1878年首先使用的。
其实它存在于生物体的细胞内与细胞外。
2、1926年,萨姆纳(Sumner)首先制得脲酶结晶,并指出酶的本质是蛋白质.他因这一杰出贡献,获1947年度诺贝尔化学奖。
4、 1960年,查柯柏(Jacob)和莫洛德(Monod)提出了操纵子学说,认为DNA分子中与酶生物合成有关的基因有四种,即操纵基因、调节基因、启动基因和结构基因。
5、 1961年,国际酶委会规定的酶活力单位为:在特定的条件下(25oC,PH及底物浓度为最适宜)每1分钟内,催化1μmol的底物转化为产物的酶量为一个国际单位,即1IU。
6、酶分子修饰的主要目的是改进酶的性能,即提高酶的活力、减少抗原性,增加稳定性。
7、酶的生产方法有提取法,发酵法和化学合成法。
8、借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用,制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法.9、酶的分离纯化方法中,根据目的酶与杂质分子大小差别有凝胶过滤法,超滤法和超离心法三种。
10、由于各种分子形成结晶条件的不同,也由于变性的蛋白质和酶不能形成结晶,因此酶结晶既是纯化手段,也是纯化标志。
三、名词术语的解释与区别(每组6分,共30分)诱导与阻遏酶合成的诱导是指加入某种物质使酶的合成开始或加速进行的过程;酶合成的阻遏作用则是指加入某种物质使酶的合成中止或减缓进行的过程.这些物质分别称为诱导物及阻遏物.酶回收率与酶纯化比(纯度提高比)酶的回收率是指某纯化步骤后酶的总活力与该步骤前的总活力之比。
酶的纯化比是之某化步骤后的酶的比活力与该步骤前的比活力之比。
酶的变性与酶的失活酶的变性是指酶分子结构中的氢键、二硫键及范德华力被破坏,酶的空间结构也受到破坏,原来有序、完整的结构变成了无序,松散的结构,失去了原有的生理功能。
酶的失活则是指酶的自身活性受损(包括辅酶、金属离子受损),失去了与底物结合的能力。
四、问答题1、举出四例,说明酶在医学上有广阔的用途。
(1)医药用酶:a。
消化用酶:α、β-淀粉酶、胰酶、胰蛋白酶b。
消炎用酶:木瓜蛋白酶、菠萝酶 c。
溶纤维酶:尿酸酶、链激酶、溶栓酶d.肿瘤用酶:L-天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶(2)诊断用酶:a.尿酸酶:用于检测血液和尿液中的尿酸含量b。
甘油激酶:由于检测血液中甘油三酯的含量。
(3)检测用酶:a.脱羧酶:由于检测L-赖氨酸和L-谷氨酸b.虫荧光素酶:用于检测ATP3、如何检查一种酶的制剂是否达到了纯的制剂?试用所学过的知识加以论述。
要检测酶的制剂是否达到纯的制剂(即不含杂质及杂质酶),可以有以下几种方法:(1)层析法:包括纸层析、凝胶层析、柱层析及亲和层析(2)电泳法:包括SDS凝胶电泳法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法(3)超离心法:不同的酶分子大小不同,在重力场中具有不同的沉降系数,从而可以通过超离心方法分离目的酶与杂质酶。
4)免疫反应法:由于酶分子可作为一种抗原物质,而抗原与抗体之间具有专一的亲和力,故可选用目的酶的抗体与酶制剂进行免疫扩散或免疫电泳,从而判断酶的制剂是否纯净。
5)氨基酸序列分析法:采用特定的化学物质从酶的N末端将氨基酸残基逐个水解下来,最终可获知该酶的氨基酸序列,从而也可以判断出酶制剂是否纯净。
4、今欲生产糖化酶结晶产品,试拟出合理的工艺步骤,并说明下游工程的主要工艺条件。
生产糖化酶的结晶产品,可采用盐析结晶法。
得到糖化酶粗酶液后,须进行分离纯化,使其达到一定的浓度和纯度(﹥50%),向浓酶液中缓慢加入饱和中性盐溶液(NH4)2SO4),至出现稍浑浊,于低温下(0-4oC)静置,待溶液中有晶体析出,可向溶液中补充少量饱和盐溶液。
(操作过程中保证PH≈4。
5),也可采用有机溶剂法结晶。
向浓酶液中缓慢加入有机溶剂,混合均匀,于低温下静置一段时间,离心去除沉淀物,取上清液静置于低温下,可析出晶体。
1.固定化酶和游离酶相比,有何优缺点2。
写出三种分离纯化酶蛋白的方法,并简述其原理。
3.为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料。
酶工程的概念及其研究内容?。
根据细胞生长与酶产生的关系,简述酶生物合成模式特点,以及如何提高酶的合成量.酶分离纯化操作的一般程序和目的?如何检查一种酶制剂是否达到了纯的制剂?有三种酶蛋白,其相对分子质量和等电点各不相同,试设计一个方案来分离纯化这三种蛋白质。
常见固定化方法有哪些类型?其概念和特点?简述固定化细胞作为生物催化剂的优点和缺点。
简述酶分子化学修饰的基本原理.为什么要开展对酶的人工模拟?目前这方面的研究和应用有哪些成果?核酶作为一种金属依赖酶,金属离子在Ⅰ型内含子中发挥的作用是什么?脱氧核酶具有哪些催化功能?。
酶在有机介质中有哪些酶学特性发生改变?在有机介质中如何通过控制pH条件提高酶活性?酶反应器在使用过程中应注意哪些方面问题?1.什么叫分解代谢物的阻遏作用?举例说明其对酶的生物合成过程影响机理,发酵产酶中应如何降解之?答:分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物引起的阻遏作用。
例:枯草杆菌碱性磷酸酶的生物合成受到其反应产物无机磷酸的阻遏,当培养基中无机磷酸的含量超过1mmol/L的时候,该酶的生物合成完全受到阻遏。