产酶海洋微生物的筛选
产壳聚糖酶海洋真菌鉴定、寡营养培养基优化及廉价培养基研究
产壳聚糖酶海洋真菌鉴定、寡营养培养基优化及廉价培养基研究朱利平;黄惠莉【摘要】A chitosanase-producing marine strain was isolated by our laboratory. Identification by rDNA - ITS sequence analysis, and it is Penicillium oxalicum. This is the first time that Penicillium oxalicum＇ s the ability of producing chitosanase is reported. For the purpose of fermentation chitosanase in industrial, we studied oligotrophic medium components, such as source of carbon, nitrogen source, saltresistance, acidresistance and rotary speed. We explored different kinds of cheap medium for production of chitosanase. We found the soybean powder was the best, and the medium of soybean powder was as follow （g/L seawater）： soybean powder 25 g, and the optimal enzyme activity was 8.5 U/mL. This medium was insufficient 5% of the cost of original. It provided direct theory and experiment foundation on industrialized production of chitosanase.%对筛选出的产壳聚糖酶海洋真菌进行了rDNA—ITS序列分析技术鉴定，确定该菌为Penicillium oxalitun，这是首次报道该菌属具有产壳聚糖酶的能力。
微生物工程实验报告
实验1 培养基的配制和灭菌一、目的要求1.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。
2.了解几种灭菌方法，掌握高压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
3.熟悉菌种分离筛选的前期准备工作及操作方法。
4.每2人一组，每人一份实验报告。
二、实验材料1.药品：酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖、KNO3、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、1N HCl、1N NaOH2.设备：高压蒸汽灭菌锅、紫外线灭菌灯、75%酒精棉。
3.材料：天平、药匙、电炉、pH 试纸、烧杯、量筒、5mL、10mL 注射器、玻璃棒、试管、培养基、吸管、移液器（1mL 0.2mL）、牛皮纸、线绳、标签等。
三、实验内容(一) 培养基的配制1．培养基的配制方法和步骤1)称量：按照配方正确称取所需药品放于烧杯中。
2)溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。
3)调pH 值：用1N NaOH 或1N HCl 调pH，用pH 试纸对照。
4)加琼脂溶化：加热过程要不断搅拌，可适当补水。
5)分装：注意不要污染试管塞或纱布。
6)包扎成捆：用记号笔注明何种培养基。
7)灭菌：在高压锅中， 115 °C 高温灭菌30min。
2．培养基的配制A.富集培养基（液体）：海水2216E 液体培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉1.0，海水1L，pH 8.0。
取50mL 分装250mL 三角瓶后，8 层纱布封口，外包1层牛皮纸，121℃，高温灭菌20min。
B. 2216E 斜面（固体）：海水2216E 液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内。
加入3mL，121℃高温灭菌20min，灭菌后摆斜面。
C. 无菌生理盐水和保种液：生理盐水： NaCl 0.85% 蒸馏水配制。
每支试管加入5mL，盖上试管帽、包扎、121°C 高温灭菌20min。
保种液：生理盐水，加25%甘油D. 碳源优化培养基：以海水2216E 液体培养基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，磷酸铁0.01%，人工海水，pH7.6）为基础，碳源分别是：葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、乳糖，每种碳源的添加量为1%。
一株高产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及发酵条件的优化
作者简介： 崔洪霞 （ 】 ９ ７ ７ 一 ） ，女，黑龙江 尚志人，博： 士，副教授 ，主要研究方 向为微生物与生化药学，Ｅ ｍａ ｉ ｌ ：ｈ ｘ ｃ ｕ ｉ ＠ｙ ｓ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． Ｃ ／ Ｉ 。
一
株 高产碱性蛋 白酶海洋细菌 的筛选及 发酵条件 的优化
崔洪 霞 。 ’ ，李春 林 ，钱 龙 ，孙 滢 ，周艳艳 ，史云柯
（ １ ． 燕 山大学 环境 与化 学工程学 院，河北 秦 皇岛 ０ ６ ６ ０ ０ ４ ；２ ． 河北省应用化 学重点 实验 室，河北 秦皇 岛 ０ ６ ６ ０ ０ ４ ；３ ． 燕山大学 里仁学院 ，河北 秦皇 岛 ０ ６ ６ ０ ０ ４ ）
酶 的 强 弱顺 序 为 ：ｐ Ｈ 值 、培 养 时 间 、接 种 量 、装 液 量 ，菌 株 Ｓ ＤＬ ９在 较 佳 发 酵 条 件 下 的发 酵 液 的 最 大 酶 活 力 达 １ ９ ７ ． ５ ８ Ｕ／ ｍＬ。本 研 究 表 明 从 秦 皇 岛海 域 可 以获 得碱 性 蛋 白酶 高产 菌株 ，丰 富 了菌 种 资源 。
关键词：碱 性蛋 白酶；筛选 ；海泥 ；菌株 Ｓ ＤＬ ９ 中图分类号：Ｑ９ ３ ９ 文献标识码 ：Ａ ＤＯＩ ：１ ０ ． ３ ９ ６ ９ ￣ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ７ — ７ ９ １ Ｘ ． ２ ０ １ ３ ． ０ １ ． ０ １ ５
０ 引言
近 年来 ， 碱 性蛋 白酶 由于与传 统 的化 学催化剂 相 比具有 催化 能力强 、底物专 一性 高等优 点，已被 广泛 应用于制 革 、银回收 、医药 、食 品、饲 料 、化 学工业 、废物 处理等生产 及行业 。其最 早发现 于 猪胰 脏 中， 而 １ ９ ４ ５年又 发现于地 衣芽孢 杆菌 中 ， 开辟 了微生 物碱性 蛋 白酶 的来源 。 在碱 性蛋 白酶的
海洋微生物活性物质
xx微生物活性物质的研究进展专业：生物工程姓名：李振森学号：02海洋是生命的发源地，约占地球表面积的71%，其中生物种类20多万种，其多样性远远超过陆地生物的多样性。
由于海洋环境具有高盐度、高压、低营养、低温和无光照等条件，从而形成了海洋生物与陆地生物不同的生长方式和代谢系统。
近年来，随着人们对海洋生物研究的不断深入，发现了多种多样的生物及许多具有新颖、特异化学结构的生物活性物质。
海洋生物活性物质主要包括生物信息物质、生理活性物质、海洋生物毒素及生物功能材料等。
目前，从海洋生物中已相继发现300余种新型化合物，结构新颖并具有多样性：有枯类、聚醚类、当醇类、皂昔类、生物碱、多糖、小分子肤、核酸及蛋白质等，并具有丰富的生理及药理活性，包括抗菌、抗肿瘤、抗病毒、防治心血管疾病、延缓衰老及免疫调节等多种功能。
多年来，国内外一直致力于这方面的研究，试图从中开发结构明确，疗效肯定的新型生物活性物质，以用于攻克人类面临的重大疑难疾病，其中具有高生物活性和高选择性的海洋生物毒素备受重视，成为研究的热点。
近年来，海洋生物毒素是海洋生物活性物。
1、xx抗肿瘤活性物质1.1xx放线菌海洋有着极其丰富的放线菌资源，具有抗菌活性的海洋微生物中约有45%来源于放线菌。
就目前的报道，海洋放线菌产生的活性物质大部分来源于小单孢菌属和链霉菌属。
由于海洋放线菌所产生的代谢产物具有功能独特、结构新颖等特点而受到人们的广泛关注，例如抗真菌、抗疟等功能。
另一方面，陆生放线菌的不断开发，发现新的活性物质的可能性越发减少，迫使人们将目光转向海洋放线菌的开发。
1991年Fenical小组［1］首次发现一属全新的需盐生长的特殊海洋放线菌Salinispora，其广泛存在于热带和亚热带海泥中。
2003～2005年Fenical小组从［－］菌株Salinispora tropicaCNB-392中分离得到10个结构新颖的化合物24，其中化合物Salinosporamide A(1)［3］具有广阔的成药前景，对人结肠癌细胞的IC50为［5－6］0．035nmol /L，已作为癌症药物进入临床前研究。
大连海域海洋功能细菌的筛选
大连海域海洋功能细菌的筛选王倩倩;刘玮;刘春莹;迟乃玉;张庆芳;于爽【摘要】从大连海域采集30余种海洋样品,用海水2216E固体培养基、含亚甲基蓝的固体培养基、含碳酸钙的固体培养基等进行培养,初筛出100多株具有产酸、产酶、产抗氧化性物质的菌株;20℃培养48 h,复筛出12株繁殖力强的低温菌,对其进行生长量检测、革兰氏染色、产酸、产葡萄糖氧化酶、亚硝酸盐降解、硝酸盐分解及10℃低温培养.其中菌株M2,5,6,4-1,7-1耐低温、生长快、产酸高、降解亚硝酸能力强、不分解硝酸盐、革兰氏阳性,兼性厌氧,初步确定为低温乳酸菌.同时还筛选出40余株具有葡萄糖氧化酶特性的菌株以及其他特性菌株,并对筛选的近200株海洋菌株进行保藏.该研究进一步证明了海洋微生物种类的多样性,使人们对未知的海洋微生物世界的研究更加着迷.【期刊名称】《科技创新与生产力》【年(卷),期】2019(000)006【总页数】4页(P42-45)【关键词】海洋微生物;细菌;细菌筛选;细菌保藏【作者】王倩倩;刘玮;刘春莹;迟乃玉;张庆芳;于爽【作者单位】大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116622;辽宁省海洋微生物工程技术研究中心,辽宁大连 116622;大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连116622;辽宁省海洋微生物工程技术研究中心,辽宁大连 116622;大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116622;辽宁省海洋微生物工程技术研究中心,辽宁大连116622;大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116622;辽宁省海洋微生物工程技术研究中心,辽宁大连 116622;大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116622;辽宁省海洋微生物工程技术研究中心,辽宁大连 116622;大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116622;辽宁省海洋微生物工程技术研究中心,辽宁大连 116622【正文语种】中文【中图分类】Q93-33浩瀚的海洋是地球上生命的摇篮，海洋特有的环境造就了海洋微生物的多样性与独特性，据估计，海洋微生物可达2 亿种。
微生物酶筛选的一般流程
微生物酶筛选的一般流程英文回答：Microbial enzyme screening typically involves several steps to identify and select enzymes with desired properties. Here is a general process that is commonly followed:1. Identification of target enzymes: The first step is to determine the specific enzyme activity that is of interest. This could be based on the desired function or the ability to catalyze a specific reaction.For example, let's say we are interested in finding enzymes that can degrade cellulose for biofuel production.2. Source selection: Once the target enzyme is identified, the next step is to select a suitable microbial source that is likely to produce the desired enzyme. Microbes such as bacteria, fungi, and yeast are commonlyused sources.Continuing with our example, we could choose to screen cellulose-degrading enzymes from a variety of fungi known for their ability to break down plant material.3. Isolation and cultivation: The selected microbial source is isolated and cultivated under controlled conditions to optimize enzyme production. This may involve growing the microbe on specific media or in specialized bioreactors.In our case, we would isolate the chosen fungi and cultivate them in a nutrient-rich medium that promotes cellulase production.4. Enzyme extraction: Once sufficient enzyme production is achieved, the next step is to extract the enzymes from the microbial culture. This can be done through various methods such as centrifugation, filtration, or precipitation.For example, we could use centrifugation to separatethe fungal cells from the culture broth, and then collectthe supernatant containing the secreted enzymes.5. Enzyme screening: The extracted enzymes are then screened for the desired activity. This can be done through various assays and tests that measure the enzyme's abilityto catalyze the desired reaction.In our case, we could perform assays to measure the ability of the extracted enzymes to break down celluloseinto glucose.6. Enzyme characterization: Enzymes that show promising activity are further characterized to determine their properties. This may include studying their optimal pH and temperature range, stability, substrate specificity, and kinetic parameters.For example, we could determine the optimum temperature and pH at which the cellulase enzyme functions best, aswell as its ability to degrade different types of cellulose.7. Optimization and engineering: If needed, the selected enzyme can be further optimized or engineered to improve its properties. This can be done through techniques such as protein engineering or directed evolution.In our case, we could use protein engineering to modify the cellulase enzyme to make it more efficient in breaking down cellulose.8. Scale-up and production: Once the desired enzyme is identified and optimized, it can be scaled up for large-scale production. This may involve transferring the enzyme-producing strain to industrial fermentation systems and optimizing the production process.For example, we could transfer the selected fungal strain to a large-scale bioreactor and optimize the fermentation conditions for maximum cellulase production.Overall, the process of microbial enzyme screening involves identifying the target enzyme, selecting asuitable microbial source, isolating and cultivating the microbe, extracting and screening the enzymes,characterizing and optimizing the selected enzyme, andfinally scaling up production.中文回答：微生物酶筛选通常包括几个步骤，以确定和选择具有所需特性的酶。
酶工程2-2 常用的产酶微生物
3. 红曲霉(Monascus)
• 红曲霉: 菌落初期白色, 老熟后变为淡粉色、紫 红色或灰黑色,通常形成红色色素。菌丝具有隔膜, 多核, 分支甚繁。分生孢子着生在菌丝及其分支 的顶端, 单生或成链, 闭囊壳球形, 有柄, 其内 散生10 多个子囊, 子囊球形, 内含8 个子囊孢子, 成熟后子囊壁解体, 孢子则留在闭囊壳内。
细 菌
1. 大肠杆菌( Escherichia coli)
• 形态：呈杆状, 有的近似球状, 大小为0. 5μm ×1～3 μm , 一般无荚膜, 无芽孢, 运动或不运动, 运动者周生鞭毛。菌 落从白色到黄白色, 光滑闪光, 扩展。
• 革兰氏染色阴性。 • 产生的酶一般都属于胞内酶, 需要经过细胞破碎才能分离 得到。 • 采用大肠杆菌生产的限制性核酸内切酶、D N A 聚合酶、 D N A 连接酶、核酸外切酶等, 在基因工程等方面广泛应 用。
• 枯草杆菌是应用最广泛的产酶微生物, 可以用于生产α-淀 粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、5′-核苷酸酶和碱性磷酸酶 等。 例如,枯草杆菌BF7658 是国内用于生产α-淀粉酶的 主要菌株;枯草杆菌AS1.398用于生产中性蛋白酶和碱性磷酸 酶。 • 枯草杆菌生产的α-淀粉酶和蛋白酶等都是胞外酶, 而其产 生的碱性磷酸酶存在于细胞间质之中。
霉 菌
1. 黑曲霉( Aspergillus niger)
• 是曲霉属黑曲霉群霉菌。
• 菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成, 菌丛黑褐色, 顶囊大球形, 小梗双层, 分生孢子球形, 平滑或 粗糙。 • 黑曲酶可用于生产多种酶, 有胞外酶也有胞内酶。 例如, 糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、 葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、脂肪 酶、纤维素酶、橙皮苷酶和柚苷酶等。
第二章 产酶微生物的分离与筛选
(2) 醋酸杆菌（Acetobacter）
菌体从椭圆至杆状，单个、 成对或成链，革兰氏阴性， 运动（周毛）或不运动， 不生芽孢。好气。含糖、 乙醇和酵母膏的培养基上 生长良好。 应用：有机酸(食醋等）葡 萄糖异构酶(高果糖浆 )山 梨糖 (维C中间体）
(3)枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
2. 化学诱变剂
(1) 与碱基化学反应的诱变剂:烷化剂、亚硝酸和羟胺 烷化剂(alkylating agent)： 带有一个或多个活性烷基， 带一个活性烷基称单功能烷化剂，带二个或多个的分 别称为双功能或多功能烷化剂。它们的烷基可转移至 其它分子中电子密度高的位置，它们的诱变作用是其 与DNA中的碱基或磷酸作用。 常见的烷化剂有硫酸二乙酯(EDS)、甲基磺酸乙酯 (EMS)、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、亚硝基甲 基脲(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。
2.3.2 突变株的分离与筛选
突变是随机不定向的，但是筛选是定向的。筛选的条 件决定选育的方向，因为突变体高产性能总是在一定 的培养条件才能表现出来。在一个适于突变株繁殖的 特定条件下可以筛选得到具有新性状的菌株，其他原 养型菌株则逐步被淘汰。所以，培养基和培养条件是 决定菌种某些特性保留或淘汰的筛子。 为了有效地筛选突变株，必须采用使新个体表型得以 充分表达的筛选条件。首先要设计一个良好的筛选培 养基和确定合适的培养条件。培养基无论从组成成分、 浓度、配比、pH值都要有利于突变株优良性状的表现。 同时，培养基和培养条件应尽量力求和大生产条件一 致，才能使选育的菌株应用于工业大生产。
2.2.4 初筛
1. 胞外酶的产酶菌株的筛选方法
2. 胞内酶的产酶菌株的筛选方法
微生物的筛选
01
医学领域
在医学领域，微生物筛选对于疾病的诊断、治疗和预防具有重要意义
，例如筛选具有抗药性的病菌和病毒等。
02
工业领域
在工业领域，微生物筛选可用于生产生物制品、酶、有机酸、生物燃
料等，提高生产效率和产品质量。
03
农业领域
在农业领域，微生物筛选可提供抗逆境、抗病虫害的微生物农药和生
物肥料，有助于提高农业生产效益和环境友好型农业的发展。
未来研究展望
• 未来微生物筛选研究将继续关注新的筛选技术和方 法，提高筛选效率和准确性。同时，将加强微生物 资源的保护和利用，发掘更多具有应用前景的微生 物种类和功能。此外，还需要加强微生物安全和伦 理问题的研究，保障微生物筛选和应用的安全性和 合法性。
THANKS
谢谢您的观看
个人防护措施
实验操作人员必须佩戴必要的个人防护用品，如口罩、手套 、实验服等。
在实验操作过程中，应避免直接接触微生物，以防感染和交 叉感染。
实验废弃物的处理
实验过程中产生的废弃物应及时处理，以避免对环境和人 类健康造成潜在危害。
实验室废弃物应分类收集、存放和处理，并按照相关规定 进行无害化处理。
05
微生物筛选的发展趋势
新的筛选技术
基于质谱的筛选方法
利用质谱技术对微生物进行高通量筛选，快速、准确鉴定微生物种类和亚种。
基于生物信息学的筛选方法
通过生物信息学方法，分析基因组、转录组和蛋白质组等数据，预测微生物功能和表型特 征。
基于细胞工程的筛选方法
利用细胞工程手段，对微生物细胞进行改造和筛选，获得具有优良性状和生产能力的细胞 。
03
微生物筛选的实验设计
实验目的
发掘新的微生物资源
产蛋白酶菌株的筛选与酶活力的测定【文献综述】
文献综述生物科学产蛋白酶菌株的筛选与酶活力的测定摘要[摘要]本文主要按照实验设计步骤从海水中筛选出可以产蛋白酶的放线菌，并对获得的放线菌进行初步研究，如形态观察以及酶活力的测定。
从舟山沿海中分离得到几株产蛋白酶的放线菌，并通过酪蛋白平板培养基，水解酪蛋白试验可对菌株的产酶情况进行定性研究，酶活较高的菌株都能产生较大的水解圈。
对其中2株产酶活性较高的菌株进行了以酪蛋白为底物的紫外分光光度法进行酶活性的测定。
[关键词]：蛋白酶；分离纯化；透明圈；酶活力1蛋白酶的简介水解蛋白质肽键的一类酶的总称。
按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。
内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的肽。
外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶[1]。
按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。
工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。
根据蛋白酶对所作用的反应底物的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。
种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。
如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。
2蛋白酶的广泛应用蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。
微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。
例如，乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB)是一大类能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌，目前已知有200多种LAB[2]。
相当多的LAB是益生菌，其作为益生菌有如下依据：其属于肠道正常菌群，对人和动物的健康是有益的[3]。
在农业、兽医、医学以及食品工业[4、5]中是很重要的。
如果对产蛋白酶的乳酸菌种进行了筛选，并将所产的蛋白酶进行了分离纯化，就可以为酸奶的生产研制和微生态制剂的研发提供更优良的菌种。
海洋微生物生物活性物质研究
海洋微生物生物活性物质研究一、本文概述海洋微生物，作为地球上最古老且最多样化的生物群体之一，它们在全球生物地球化学循环和海洋生态系统中发挥着至关重要的作用。
这些微生物在海洋这个极端而多变的环境中，发展出了独特的生存策略和生物活性物质，这些物质不仅对海洋生态系统的稳定性和生物多样性产生深远影响，同时也为人类提供了新的药物来源、生物材料以及环保技术的可能性。
本文《海洋微生物生物活性物质研究》旨在深入探讨海洋微生物的生物活性物质，包括其种类、产生机制、生态功能以及潜在的应用价值。
我们将从海洋微生物的生物多样性出发，阐述其在极端环境下的生存策略，进一步解析这些生物活性物质的化学结构和生物活性，并探讨其在医药、农业、环保等领域的应用前景。
我们也将讨论当前海洋微生物生物活性物质研究的挑战和未来的发展趋势，以期为相关领域的研究提供新的思路和方法。
二、海洋微生物的生存环境及特点海洋微生物，作为地球上生命体系的重要组成部分，其生存环境及特点具有独特性。
海洋环境是一个复杂多变的生态系统，涵盖了从深海黑暗的高压环境到浅海光照充足的低盐环境等各种生态位。
这种环境的多样性为海洋微生物提供了丰富的生存空间和资源，同时也要求它们必须具备在各种极端条件下生存和繁衍的能力。
海洋微生物的生存环境具有显著的高盐度特点。
与陆地微生物相比，海洋微生物必须适应高盐度的环境压力，这要求它们的细胞膜和内部结构具有更强的稳定性。
海洋微生物还必须应对强烈的紫外线辐射、温度变化、压力变化等多种环境压力。
这些压力使得海洋微生物在进化过程中形成了独特的生存策略和生理机制。
海洋微生物的另一个显著特点是它们的多样性。
海洋环境中存在着大量的微生物种类，这些微生物在代谢途径、生理功能和生态角色上表现出极大的差异。
这种多样性不仅丰富了海洋生态系统的功能，也为人类提供了丰富的生物资源。
例如，一些海洋微生物能够产生具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性的物质，这些物质在医药、农业和生物技术等领域具有广泛的应用前景。
海洋生物酶的研究和应用
对的双重功能 应用该酶可以扩增
出高保真的 °≤ 产物 ∀
连接酶链式反应 ≤ 是测定
⁄ 突变的新技术 ∀从海洋古细菌
分离纯化的热稳定性 ⁄ 连接酶 可用 ≤ 技术来测定 !放大和区分 特殊的 ⁄ 序列 ∀
蛋白酶
年代初
∏ 在农
业生化杂志上发表一篇关于从海
洋嗜冷杆菌获得一种新型海洋碱
性蛋白酶的文章 引起学术界和酶
制剂公司的高度重视 ∀迄今为止研
究开发的海洋生物蛋白酶产品有
多个 并申请了国际专利 ∀
碱性蛋白酶
收稿日期
22
修回日期
22
我国尚无这方面的统计资料 应立 即对这方面进行必要的调查研 究 ∀况且 绝大多数海兽均以鱼 !浮 游生物为食 和渔业关系极为密 切 它们对水产资源破坏很大 直 接影响到渔业生产 所以同时应开 展这方面的研究工作 搞清它们之 间的利害关系 以期获得海产资源 的充分利用 ∀
代谢途径与现存的生物有严格的
区别 可以在 ε 以上的极端环
境生存 当然这就要求其有在高温
下稳定的酶系统 ∀热稳定性的核酸
酶如 ⁄ 修饰酶 聚合酶 !连接酶 !
限制性内切酶等 在分子生物学中
有重要的应用价值 ∀ ∏
等从
嗜热古细菌激烈热球菌 Πψροχοχχυσ φυριοσυσ) 中纯化 了一 种 耐 高 温 的 ⁄ 聚合酶 该酶具有多聚酶和校
目前普遍认为 个糖残基的甲 壳寡糖具有抗肿瘤的作用 小分子 的甲壳寡糖或单糖可提高机体免 疫力 有活化肠道乳酸杆菌 ! 双歧 杆菌的作用 ∀甲壳寡糖的生产多采 用盐酸水解法 反应条件剧烈 产
≥≤ ∞ ≤ ∞ ≥≤ °∞ 科学视野
物得率较低 ∀而采用甲壳质酶生产 甲壳寡糖反应温和可控 且有较高
产酶微生物的分离与筛选实验报告书
产酶微生物的分离与筛选实验报告组别：第6组组长：冯建阳组员：崔国强、石勇、于锦项目：产纤维素酶的筛选与分离时间：2014年5月11日一、实验目的1.从富含纤维素的土壤中分离出可以产生纤维素酶的菌种。
2.掌握菌种的筛选方法以及菌种的鉴定方法。
3.掌握培养基的设计和配置。
4.熟练掌握无菌接种技术，微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。
5.学习设计性，综合性实验报告的书写规范。
二、实验原理纤维素是地球上分布最广泛、含量最丰富的可再生资源，探索纤维素资源的有效利用方法具有重要的意义。
纤维素酶最早是1904年在蜗牛消化液中首次发现，由多种组分组成的一个复杂酶系，为水解纤维素及其衍生物的一组酶的总称。
纤维素酶的来源很广泛，自然界中能产生纤维素酶的物种非常多，合成的纤维素酶在组成上有显著的差异，对纤维素的酶解能力也大不相同。
在过去的半个世纪内，人们在各种原生动物、圆虫类、软体动物、甲壳类、昆虫、藻类、真菌类、细菌及放线菌中都发现了纤维素酶。
近年来陆续在古菌中也发现很多纤维素酶的存在。
菌种采集:产纤维素酶细菌的采集选择在纤维素含量较高的地方，如花园表层土壤、腐烂的木头、造纸厂废水及反刍动物的瘤胃及其排泄物等。
本次实验拟从森林土及朽木中获得产酶菌株。
采样的土层太深则厌氧菌占优，而浅层土受紫外线照射，细菌难以存活。
故实验选取距表层土壤10cm处的土壤进行筛选。
纤维素刚果红培养基筛选菌种的原理：1、刚果红可以跟大分子多糖牢固结合。
2、纤维素是大分子多糖，跟刚果红牢固结合。
3、纤维素酶降解平板中的纤维素小分子糖，那么刚果红无法与小分子糖结合，就被洗脱下来，呈现透明圈。
4、在通常的纤维素刚果红培养基筛选菌种的程序中，先用含有纤维素的平板培养菌，等菌长出来后，把菌体刮离，然后加入刚果红染色10-15分钟，再用NaCl冲洗2-3次，产生透明圈的就是能水解纤维素的菌。
三、实验步骤（一）菌种的采集采集人民公园距湿润的表层10cm处的土壤样本40g左右，用研钵研成粉末称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，加入99mL无菌水摇匀静置。
产纤维素酶海洋细菌的筛选和酶学性质的初步研究
（ ． 台大学海洋学 院 ， １烟 山东 烟 台 ２ ４０ ；． ６ ０ ５ ２ 中国科学院烟 台海岸带研 究所 ， 山东 烟台 ２ ４ ０ ） ６０ ３
摘要 ： 从病 烂 的海 洋植 物 中分 离到 一株 高产 纤 维素 酶 的菌株 Ｔ １ ， 兰氏 阴性 ， Ｘ－ ２ 革 经鉴 定
为噬纤维茵属（ ｅｕ ｐａ ａｓ． 中的一个种． ＣＵ ｌ ｈｇ ） ｏ ｐ 该菌株在温度 ２ ５℃ 、 培养基起始 ｐ ． Ｈ ８０条 件下培养 ５ ６ｈ产生碱性纤维素酶活力高达 ３ ４８Ｕ ｍ ． ５ ． ／ Ｌ 酶学性质初步研究显 示，Ｘ一 ２ Ｔ １
作者简 介 ： 唐志红 （ ９４ ） 女 ， １７ 一 ， 山东武 城人 ， 士 ， 博 副教授 ， 研究方 向： 海洋生物活性 洋细 菌 的筛选 和酶 学性 质 的初 步研 究 等 产
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恒 温水 浴 锅 ， 海 金 桥 科 技 仪 器 厂 ； Ｒ－ ４电 上 Ａ １０ １ 子 天 平 ， 克 斯 国 际 贸易 上 海 有 限公 司 ；２Ｅ 型 奥 ７２ 可 见 分光 光度计 ， 光谱 仪 器 有 限公 司 ；Ｄ － 上海 ＴＬ５
基 平板 中加 入适 量 １ｍ ／ Ｌ的刚果 红溶 液染 色 １ ｓｍ
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ｈ 弃去染液 ， ， 用适量 １ｍ ｌＬ的 Ｎ Ｃ 溶液 ， ｏ ／ ａ１ 洗涤 ｌ ｈ 若细菌产生纤维素酶 ， ， 则在菌落的周 围会出现 清晰的水解圈． 选取产生透 明圈的菌株 为初筛菌
种， 将所 选菌 株进 行发 酵 复筛 ， 分离 纯化 ．
蒸 馏水 １００ｍ ｐ ＝ ７５； 酵 培养 基 ： 分 同 ０ Ｌ，Ｈ ． 发 成
初筛培养基 ， 不含琼脂． Ｙ Ｑ Ｌ 一０ Ｉ 立式 压 力 蒸 汽 灭 菌器 ， 海 Ｘ —Ｓ５Ｓ 型 上 博讯实业有限公 司医疗设备厂 ； Ｚ Ｗ－ Ｄ Ｋ ４型电子
微生物大实验报告产酶微生物的筛选
微生物大实验报告产酶微生物的筛选微生物大实验报告：产酶微生物的筛选一、实验背景酶是一种具有高效催化作用的生物大分子，在生物体内参与各种代谢反应，对生命活动起着至关重要的作用。
在工业生产中，酶也被广泛应用于食品、制药、化工等领域。
然而，天然存在的酶往往不能满足工业生产的需求，因此筛选具有高活性、高稳定性和特异性的产酶微生物成为了获取优质酶的重要途径。
二、实验目的本实验旨在从环境中筛选出能够产生特定酶的微生物，并对其产酶能力进行初步评估，为后续的酶学研究和工业应用提供基础。
三、实验材料与方法（一）实验材料1、样品采集：从土壤、污水、腐烂的植物等不同环境中采集样品。
2、培养基：富集培养基：用于增加目标微生物的数量。
筛选培养基：含有特定底物，以筛选出能够产生目标酶的微生物。
鉴定培养基：用于微生物的种类鉴定。
3、试剂：包括显色剂、酸碱指示剂等。
（二）实验仪器1、恒温培养箱：用于培养微生物。
2、超净工作台：提供无菌操作环境。
3、显微镜：观察微生物形态。
4、离心机：分离微生物细胞和上清液。
（三）实验方法1、样品预处理：将采集的样品进行适当处理，如稀释、研磨等。
2、富集培养：将预处理后的样品接种到富集培养基中，在适宜条件下培养一段时间，使目标微生物得到增殖。
3、平板筛选：将富集培养后的菌液稀释后涂布在筛选培养基平板上，培养后观察平板上的菌落形态和颜色变化，筛选出可能的产酶菌株。
4、摇瓶发酵：将筛选得到的菌株接种到液体培养基中进行摇瓶发酵，培养一定时间后测定酶活。
5、菌株鉴定：通过形态观察、生理生化实验和分子生物学方法对产酶菌株进行鉴定。
四、实验结果与分析（一）筛选结果经过平板筛选，共获得了_____株具有产酶潜力的菌株。
这些菌株在筛选培养基上表现出了不同的特征，如菌落形态、颜色变化等。
（二）酶活测定结果对筛选得到的菌株进行摇瓶发酵后，测定其酶活。
结果发现，菌株_____的酶活最高，达到了_____U/ml，其次是菌株_____，酶活为_____U/ml。
海洋生物酶及其应用-精选文档
2.多糖水解酶 （PolysaccBiblioteka arides hydrolases）
海洋多糖水解酶主要包括淀粉酶、甲壳质酶、 琼胶酶、褐藻酸酶、卡拉胶酶等。酶的来源主要 包括两类生物：一类是海洋动物，主要是无脊椎 动物如紫贻贝、日本鲟、滨螺、石鳖、鲍、海兔 等；另一类是海洋微生物，如产气单胞菌、假单 胞菌、交替单胞菌、弧菌等。
20世纪的20年代初，Nobou Kato 在农业生 化杂志上发表一篇关于从海洋嗜冷杆菌获得一种新 型海洋碱性蛋白酶的文章，引起学术界和酶制剂公 司的高度重视,迄今为止研究开发的海洋生物蛋白 酶产品已有几十个，并有多个申请了国际专利。
1.1碱性蛋白酶
日本开发的一种碱性蛋白酶是从海洋共 生菌发酵提取的，酶的MW 为31kD,作 用的pH5-11，最适pH为10，最适温度 20℃。用于洗衣粉添加剂。美国从海洋 船蛆共生菌（ATCC39867）发酵生产 一种新型碱性蛋白酶,分子量3.6KD、 pI8.6,作用pH4-12、最适温度50℃。 可在复杂试剂中保持稳定性，并有抗氧 化的功能。已应用于洗衣粉和镜头清洁 剂。
多糖水解酶具有很多作用。如在海藻原生质体制备方 面的应用：海藻细胞生理生化的研究，进行目的基因的导 入、创造新品种或作为生物反应器生产所需的物质，细胞 间的融合，改变体细胞的遗传物质，创造优良杂交品种等； 单细胞饵料生产中的应用：酶解大型海藻，分离成单细胞， 作为海洋养殖动物的饵料， 具有营养全面、 材料易得、 生产加工简便等优点； 用于单糖和寡糖的制备：琼胶经琼 胶酶水解可以形成寡糖如三糖和四糖，然后经β- 半乳糖苷 酶降解可形成单糖，琼胶寡糖在食品生产中有广泛的应用， 如可用于饮料、 面包及一些低热量食品的生产，另外， 近 来在日用化工领域又发现了琼胶寡糖的一些新用途， 日本 以琼胶寡糖为添加剂生产的化妆品对皮肤的保湿效果良好， 对头发有很好的调理效果。目前普遍认为6 个糖残基的几 丁质寡糖具有抗肿瘤的作用，小分子的几丁质寡糖或单糖 可提高机体免疫力， 有活化肠道乳酸杆菌、 双歧杆菌的作 用。
产淀粉酶海洋酵母菌多样性的研究
产淀粉酶海洋酵母菌多样性的研究1王晓红，池振明中国海洋大学生命学院与技术学部，青岛（266003）E-mail：zhenming@摘要：从采集自南海、南极、烟台长岛、青岛近海的泥样和鱼类肠道内容物中分离得到了数百株海洋酵母菌，进一步筛选得到8株能够产淀粉酶的海洋酵母菌。
根据对它们的生理和生化特征、所产粗酶最适pH和温度以及18S rDNA的部分序列的分析，确定菌株Ba、H、M和W1a属于解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica），菌株DMC 属于平滑假丝酵母（Candida parapsilosis），菌株W13a、G7b和N13d属于普鲁兰短梗霉（Aureobasidium pullulans）。
结果显示在海洋环境中产淀粉酶的海洋酵母菌多样性还是相当丰富的，并发现解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica）、平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）和普鲁兰短梗霉（Aureobasidium pullulans）是可以产生淀粉酶的新酵母菌菌株。
关键词：海洋酵母菌；淀粉酶；18S rDNA；进化树1. 引言淀粉酶 (amylase) 是一种用途极广的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸业、清洁剂工业、化学和临床医学分析、食品工业和制药工业。
淀粉酶可分为α、β淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。
α-淀粉酶为内切酶，以无规则的方式切开淀粉分子内部的α-1,4糖苷键而使淀粉生成糊精和低聚糖等, 是一种Ca2+依赖性酶。
β-淀粉酶从非还原性末端顺次切下麦芽糖，为外切酶。
葡萄糖淀粉酶是外切酶，作用于α-1,4糖苷键，从非还原性末端切下葡萄糖分子。
淀粉由于价格低廉，原料来源广泛，成为酵母菌生产单细胞蛋白和乙醇的最好底物。
环境中的酵母菌菌株大部分是安全的，所以可降解淀粉的酵母受到了日益广泛的关注。
陆地酵母菌Arxula adeninivorans, Lipomyces, Saccharomycopsis, Schwanniomyces, Candida japonica， Cryptococcus sp，Corticium rolfsii和Filobasidium capsuligenum及所产的胞外淀粉酶已被广泛研究[1]。
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产酶海洋微生物的筛选
前言：浩瀚的海洋是地球生命的摇篮，它覆盖着地球表面积的71%，海水总体积占地球总水量的97%。
全球80％以上的物种蕴藏于海洋中，由于独特的生存环境（如高压、高渗、高温、低温等复杂多变的生态环境）及海洋生物物种间的生态作用远比陆生物种复杂和广泛，因此赋予海洋生物均活性远比陆生生物要强，尤其重要的是有些海洋生物活性物质的结构与陆生生物化合物不同，表现出独特的活性，作为产酶资源就具有了突出的特点和优势。
人们从海洋环境中已经分离的到各种极端酶，如嗜冷酶、嗜热酶、嗜压酶、嗜盐酶等，由于具有广泛的适应性，在生物技术和工业应用中已担任了重要的角色。
1 材料与方法
1.1样品采集
从连云港海域采集
1.2培养基
1.2.1细菌培养基
蛋白胨5g，酵母粉1g，琼脂20g 陈海水1000ml，pH 7.4-7.6
1.2.1.1细菌富集培养基
将1.2.1的细菌培养基去掉琼脂
1.2.1.2产淀粉酶细菌筛选培养基（初筛）
将1.2.1的细菌培养基加入2%的可溶性淀粉
1.2.1.3产右旋糖酐酶的细菌筛选培养基（初筛）
将1.2.1的细菌培养基加入1%的右旋糖酐
1.2.1.4产淀粉酶发酵培养基（复筛）
将1.2.1.2的培养基去掉琼脂
1.2.2放线菌培养基
可溶性淀粉20g，NaCl 0.5g，MgSO4∙H2O 0.5 g, KNO3 1 g，K2HPO4 0.5g，FeSO4 0.01 g，琼脂20 g ，陈海水1000mL，pH7.4～7.6。
注：在制备平板时培养基融化后加入：重铬酸钾80mg∙/L
1.2.3真菌培养基
马铃薯去皮，取200g切成小块，加50%陈海水煮沸30min，4-6层纱布过滤，加20g葡萄糖，琼脂20g，溶化后再用陈海水定容至1000mL ，pH7.2～7.4。
注：在制备平板时培养基融化冷却至60℃后加入：青霉素50mg∙/L，链霉素50mg∙/L
1.3菌株筛选方法
将样品分别放入四类微生物富集培养基中，25℃，180rpm, 培养48h。
然后将富集培养基10倍递增稀释，取适宜稀释倍数的培养液涂布于3种培养基琼脂平板中，25℃培养（培养时间由菌生长情况而定）。
将培养出的菌落进行分离培养，将纯的单菌落进行斜面保藏。
1.4产酶菌株的筛选
将菌株分别点种到产酶筛选培养基中，25℃，培养72h。
于淀粉酶筛选平板
直接加入适量碘液，观察透明圈的存在与否及大小；于右旋糖酐筛选平板上加入95%的乙醇，置于-20℃冰箱，24h后观察透明圈的存在与否及大小。
1.5菌株产淀粉酶的测定
1.5.1菌株的产酶
将产生透明圈最大的菌株接入产酶培养基中，25℃，180rpm，培养24h。
1.5.2淀粉酶酶活力的测定
1.5.
2.1麦芽糖标准曲线的制备
取7支25mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的麦芽糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同麦芽糖含量的反应液。
表1 葡萄糖标准曲线的制作
管号麦芽糖标准液
（mL）蒸馏水
（mL）
DNS
（mL）
麦芽糖含量
（mg）
0 0 2 2.0 0
1 0.
2 1.8 2.0 0.2
2 0.4 1.6 2.0 0.4
3 0.6 1.
4 2.0 0.6
4 0.8 1.2 2.0 0.8
5 1.0 1.0 2.0 1.0
6 1.2 0.8 2.0 1.2
摇匀，沸水浴10min，取出，冷却，加蒸馏水10mL，混匀，调波长520nm，用0号管调零点，比色。
以光密度值为纵坐标，麦芽糖含量（mg）为横坐标，做标准曲线。
1.5.
2.2酶活力测定方法
底物（1%淀粉溶液）：称取1g淀粉溶于100ml 0.05mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液中。
表2 样品的测定
样品空白 1.0 1.0
样品 1.0 1.0
将样品于25℃水浴反应30min(样品空白不参加水浴反应)，然后将样品空白和样品每管加入2mlDNS试剂，沸水浴反应10min，冷却，各加蒸馏水10ml，混匀，测520nm处的吸光值，从标准曲线上查出麦芽糖的含量。
1.5.
2.3酶活力单位定义
在一定条件（25℃30min）下，1min催化产生1 g麦芽糖的酶量，即为一
个酶活力单位。
1.6菌株的初步鉴定
1.6.1菌株的形态特征
观察菌落形态和大小，对细菌进行特殊结构染色，并进行显微摄影。
1.6.2细菌的生理生化特性
接种：用接种环从斜面上挑取透明圈最大的菌株接种于安培瓶中。
25℃培养。
表3 细菌微量生化鉴定管的使用
注：培养结束后，添加相应的试剂，观察判断结果。
1.7NaCl浓度对细菌生长的影响
配制NaCl浓度（%）分别为0,1.5，3.0，4.5，6.0，7.5，10的2216E液体培养基（蒸馏水配制）各两只，并留一只不接种作为对照，一支接种不培养作为初始浓度对照。
分装于试管中，装液量为5ml,121℃灭菌20min。
在不同浓度NaCl培养基中以4％接种量接入菌悬液，25℃，180rpm，培养24h。
2. 结果与讨论
2.1菌落特征
表4 菌落特点
2.2菌株的产酶特性
对透明圈进行描述，并拍照。
2.3NaCl浓度对细菌生长的影响
以菌体生长量（OD600）为纵坐标，NaCl浓度（%）为横坐标做生长曲线图，得出最适该菌生长盐度。
2.4细菌的生理生化特性
表6 生理生化性质鉴定结果
2.5 淀粉酶酶活力测定
2.5.1 麦芽糖标准曲线
2.5.2 酶活力计算
参考文献：
[1]李艳华，张利平。
海洋为生物资源的开发与利用。
微生物学通报。