生化试验课件实验十：凝胶柱层析分离血红蛋白和DNP-胰糜蛋白酶
生化实验血红蛋白的凝胶过滤
血红蛋白的凝胶过滤植物098 原硕0901080808摘要：用凝胶过滤分离血红蛋白样品，理解凝胶过滤原理，熟悉凝胶过滤操作方法。
关键字：血红蛋白，凝胶过滤一、研究背景及目的：凝胶过滤（gel [filtration] chromatography ; gel filtration chromatography ; GFC）作为一种常用的分离过滤方法，是实验中的常用手段之一，具有它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果等优点。
在很多方面都有所应用：⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。
本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。
适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。
凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。
⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。
测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。
⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液所以理解其原理及应用方法也是很重要的，本实验通对血红蛋白采用凝胶过滤，理解凝胶过滤的基本原理，熟悉和掌握凝胶过滤的基本操作技术。
凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白课件
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层析的两种相
➢ 固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换 剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分 离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。
➢ 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体 或超临界体等，都称为流动相。在柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。
凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白
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凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白
实验原理
由于Hb（红色，分子量64500）与二硝苯-鱼精蛋白（黄色，分子量2000-12000）的 分子量不同，通过交联葡聚糖凝胶G-50（sephadex）层析柱用蒸馏水洗脱分离。从 颜色不同可直接观察到血红蛋白洗脱较快，鱼精蛋白洗脱较慢。
➢ 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 ➢ 英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论。 ➢ 1944年出现纸层析以后，层析法不断发展，相继出现薄层层析、亲和层析、凝胶层析、
气相层析、高压液相层析等。
凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白
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叶绿素通过碳酸钙管柱所形成的色谱图
凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白
➢ 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分 子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流 过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相 的推力影响不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白
一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。 ➢ 离子交换剂包括交换树脂和交换纤维素两种。 ➢ 离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分
不同分子量蛋白质的分离――凝胶管柱层析法(gel filtration colu
不同分子量蛋白质的分离――凝胶管柱层析法(gel filtration colu实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。
大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数 Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。
该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。
但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。
测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。
本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。
血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离【可编辑的PPT文档】
凝胶过滤层析经常遇见的问题
1．流速慢 （1）有气泡、出水管阻塞 （2）没打开夹子 （3）柱压太紧（操作压过大、长期使用、 接头漏气）
2．拄内产生气泡 （1）上水口不流或皮管破裂，洗脱液外流 （2）接口漏气，如上水口螺丝拧的不紧
3．条带扭曲 （1）胶面不平 （2）样品或洗脱液中有颗粒 （3）装拄不均匀
剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交 联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。 交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大 。
G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字 既代表交联度，也代表特水量。X数字越小， 交联度越大，网孔越小，适用于分离低分 子质量生化产品。X数字越大，交联度越小， 网孔越大，适用于分离高分子生化产品。X 数字也代表凝胶的持水量，如G-25表示1g 干胶持水2.5mL，G-100表示 1g干胶持水 10mL，依次类推。
凝胶层析法
凝胶层析（gel chromatography）常 出现多种名称 ：如凝胶过滤、分子筛层析、 排阻层析、凝胶渗透层析等。
凝胶层析的定义： 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分
子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状 不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 。
凝胶层析的应用范围：
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、 酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过 单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用 凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液 进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。
• 1、凝胶处理； • 将SephadexG-25凝胶干粉放入过量水
中浸泡24小时或沸水浴2小时。浸泡后搅动 凝胶再静置，待凝胶沉积后，倾去上层细 粒悬浮，如此反复多次。
• 2、层析柱的预备
用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。清洗过程 中不能使用毛刷，以免擦伤层析柱内壁，影响层 析分离效果。固定好层析柱各处的接口，用水检 察层析柱各处的接口密封性。将清洗后的层析柱 垂直固定在铁架台上。自柱底端出口的聚乙烯管 内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气泡， 待气泡排除后，是溶液在底部留至3-5cm高即关 闭出水口。
凝胶层析(生化实验)PPT课件
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Electrophoresis
Electrophoresis is an analytic method to analyze the purity of proteins. It is can also be used to estimate molecular weight of proteins.
生物大分子的分离生物大分子的分离凝胶层析分离蛋白质凝胶层析分离蛋白质生物化学实验生物化学实验上海交通大学生命科学技术学院上海交通大学生命科学技术学院实验目的实验目的了解凝胶柱层析的原理及应用掌握凝胶柱层析的基本操作技术进一步了解和掌握其他层析技术purificationmultistepprocedure
上海交通大学生命科学技术学院
生物化学实验
生物大分子的分离 —— 凝胶层析分离蛋白质
实验目的
1. 了解生物大分子分离、纯化的方法 2. 了解凝胶柱层析的原理及应用，掌握凝
胶柱层析的基本操作技术 3. 进一步了解和掌握其他层析技术
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Purification is a multi-step procedure.
1. Dialysis and ultrafiltration 2. Gel electrophoresis 3. Gel filtration chromatography 4. Ultracentrifugation
凝胶柱层析分离血红蛋白和DNP-胰糜蛋白酶.
血清蛋白质乙酸纤维素薄膜电泳 Nhomakorabea目的与要求：
了解电泳的原理、练习乙酸纤维素薄膜电
泳技术；
掌握凝胶层析的原理、熟练掌握实验操作。
原理：
凝胶层析原理 P19
电泳原理 23
凝胶柱层析分离血红蛋白和DNP-胰糜蛋白酶
Sephadex G-50的准备 装柱15cm 加样与洗脱 凝胶的再生
血清蛋白质乙酸纤维素薄膜电泳
点样
电泳150V一小时 染色与脱色
注意事项：
影响电泳的因素：蛋白质分子所带电 荷、分子量。 凝胶柱的制备质量决定分离效果的好 坏。
【生物课件】实验3生物大分子的分离——血红蛋白凝胶层析
6 - 6 - 实验3 生物大分子的分离——血红蛋白凝胶层析3.1 相关基础知识凝胶层析又称凝胶排阻层析、凝胶过滤、分子筛层析和凝胶渗透层析是一种按分子大小分离物质的层析方法广泛应用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离和纯化。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中然后用缓冲液洗脱。
大分子无法进入凝胶颗粒中的静止相中只能存在于凝胶颗粒之间的流动相中因而以较快的速度首先流出层析柱而小分子则能自由出入凝胶颗粒中并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡因此就要花费较长的时间流经柱床从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外而对某些小分子化合物则不能排阻但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积Vt、外水体积Vo及分离物本身的洗脱体积Ve有关即KavVe-Vo/Vt-Vo 在限定的层析条件下Vt和Vo都是恒定值而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大Kav值小反之则Kav值增大。
因此在同一凝胶柱上分离分子量不同的物质时由于流动相的作用这些分离物质将发生排阻和扩散效应。
若缓冲液连续地倾入柱中柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发生其最终结果是分子量大的物质先从柱中流出分子量小的物质则后从柱中流出。
流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来检测后分段合并相同组分的各管流出物即等于把分子量不同的物质相互分离开7 - 7 - 了。
其分离效果受操作条件如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等的影响而最直接的影响是Kav值的差异性Kav值差异性大分离效果好Kav值差异性小则分离效果很差或根本不能分开。
分配系数Kav既是判断分离效果的一个参数又是测定蛋白质分子量的一个依据。
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1、洗净的层析柱保持垂直。 2、放蒸馏水，排沙芯下空气，留2ml水，关闭出口 3、加入搅拌均匀的SephadexG-50悬液，调节流速10滴
/min，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至15cm。 注意：床面上Hale Waihona Puke 保持少许水，防止胶床露出液面。如胶面
不平，可用玻棒轻轻的搅动，让凝胶自然沉降，使表 面平整。 4、上留1--2cm的水，关闭出口。
3、加样与洗脱
1、加样：滴管将血样加入水下床面上，在柱内形成一薄层 2、洗脱：打开出口，保持流速10滴/min，使样品溶液渗
入凝胶。注意不断轻轻的加入蒸馏水，保持凝胶床面不 露出水面。 3、观察：血红蛋白和DNP-胰糜蛋白酶的分离。相对分子 量为：67000和13500。
4、凝胶的再生
观察后，要不断的加水使有色溶液全部流出，为下次实 验做准备。
四、结果及讨论：
★将看到的现象以图示的 方法画到你的实验报告上。 并分析实验结果。 ★ Sephadex G-50? 交联度与凝胶孔径的关系？
★ 凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏 。 加样分离时，滴速越慢，分离效果越好。
实验十 凝胶柱层析分离血红 蛋白和DNP-胰糜蛋白酶
刘向华
南京医科大学
Nanjing medical university
生化与分子生物学系
Department of biochemistry and molecular biology
一、目的与要求：
掌握凝胶层析的原理、 熟练掌握实验操作。
三、操作步骤：