产酶海洋微生物的筛选

产酶海洋微生物的筛选

前言：浩瀚的海洋是地球生命的摇篮，它覆盖着地球表面积的71%，海水总体积占地球总水量的97%。全球80％以上的物种蕴藏于海洋中，由于独特的生存环境（如高压、高渗、高温、低温等复杂多变的生态环境）及海洋生物物种间的生态作用远比陆生物种复杂和广泛，因此赋予海洋生物均活性远比陆生生物要强，尤其重要的是有些海洋生物活性物质的结构与陆生生物化合物不同，表现出独特的活性，作为产酶资源就具有了突出的特点和优势。人们从海洋环境中已经分离的到各种极端酶，如嗜冷酶、嗜热酶、嗜压酶、嗜盐酶等，由于具有广泛的适应性，在生物技术和工业应用中已担任了重要的角色。

1 材料与方法

1.1样品采集

从连云港海域采集

1.2培养基

1.2.1细菌培养基

蛋白胨5g，酵母粉1g，琼脂20g 陈海水1000ml，pH 7.4-7.6

1.2.1.1细菌富集培养基

将1.2.1的细菌培养基去掉琼脂

1.2.1.2产淀粉酶细菌筛选培养基（初筛）

将1.2.1的细菌培养基加入2%的可溶性淀粉

1.2.1.3产右旋糖酐酶的细菌筛选培养基（初筛）

将1.2.1的细菌培养基加入1%的右旋糖酐

1.2.1.4产淀粉酶发酵培养基（复筛）

将1.2.1.2的培养基去掉琼脂

1.2.2放线菌培养基

可溶性淀粉20g，NaCl 0.5g，MgSO4∙H2O 0.5 g, KNO3 1 g，K2HPO4 0.5g，FeSO4 0.01 g，琼脂20 g ，陈海水1000mL，pH7.4～7.6。

注：在制备平板时培养基融化后加入：重铬酸钾80mg∙/L

1.2.3真菌培养基

马铃薯去皮，取200g切成小块，加50%陈海水煮沸30min，4-6层纱布过滤，加20g葡萄糖，琼脂20g，溶化后再用陈海水定容至1000mL ，pH7.2～7.4。注：在制备平板时培养基融化冷却至60℃后加入：青霉素50mg∙/L，链霉素50mg∙/L

1.3菌株筛选方法

将样品分别放入四类微生物富集培养基中，25℃，180rpm, 培养48h。然后将富集培养基10倍递增稀释，取适宜稀释倍数的培养液涂布于3种培养基琼脂平板中，25℃培养（培养时间由菌生长情况而定）。将培养出的菌落进行分离培养，将纯的单菌落进行斜面保藏。

1.4产酶菌株的筛选

将菌株分别点种到产酶筛选培养基中，25℃，培养72h。于淀粉酶筛选平板

直接加入适量碘液，观察透明圈的存在与否及大小；于右旋糖酐筛选平板上加入95%的乙醇，置于-20℃冰箱，24h后观察透明圈的存在与否及大小。

1.5菌株产淀粉酶的测定

1.5.1菌株的产酶

将产生透明圈最大的菌株接入产酶培养基中，25℃，180rpm，培养24h。

1.5.2淀粉酶酶活力的测定

1.5.

2.1麦芽糖标准曲线的制备

取7支25mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的麦芽糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同麦芽糖含量的反应液。

表1 葡萄糖标准曲线的制作

管号麦芽糖标准液

（mL）蒸馏水

（mL）

DNS

（mL）

麦芽糖含量

（mg）

0 0 2 2.0 0

1 0.

2 1.8 2.0 0.2

2 0.4 1.6 2.0 0.4

3 0.6 1.

4 2.0 0.6

4 0.8 1.2 2.0 0.8

5 1.0 1.0 2.0 1.0

6 1.2 0.8 2.0 1.2

摇匀，沸水浴10min，取出，冷却，加蒸馏水10mL，混匀，调波长520nm，用0号管调零点，比色。以光密度值为纵坐标，麦芽糖含量（mg）为横坐标，做标准曲线。

1.5.

2.2酶活力测定方法

底物（1%淀粉溶液）：称取1g淀粉溶于100ml 0.05mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液中。

表2 样品的测定

样品空白 1.0 1.0

样品 1.0 1.0

将样品于25℃水浴反应30min(样品空白不参加水浴反应)，然后将样品空白和样品每管加入2mlDNS试剂，沸水浴反应10min，冷却，各加蒸馏水10ml，混匀，测520nm处的吸光值，从标准曲线上查出麦芽糖的含量。

1.5.

2.3酶活力单位定义

在一定条件（25℃30min）下，1min催化产生1 g麦芽糖的酶量，即为一

个酶活力单位。

1.6菌株的初步鉴定

1.6.1菌株的形态特征

观察菌落形态和大小，对细菌进行特殊结构染色，并进行显微摄影。

1.6.2细菌的生理生化特性

接种：用接种环从斜面上挑取透明圈最大的菌株接种于安培瓶中。25℃培养。

表3 细菌微量生化鉴定管的使用

注：培养结束后，添加相应的试剂，观察判断结果。

1.7NaCl浓度对细菌生长的影响

配制NaCl浓度（%）分别为0,1.5，3.0，4.5，6.0，7.5，10的2216E液体培养基（蒸馏水配制）各两只，并留一只不接种作为对照，一支接种不培养作为初始浓度对照。分装于试管中，装液量为5ml,121℃灭菌20min。

在不同浓度NaCl培养基中以4％接种量接入菌悬液，25℃，180rpm，培养24h。

2. 结果与讨论

2.1菌落特征

表4 菌落特点

2.2菌株的产酶特性

对透明圈进行描述，并拍照。

2.3NaCl浓度对细菌生长的影响

以菌体生长量（OD600）为纵坐标，NaCl浓度（%）为横坐标做生长曲线图，得出最适该菌生长盐度。

2.4细菌的生理生化特性

表6 生理生化性质鉴定结果

2.5 淀粉酶酶活力测定

2.5.1 麦芽糖标准曲线

2.5.2 酶活力计算

参考文献：

[1]李艳华，张利平。海洋为生物资源的开发与利用。微生物学通报。