聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA
质粒的提取与纯化
碱裂解法小量制备质粒DNA
基本原理
人们使用碱与 SDS 裂解法从 E.coli 中分离制备质粒 DNA已有 20 多年的历史。将细菌悬浮液暴露于高 pH 值的强阴离子洗 涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体 DNA 和蛋白质变性，将 质粒 DNA 释放到上清中。尽管碱性溶液使碱基配对完全破 坏，闭环的质粒 DNA 双链仍不会彼此分离，这因为它们在 拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太 过，当pH值恢复到中性时，DN双链就会再次形成。在裂解 过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体 DNA 会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包裹。当 用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀 下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒 DNA。
细菌的制备
挑取转化细菌的单菌落 (或用0.1～1.0m1单菌落的培 养物) 接种到30m1含适当抗生素的培养基(LB、YT 或Terrific培养液)中。
为了确保培养物通气良好：试管的体积应该至少比细菌培 养物的体积大 4倍；试管不宜盖得过紧；应在剧烈振摇下温 育。
在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚 期(OD600约为0.6)。
液转移到微量离心管，室温放置30min。
加500
μl 1.6M NaCl（含13%PEG8000），混匀，4℃， 12000rpm离心5min。
弃上清，将沉淀溶于400
μl TE(pH8.0)，用酚、酚：氯仿、
氯仿各抽提一次。
将水相移入一干净指形管中，加100 μl 10M NH4Ac， 混匀，加2倍体积无水乙醇（约1ml），室温10min， 4℃，12000rpm离心10min。（-20 ℃放置30min以 上沉淀效果更佳，如果暂时不用，可将质粒长时间 保存于乙醇中，暂时不离心。） 弃上清，加200 μl 70%乙醇，旋转洗涤， 12000rpm 离心 2min。 用400 μl TE(pH8.0)溶解沉淀。定量后-20 ℃保存。
核酸提取的原理及方法
核酸提取的常见方法及原理核酸提取作为分子实验中最基础的实验之一，几乎是所有实验的基本，无论后续的克隆、PCR、qPCR、建库测序等等都需要核酸才能顺利进行。
今天我们就来简单了解核酸提取的基本原理和方法。
1、什么是核酸核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根据功能的不同分为核糖体RNA(r RNA)，信使RNA（m RNA）和转移RNA（t RNA）。
核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。
不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。
DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中，而RNA主要分布在细胞质当中。
2、核酸提取类型1、总RNA提取总RNA中，75-85%为rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA)，其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA，snoRNA）等组成。
2、miRNA提取MicroRNAs (miRNAs)是小型的、高度保守的RNA分子，如小干扰RNAs (siRNAs)，通过与他们的碱基配对调节其同源mRNA的分子表达，以预防通过各种机制的表达。
他们已成为进行发育、细胞增殖、分化和细胞周期的重点监管机构。
3、基因组DNA提取进行基因结构和功能研究以及基因诊断，通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。
在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
4、质粒抽提质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。
质粒dna提取步骤
质粒dna提取步骤
质粒 DNA 提取是分子生物学实验中的一项基本技术，用于从细菌细胞中分离出质粒DNA。
以下是一般的质粒 DNA 提取步骤：
1. 收集细菌培养物：将含有质粒的细菌培养在适当的培养基上，直到培养物达到合适的密度。
可以使用离心或过滤的方法收集细菌细胞。
2. 细胞裂解：将收集的细菌细胞加入裂解缓冲液中，通过物理方法（如搅拌、超声处理等）或化学方法（如加入裂解酶等）使细胞破裂，释放出质粒 DNA 和其他细胞成分。
3. 去除细胞碎片：将裂解后的混合液通过离心或过滤的方法去除细胞碎片和其他杂质。
4. 沉淀 DNA：向裂解液中加入乙醇或异丙醇等沉淀剂，使质粒 DNA 沉淀。
通过离心将沉淀收集。
5. 洗涤沉淀：用 70%的乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐分和杂质。
6. 干燥沉淀：将洗涤后的沉淀离心，并去除上清液。
然后将沉淀在室温下干燥，以去除残留的乙醇。
7. 溶解 DNA：将干燥的沉淀加入适当的缓冲液中，使质粒 DNA 溶解。
可以在缓冲液中加入 RNA 酶以去除 RNA 杂质。
8. 纯化和浓缩 DNA：可以使用柱层析、电泳或其他方法对提取的质粒 DNA 进行进一步的纯化和浓缩。
9. 质量检测：使用琼脂糖凝胶电泳或其他适当的方法检测提取的质粒 DNA 的质量和完整性。
需要注意的是，具体的质粒 DNA 提取步骤可能因使用的试剂盒或实验条件而有所不同。
在进行质粒 DNA 提取之前，应仔细阅读所使用的试剂盒说明书或相关实验方案，并根据实际情况进行适当的调整和优化。
聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA实验
聚⼄⼆醇沉淀法纯化质粒DNA实验关键词：聚⼄⼆醇沉淀纯化质粒DNA 科进 Kirgen 爱思进 Axygen 康宁 corning 耐思 NEST ⽩鲨易 biosharp实验⽅法原理这种⽅法最早由 Richaed Treisman ( 英国，伦敦，ICRF) 参照 Lis 的⼯作⽽设计。
Lis 是最早⽤聚⼄⼆醇（PEG ) 分离不同⼤⼩ DNA 的⼈。
Treisman 法被⼴泛⽤于碱裂解法制备的质粒 DNA 的纯化。
实验材料粗制质粒试剂、试剂盒氯仿⼄醇异丙醇 LiCl PEG-MgCI2 酚氯仿⼄酸钠 TE仪器、耗材Sorvall SS-34 或与其相当的转头冰⽔浴实验步骤⼀、材料1. 缓冲液和溶液(1) 氯仿(2) ⼄醇(3) 异丙醇(4) LiCl ( 5 mol/L)(5) PEG-MgCI2 溶液(6) 酚：氯仿（1:1，V/V）(7) ⼄酸钠（3 mol/L, pH 5.2 )(8) TE ( pH 8.0 )(9) TE ( pH 8.0）含 20 µg/ml RNase A2. 核酸和寡核苷酸粗制质粒3. 离⼼机和转头Sorvall SS-34 或与其相当的转头4. 专⽤设备冰⽔浴⼆、⽅法1. 将 3 ml 粗制质粒转移到 15 ml Corex 管中，在冰浴中冷却⾄ 0。
2. 加⼊ 3 ml 冰预冷的 5 mol/L LiCl，混匀，于 4 离⼼ 12000 g ( Sorvall SS-34 转头，10000 r/min ) 10 min。
3. 转移上清⾄ 30 ml Corex 管中，加等体积异丙醇，混匀，室温离⼼回收核酸，12000 g ( Sorvall SS-34 转头，10000 r/min )10 min。
4. ⼩⼼倒去上清，倒置管⼝，使液体流⼲。
室温下⽤ 70% ⼄醇洗沉淀和管壁。
⼩⼼将⼄醇倒去，⽤真空抽吸器将管壁上残留的⼄醇抽⼲。
在纸⼱上倒置数分钟，使⽆可见⼄醇残留。
细菌质粒提取原理及步骤(精)
质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA ，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。
2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA 的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC 系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA 。
然而，较长一代的载体(如pB R322 由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR ３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA 量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA 的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1 大质粒(大于15kb 容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA 进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS 一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
质粒提取
４、加入３50 μl Solution Ⅲ，上下颠倒10次, 离心 12,000rpm 10min; ５.取上清（不可吸到絮状沉淀）臵于对应编号并带有 收集管的离心柱，离心10，000×g 1min，弃液（可 重复一次，提高DNA量，即集中管液倒回离心柱）； ６.加 500ul HB（深度清洗）离心10，000g 1min，弃 液（可重复一次）； 7.加Wash Buffer（确保已加入无水乙醇） 700ul 离心 10，000g 1min，弃液（可重复一次）； 8.空柱离心12，000g 2min； 9. 加Elution Buffer 50ul ,下接标记好的Ep管，盖上离心 柱的盖子 60℃温育10min,离心13，000g 2min
质粒大于15kb在细胞裂解操作时容易受损， 故应采用温和裂解法从细胞中释放出来。通常 将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，再用溶菌酶和 EDTA（乙二胺四乙酸）进行处理，破坏细胞 壁。然后加入SDS （十二烷基磺酸钠）等去污 剂裂解球形体。
小质粒(小于15KB)的处理可用较剧烈的方法
对小质粒的操作可以用许多无需特殊处理的裂 解方法。典型的方法是让细菌溶解物悬于去污 剂中，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理 能破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体 DNA变性。闭环质粒DNA链则处于拓扑缠绕状 态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒 DNA链迅速得到准确配臵，重新形成完全的天 然超螺旋分子。
通过不连续或者预先形成的氯化铯梯度离心， 可在离心管中获得含有不同浓度ＣｓＣｌ的溶 液分层，样品位于中层（三级梯度法）或者底 层（两级梯度法）。在随后的离心梯度形成过 程中，ＤＮＡ找到其等密度点，从而使离心时 间大大缩短。
因为不连续梯度法不能达到真正的平衡，使其 闭环质粒ＤＮＡ与染色体ＤＮＡ直接的分辨率 不如自身形成的梯度那么高。一般说来，与二 级梯度法相比，三级梯度法能在较短的时间内 给出更好的结果。
基因工程--核酸操作的基本技术
3.1 碱抽提法提取DNA
? 碱变性抽提法又称碱抽提法或碱裂解法，是一 种用的最广泛的制备质粒 DNA的方法，是当今 分子生物学研究中的常规方法。碱变性抽提法 是基于染色体 DNA与质粒DNA的变性与复性的 差异而达到分离目的。在 pH值达到12.6的碱性 条件下，染色体 DNA的氢键断裂，双螺旋结构 解开而变性，质粒 DNA的大部分氢键也断裂， 但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全 分离。当以 pH4.8 的NaAc高盐缓冲液调节其 Ph 至中性时，变性的质粒ＤＮＡ又恢复原来的构 型，保存在溶液中，而染色体ＤＮＡ不能复性
? 心5min，弃上清，加入 70％乙醇沉淀。
? 7）离心弃上清，真空抽干，去除痕量乙醇。
? 8）加入50μl TE并加入1μl RNase放入37℃水浴 1h。
? 9）0.7%琼脂糖电泳检测其含量。
3.1.2 碱抽提法抽提DNA过程 中应注意的问题
? （1） 染色体DNA、蛋白质与 RNA是否去除干 净，是否获得一定得率的质粒 DNA。
? （６）酚－氯仿：酚与氯仿是非极性分 子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚 或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分 子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水 合状态而变性。经过离心，变性蛋白质 的密度比水的密度大，因而与水相分离， 沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中 的ＤＮＡ分开。而酚与氯仿有机溶剂比 重更大，保留在最下层。
变性的质粒ＤＮＡ能够复性，并能稳定 存在。而高盐的３mol/L NaAc有利于变
性的大分子染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、以 及ＳＤＳ－蛋白复合物的凝聚而沉淀之。
? （４）乙醇：ＤＮＡ溶液是ＤＮＡ以水 合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇 会夺去ＤＮＡ周围的水分子，ＤＮＡ失 水而易于聚合。一般实验中，是加２倍 体积的无水乙醇与ＤＮＡ相聚合，其乙 醇的最终含量占６７％左右。
质粒 的提取纯化及验证
一细菌的收获和裂解1.收获1）将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。
2）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。
3）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。
当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
2.碱裂解法1）将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。
溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris.Cl（pH8.0）10mmol/LEDTA（pH8.0）溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.895×104Pa）高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。
须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。
2）加200μl新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1%SDS盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。
应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。
不要振荡，将离心管放置于冰上。
3）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ溶液Ⅲ5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L.盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3－5分钟。
4）用微量离心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。
5）可做可不做：加等量酚：氯念，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃以12000g离心2分钟，将上清转移到另一良心管中。
有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA.6）用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA.振荡混合，于室温放置2分钟。
质粒制备
实验七质粒DNA的制备【实验目的】1.了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用；2.掌握质粒DNA分离和纯化的原理；3.学习碱裂解法和煮沸法分离质粒DNA的方法。
【实验原理】质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞特定的表型。
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。
与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。
大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。
一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单个酶切位点；（3）能插入较大的外源DNA 片段；（4）具有容易操作的检测表型。
常用的质粒载体大小一般在1kb 至10kb 之间，如pBR322、pUC 系列、pGEM 系列和pBluescript（简称pBS）等。
经过改造的基因工程质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介，这种基因的运载工具在基因工程中具有极广泛的用途，而质粒的分离与提取则是基因工程最常用、最基本的实验技术。
一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。
分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法和羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株的类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途选择不同的方法。
本实验介绍最常用的碱裂解法和煮沸法提取质粒DNA。
1. 碱变性法碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离的目的。
质粒DNA的提取和纯化实验报告
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载质粒DNA的提取和纯化实验报告地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容实验一、质粒DNA的提取和纯化一、实验目的：1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。
2、初步了解DNA纯化的原理。
二、实验原理1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
三、实验步骤1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管）2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。
干扰素制备的工艺流程
• 其区别在于个别氨基酸的差异上,早期干扰素是用病毒
诱导人白血球产生的,产量低、价格昂贵,不能满足需要，
,
现在可利用基因工程技术并在大肠杆菌中发酵、表达
来进行生产。
基因工程菌的制备
目的基因的分离 克隆载体
目的基因与克隆 载体的体外重组
重组导入大肠杆菌K12
受体菌的培养 及筛选
从受体菌中获取目的基因 表达载体
2 有药物诱导细胞,如佛波酯,使细胞表达干扰素升高。
3 破碎细胞,提取细胞总mRNA.
4
用逆转录试剂盒逆转录,把总mRNA逆转录成cDNA
5
以cDNA为模板、干扰素引物为引物,PCR,得到完全的干扰素基因的PCR产物
目的基因与克隆载体进行体外重组
1.提取载体(质粒、病毒等),双酶切,再 把干扰素基因的PCR产物用相应的 酶酶切,用连接酶连接
2.连接完成后分离纯化,测序,与原干扰 素序列比对。
3.鉴定序列无误后(无义突变也行),导 入受体细胞,筛选
重组体引入宿主细胞
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质 粒pBR322中,转化到大肠杆菌,重组的载体 DNA 分子在 一定条件下转化入大肠杆菌,形成携带质粒的菌株。
从大肠杆菌K12获取目的基因
制备种子液
精提
半成品制备
冻干
成品检定
发酵培养 半成品鉴定
成品包装
粗提 分装
l.菌种制备 取一70℃下保存的甘油管菌种(工作种子批),于室温下融化,然后，接入摇瓶,
培养温度30℃,pH7.0，250r/min活化培养18±2小时后,进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。
2.种子罐培养 将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量10%,培养温度
质粒大提程序
质粒大提程序1) 200mL含有50mg/mL氨苄或30mg/mL卡纳的培养基中振摇过夜（12-14h）2) 50mL离心管，4℃，4000rpm,10min收集2份细胞3) 每管加5mLSTE悬浮细胞后，4℃，4000rpm,10min收集细胞，置-20℃贮存10min4) 室温解冻后，每管加4mL冰预冷的溶液Ⅰ，重悬细胞5) 室温下每管加8mL溶液Ⅱ后充分混匀，室温静置5-10min6) 每管加6mL冰预冷的溶液Ⅲ，充分混匀，冰浴静置10min7) 4℃，11000rpm,30min收集裂解上清液（用纱布过滤）8) 每管加0.6倍体积异丙醇，室温静置10min9) 4℃，8000rpm,15min收集核酸沉淀，每管加5mL70%乙醇清洗10) 4℃，8000rpm,5min收集沉淀，晾10-15min，直至管壁无液滴11) 每管加2mLTE溶解核酸，4℃或冰浴静置30min12) 每管加2mL7.5mol/L乙酸铵溶液，冰浴静置10min13) 4℃，10000rpm,10min收集上清，每管加4mL异丙醇，混匀14) 4℃，10000rpm,10min收集沉淀，4-5mL70%乙醇清洗沉淀15) 4℃，10000rpm,5min收集沉淀，晾10-15min，直至管壁无液滴16) 每管加1mLTE溶解核酸，4℃或冰浴静置30min17) 两份溶液和到一管，加8μL10mg/mLRNase A，混匀转入EP管（每管转入500μL），37℃水浴静置30-60min18) 每管加250μL酚，250μL仿醇（24:1）抽提，4℃，12000rpm,10min，收集上清水相（a μL）19) 每管加aμL仿醇（24:1）抽提，4℃，12000rpm,10min，收集上清水相（bμL）20) 每管加2bμL-20℃乙醇和0.1bμL乙酸钠溶液，-20℃静置过夜21) 4℃，12000rpm,10min收集沉淀，每管加200μL70%乙醇清洗22) 4℃，12000rpm,5min收集沉淀，晾5-10min，直至管壁无液滴23) 每管加10-15μLTE溶解沉淀，合并到一个EP管中，保存于-20℃冰箱中三、质粒ＤＮＡ的大量制备在丰富培养基中扩增质粒细菌的收获和裂解收获碱裂解法（一）在丰富培养基中扩增质粒许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2－5mg质粒DNA，而且重复性也很好。
质粒DNA的提取、纯化、酶切、电泳、 紫外分光光度法定量测定
② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对
质粒分子的降解作用。（保护作用） ③ Tris•HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作 用）
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溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变 性作用）
(3)质粒DNA的纯化 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较 小及共价闭合环状的性质。
2.3 核酸分离纯化的总原则：
(1) 保证核酸一级结构完整 (2) 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、 有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能 发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
10
(3) 线状DNA (linear DNA, L DNA):
如果两条链均断开，即为线状DNA。
电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）
11
最慢
中
最快
1.3 质粒DNA的一般特性：
(1) 质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 (2) 它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型： 菌毛、抗药性等
20
溶液III：HAC(乙酸)和 KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液 (复性，分离) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。
②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成
沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
质粒DNA的提取和鉴定
该技术通常具有快速、高效的特 性，能在短时间内处理大量样本。
高通量质粒DNA提取技术可以提 供标准化的操作流程，确保提取 的一致性和准确性。
质粒DNA的测序技术
下一代测序
质粒DNA的测序技术已发展到下一代测序 阶段，能够快速、准确地测定质粒DNA的 全序列。
深度覆盖
通过深度覆盖测序，可以获得质粒DNA更全面的序 列信息，有助于发现稀有变异和基因组结构变异。
注意事项
凝胶电泳检测质粒DNA时，需要注意电泳条件的选择，如电压、电流和时间等，以确保 分离效果最佳。同时，需要使用已知大小的DNA片段作为标准进行对比分析。
紫外分光光度法检测质粒DNA
01
原理
紫外分光光度法是通过测量物质在特定波长下的吸光度来分析物质浓度
的方法。质粒DNA在260nm波长下有最大吸收峰，通过测量吸光度可
基因组编辑
质粒DNA可以作为CRISPR-Cas9等基因组编辑技术的辅助工具，用于向细胞提 供指导编辑的RNA和Cas蛋白。通过将质粒导入细胞，可以实现对特定基因的敲 除、敲入或突变。
在生物技术和生物工程中的应用
生物制药
质粒DNA常被用于生产重组蛋白药物，如胰岛素、生长激素 等。通过在大规模细胞培养物中转染质粒，可以高效地生产 这些药物。
质粒DNA提取的注意事项
保证细菌的活性和纯度
在提取前应确保细菌处于对数生长期，并去除杂质和死细胞。
避免交叉污染
整个操作过程需在无菌条件下进行，并确保使用的工具和试剂无菌。
保证质粒的完整性
提取过程中应避免质粒断裂或降解，以确保后续实验的准确性。
02
质粒DNA的纯化
离心法纯化质粒DNA
原理
通过高速离心将质粒DNA与细 胞碎片、蛋白质等杂质分离，
临床分子生物学检验技术试题及答案
临床分子生物学检验技术试题及答案1、分子生物学检验技术：是以核酸或蛋白质为分析材料，通过分析基因的结构、表达的变化和由此而导致的基因功能的改变，为疾病的研究和诊断提供更准确、更科学的信息和依据的一门学科。
2、请说明分子生物学检验技术在临床试验诊断中的应用。
（1）感染性微生物的检测。
如：用PCR技术进行甲型肝炎病毒的检测、乙型肝炎病毒的检测和解脲脲原体的检测等。
（2）基因突变的检测。
如：用PCR一限制性片段长度多态性（RFLP)技术检测地中海贫血基因突变。
（3）法医学检测。
如：用PCR微卫星检测技术进行亲子关系的鉴定和个体识别。
（4）基因异常表达的检测。
如：用cDNA表达的芯片技术进行基因异常表达的检测。
（5）基因定位。
如：用原位杂交技术进行组织与细胞中基因表达的定位。
3、基因组：是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质。
4、基因：是基因组中一个功能单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链信息或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。
5、原核生物：是细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌和蓝绿藻等原始生物的总称，是最简单的细胞生物体。
6、操纵子结构：是原核生物基因组的功能单位。
7、质粒：是指细菌细胞染色体外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子。
8、转座因子：又称为转座元件，是一类在细菌染色体、质粒和噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立的DNA序列。
9、原核生物基因组的结构特征：（1）原核生物基因组通常仅由一个DNA分子构成，基因组中只有一个复制起点，具有类核结构。
（2）具有操纵子结构，模板mRNA为多顺反子mRNA。
编码区远远大于真核生物基因组，但又远远小于病毒基因组。
在基因组中存在多功能的识别区域，如复制起始区、转录启动区和终止区等，这些区域常常含有反向重复序列。
（3）结构基因通常为单拷贝基因，编码顺序一般不重叠。
（4）具有编码同工酶的基因。
（5)含有可移动的DNA序列。
10、病毒基因组的结构特点：（1）与细菌和真核生物基因组相比，病毒基因组结构简单，基因数少，所含信息量也少。
质粒载体的操作和cDNA文库的构建
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
2)可用更剧烈的方法来分离小质粒。
在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。
这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
聚乙二醇dna提取
聚乙二醇dna提取步骤：1.准备材料。
需要使用的材料有：细胞样品（包括培养的细胞、植物组织等）、聚乙二醇2000（PEG2000）、75％的酒精、丙酮、0.5M EDTA、碳酸钠-氢氧化钙0.25N溶液、磷酸盐缓冲液。
2.细胞破碎。
将细胞样品用磷酸盐缓冲液悬浮，经过快速离心，将沉淀用碳酸钠-氢氧化钙溶液洗净。
之后，将洗净的细胞以重量1：1（细胞体积/PEG2000）的比例加入3M的磷酸盐缓冲液中，用均质器均匀破碎，直到核将细胞质膜全部破裂为止。
3.沉淀DNA。
将破碎过的样品加入65℃的75％酒精中，等待30分钟，此时DNA会缠绕在棒状物上，共同沉淀。
取下上层液体，并用75％酒精缓慢洗涤，使棒状物分离出来。
4.分离DNA。
用丙酮将棒状物洗涤，使其分离成单个DNA孪生体。
将孪生体沉淀下来，并用0.5M EDTA溶液缓慢溶解。
5.纯化DNA。
将上述合并液浸入65℃的75％酒精中30分钟提纯，沉淀在低速离心下，用0.5M EDTA溶液重悬。
优缺点：聚乙二醇DNA提取方法具有以下优点：1.速度快，简单易行。
聚乙二醇DNA提取从破碎到最终提取DNA只需3-4小时，操作简单快捷。
2.效率高，回收率高。
聚乙二醇能将DNA迅速回收到沉淀中，提取到近乎完整的基因组DNA，回收率高达90％以上。
3.纯度高。
在残留酒精中进行DNA的沉淀和分离，可以充分去除杂质和其他相干的物质。
因此，提取DNA的纯度也较高。
4.成本低。
与传统的DNA提取方法相比，聚乙二醇DNA提取不需要使用昂贵的化学试剂或专业设备，成本较低。
1.只适用于大量的细胞样品。
由于聚乙二醇DNA提取方法需要大量的细胞质量，因此这种方法不适用于少量的细胞样品提取DNA的情况。
2.许多原始基因组的降解。
由于聚乙二醇具有强烈的喜水性，会导致DNA在水中完全破裂，而且这种破裂可能会影响原始基因组的完整性。
综上所述，聚乙二醇DNA提取方法是一种快速、高效、纯度高、成本低且易于操作的DNA提取方法。