定量蛋白质组学的方法有哪些 (2).doc
几种蛋白质定量方法的实际应用
臣本布衣，躬耕于南阳，苟全性命于乱世，不求闻达于诸侯。先帝不以臣卑鄙，猥自枉屈，三顾臣于草庐之中，咨臣以当世之事，由是感激，遂许先帝以驱驰。后值倾覆，受任于败军之际，奉命于危难之间，尔来二十有一年矣。
另一种可供选择的蛋白质定量方法为Lorry法。其原理为，蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福林试剂反应，产生蓝色，在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。Amersham公司将Lorry法进行了改良并商品化。首先用沉淀剂和共沉淀剂沉淀蛋白质，这样可以消除样品中的色素、尿素和盐等干扰因素。然后用含Cu2+的复溶剂溶解蛋白质，再加入显色液进行定量。这种方法的优点在于定量准确，对各种干扰因素的容忍度都比较高，但是由于引入了沉淀复溶的操作步骤，使得该方法比较耗时，而且容易沉淀复溶不完全，影响结果的准确性。
其原理为蛋白质与碱性铜溶液中的cu2n络和使得肽键伸展从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福林试剂反应产生蓝色在一定浓度范围内其颜色的深浅与蛋白质中酸和色氨酸的含量成正比由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同因此在测定时需使用同种蛋白质作标准
几种蛋白质定量方法的实际应用
定量作为生物实验室的日常工作之一，具有非常重要的意义。在蛋白质组学研究中，我们常常需要对蛋白质进行快速定量。无论是对蛋白质表达谱的定量比较还是蛋白质理化性质的分析，都建立在准确的定量这一基础之上。蛋白质的快速定量方法主要依靠蛋白质本身的发色基团，或其与其它显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量。目前常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三种。
定量蛋白质组学研究技术
细胞工程教研室
四 针对性亲和标签技术
磷酸化蛋白质同位素标识亲和标签
➢ PHIAT技术是建立在ICAT技术基础上旳研 究和鉴定磷酸化蛋白质磷酸化位点旳新措施， 且对低丰度蛋白质旳鉴定有效。
➢ PHIAT试剂具有亲核旳巯基和同位素标签及 其共价结合旳生物素基团。
➢ 利用此措施已成功鉴定了酪蛋白和酵母提取 物旳磷酸化位点。
经 过 用 N-acetoxy-[2H3]-succinimide/ N-acetoxy-succinimide(NAS) 乙 酰 化 处 理酶解肽段，把同位素标签引入样本分 析体系中。NAS可标识必需氨基酸亲和 肽段旳N末端。因为肽段旳乙酰化位点 不一，被标识旳重链和轻链质量差也不 固定，给自动化分析带来了一定困难。
➢ 每一种试剂都涉及三部分：一种报告基 团（分子量分别为114u、115u、116u 和117u）、一种平衡基团（分子量分别 为31u、 30u、29u和28u）和一种与 肽段反应旳基团。
➢ 当我们需要同步比较四组不一样品时， 样品分别跟四种iTRAQ试剂结合，然后 混合在一起做质谱鉴定。
细胞工程教研室
细胞工程教研室
♣ 可裂解同位素标识亲和标签
✓ 用13C/12C替代了2H/1H ✓ 使用了酸裂解连接子 ✓ 不同肽段质量相差9u或9u旳倍数 ✓ 亲和标签试剂由3部分构成
• 半胱氨酸特异性反应基团 • 含9个同位素13C或12C标签旳可裂解连接子 • 亲和纯化生物素
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学五种常用蛋白质组学定量分析方法对比。
百泰派克生物科技汇总介绍了五种常见定量蛋白质组学分析方法的优势和特点。
SWATH-MS数据可重复性研究。
SWATH在不同实验室间可重复性的研究。
这个研究统计了全世界11个不同的实验室中使用SWATH鉴定的数据重复度情况。
iTRAQ/TMT标签结构以及相对定量原理详解。
通过标记多组不同样品，iTRAQ和TMT能够同时比对正常组织样品和肿瘤组织样品的蛋白水平差异，以及精准检测肿瘤在发展的不同阶段的蛋白水平变化。
蛋白质定量技术及其在临床研究中的应用。
百泰派克采用高通量质谱平台提供蛋白质定量服务，包括定量蛋白质组学，蛋白质定量技术及其他蛋白质组学相关的服务。
百泰派克生物科技独立仪器分析平台，拥有多年蛋白质定量经验，竭诚为您服务。
蛋白组分析中dda和prm。
DDA和PRM是质谱不同的数据采集模式。
DDA主要用于非靶向蛋白质组学的研究，PRM则用于靶向蛋白质组学的研究。
百泰派克生物科技提供基于质谱的DDA、MRM/PRM和DIA蛋白质组学分析服务。
iTRAQ定量蛋白质组学。
iTRAQ蛋白质组学即iTRAQ定量蛋白质组学，是一种标记定量蛋白质组学，指利用iTRAQ标记技术和质谱技术对蛋白质组进行定量。
百泰派克生物科技提供基于质谱的iTRAQ定量蛋白质组学分析服务。
蛋白互作定量检测。
蛋白互作定量检测指对相互作用的蛋白质进行定量。
百泰派克生物科技提供基于质谱的SILAC与免疫共沉淀质谱联用的蛋白互作定量分析服务，可同时实现互作蛋白质组的定性和定量。
DIA蛋白质组学样品处理步骤。
DIA蛋白质组学指利用DIA技术（如SWATH）对样品中的蛋白质组进行检测分析。
百泰派克生物科技提供基于质谱的DIA蛋白质组学分析服务和蛋白质样品制备服务。
功能蛋白质组学。
功能蛋白质组学是蛋白质组学的一部分，其主要目的是研究蛋白质的功能和生命活动的分子机制。
百泰派克生物科技提供基于质谱的功能蛋白质组学分析服务。
定量蛋白质组学技术
定量蛋白质组学技术随着科技的发展，科学家们逐渐掌握了理解生物组成和生物学过程的能力。
其中最有前景的技术之一就是定量蛋白质组学技术。
那么什么是定量蛋白质组学技术呢？本文将围绕这一问题来介绍这项技术。
一、什么是定量蛋白质组学技术？定量蛋白质组学技术是利用高通量质谱技术分离和分析细胞或组织中存在的蛋白质，同时识别这些蛋白质在不同生物学状态下的表达变化。
通俗地说，它是一种通过观察和比较蛋白质在不同状态下的表达程度，得出蛋白质的功能和进一步的研究方向。
二、定量蛋白质组学技术的实现步骤（1）样本收集和制备首先需要准备样本，样品的采集和样品制备是定量蛋白质组学技术中非常关键的步骤。
正确的样品制备可以确保得到的蛋白质质量和数量的准确性。
这一步骤要求科学家考虑到实验设计、样品提取、洗涤和分离蛋白质的方法等多种因素，以进行比较有价值的定量蛋白质组学分析。
（2）蛋白质的消解和分离在样品制备之后，需要进行蛋白质消解和分离。
消解和分离需要先对蛋白质进行断裂和分离，这可以通过多种不同的方法完成，包括化学方法和生物物理学方法。
（3）质谱分离和检测在进行蛋白质的消解和分离后，需要将其转化为质谱可探测的形式。
这可以通过液相色谱与质谱联用，通过对洗脱色谱的样品进行质谱分离和检测，最后得到蛋白质中的定量信息。
（4）数据分析最后，科学家需要利用数据分析方法来获取蛋白质在细胞或组织中不同生物学状态下的表达变化数据。
这包括统计学分析、峰检测、数据可视化等方法。
三、应用领域定量蛋白质组学技术的应用领域广泛。
它在癌症、心血管疾病、肾脏病、神经疾病和生理学等多个学科领域都有应用。
例如，有研究表明，通过定量蛋白质组学技术可以研究药物作用机制、生物标志物和药物靶标。
在精神类疾病方面，也有相关研究表明，在慢性使用大麻后，定量蛋白质组学技术可以检测出相关蛋白质的变化，这些变化与记忆和认知功能的损害有关。
总的来说，定量蛋白质组学技术在许多生物学和医学领域都有广泛应用，可以帮助科学家更好地了解细胞和组织的生物学功能和疾病发展机制，并为开发新药和治疗方案提供更精细的信息。
定量蛋白质组学的方法有哪些
定量蛋白质组学的方法有哪些？1 背景和意义从生命活动的直接执行者——蛋白质的角度研究生命现象和规律（特别是疾病防治和病理研究）已成为研究生命科学的主要手段。
而这些研究往往离不开对细胞、组织或器官中含有蛋白质种类和表达量的研究。
对处不同时期、不同条件下蛋白质表达水平变化的研究，识别功能模块和路径，监控疾病的生物标志物，这些研究都需要对蛋白质进行鉴定和定量。
生物质谱技术的出现和不断成熟为蛋白质差异表达分析提供了更可靠、动态范围更广的研究手段。
基于质谱技术，科学家们不断开发出新的定量蛋白质组学方法，来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。
2 方法学介绍目前较主流的定量蛋白质组学方法有5种，分别是Label-free、iTRAQ、SILAC、MRM(MRM HR)、和SW ATH。
简述如下：2.1 Label-freeLabel-free定量，即非标记的定量蛋白质组学，不需要对比较样本做特定标记处理，只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变化，通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。
Label-free操作简单，可以做任意样本的总蛋白质差异定量，但对实验操作的稳定性、重复性要求较高，准确性也较标记定量差。
因此，Label-free技术适合于大样本量的定量比较，以及对无法用标记定量实现的实验设计。
2.2 iTRAQiTRAQ定量是目前定量蛋白质组学应用很广泛的技术，该技术的核心原理是多肽标记和定量，将多肽的含量转化为114、115、116和117同位素的含量(或113、114、115、116、117、118、119和121的8标记)，从而简化了定量的复杂性，最终通过多肽定量值回归到蛋白的定量值，从而最终测定出不同样本之间蛋白质的差异。
iTRAQ定量不依赖样本，可检测出较低丰度蛋白，胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等，且定量准确，可同时对8个样本进行分析，并可同时得出鉴定和定量的结果，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析。
蛋白质组学技术方法
(2)基于同位素标记亲和标签的定量蛋白质组学策略 Isotope-Coded Affinity Tags (ICAT)
ICAT为同位素编码的亲和标签，其试剂的羰基基团能够特异性地与半胱氨酸侧 链反应，使这些蛋白在分离时具有相同的特性，随后与质谱串联，根据质量的差异
03 进行区分并定量，可同时对蛋白质组进行鉴定和相对定量。
基质辅助激光解 吸电离飞行时间
质谱 SELDI-TOF-MS
双向电泳法 2-DE
荧光差异电泳 DIGE
稳定同位素标记 Stable isotope labeing
无标记定量法 Label-free
多反应检测技术 MRM
选择反应检测技 术
SRM
代谢标记 Metabolic labeling （SILAC、15N）
03 （1）双向电泳（2-DE）
非标法，采用凝胶法分离蛋白质，根据胶点灰度值和面积定量蛋白质。
凝胶需要每个样品有几个复制凝胶，不能直接重叠在一个凝胶。
优点：对分析组数无限制。
组 不足：1. 检测蛋白种类少。由于溶解性限制，难以检测到很多疏水的膜
学
技 结合蛋白、低丰度蛋白以及一些极酸极碱性的蛋白；
术
介 绍
蛋白质组学技术方法
目录
Content
1 蛋白质组学概念 2 定量蛋白质组学技术分类 3 定量蛋白质组学技术介绍
五
六
定
量
蛋
一
第
白
一
质
部 分
组
学
二
的
概
三
念
四
蛋白质组学
蛋白质组是指一个细胞、一个组织或一
01
种生物的基因组所表达的全部蛋白质的
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法蛋白质组学定量分析是对细胞或组织中的蛋白质进行定量分析的一种方法。
它是研究蛋白质组学的重要手段之一，可以揭示蛋白质的表达差异、功能变化以及相关的生物学过程和疾病机制。
目前，蛋白质组学定量分析的方法主要包括质谱定量法和定量免疫学方法。
质谱定量法是蛋白质组学定量分析的主要方法之一。
它基于质谱技术和同位素标记原理，使用质谱仪对样品中的蛋白质进行定量分析。
目前常用的质谱定量方法包括多重反应监测（MRM）、定量蛋白质鉴定（iTRAQ）和标记蛋白质鉴定（TMT）等。
多重反应监测（MRM）是一种常用的质谱定量分析方法。
它利用质谱仪中的三重四极杆（triple quadrupole）进行分析。
首先，确定待测蛋白质的肽段序列，然后合成同位素标记的肽段标准品作为内标。
接下来，使用质谱仪对待测蛋白质和内标进行质谱分析，测量待测蛋白质和内标的特定肽段的质荷比和峰面积。
最后，通过内标的峰面积和待测蛋白质的峰面积进行定量计算，得到待测蛋白质的表达量。
定量蛋白质鉴定（iTRAQ）是一种基于同位素标记的质谱定量方法。
在iTRAQ 实验中，待测组织或细胞培养基中的蛋白质经过胰蛋白酶消化后，将消化产物用不同的同位素标记。
这些标记反应产物有不同的质量，通过质谱分析可以得到有关各组分的数量比。
通过比较标记反应产物的相对丰度，可以定量分析待测蛋白质的表达差异。
标记蛋白质鉴定（TMT）是一种与iTRAQ类似的同位素标记质谱定量方法。
TMT 实验中，多个待测样品用不同的同位素标记，然后将这些样品混合在一起通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。
通过质谱分析可以得到不同样品中蛋白质的相对表达量和差异表达蛋白质的鉴定。
定量免疫学方法也是蛋白质组学定量分析的重要方法之一。
相比于质谱定量法，定量免疫学方法具有高灵敏度、高特异性和高通量等优点。
常用的定量免疫学方法包括酶联免疫吸附实验（ELISA）、西方印迹（Western blotting）和流式细胞术（flow cytometry）等。
5蛋白组学定量蛋白质组学
d0/d4标记蛋白质N末端原理
HH H
H
HH
H
2
H
2
H4-Nic-NHS[1-(H4-烟酰氧基)琥珀酰亚胺] 四氘代 H4-Nic-NHS[1-(H4-烟酰氧基)琥珀酰亚胺]
23
MALDI-TOF mass spectrum of a peptide labeled with
succinic anhydride and deuterated succinic anhydride
36
–COOH羧基标记
通过对羧基酯化进行 标记
用H和D标记的甲醇酯 化标记，来定量研究 蛋白质表达量的差异
37
羧基酯化标记进行蛋白定量研究
比例＝2 : 1
38
缺点：
特异性不是很好，在C末端和Asp和 Glu残基上都有标记，且效率不均
采用的标记条件容易引起天冬酰胺 (Asn)和谷氨酰胺(Gln)的去酰胺
通过离子交换层析图 谱上峰的面积，可以 计算两种肽段的相对 量 0.88 : 1
35
MCAT优点
O-甲基异脲(O-methylisourea)对Lys残基εNH2的胍基化程度可以进行量上的控制
增加的质量（每个胍基42 Da）可以很容 易在MS上检测到
ε-NH2的胍基化修饰并不影响肽段的离子 化和带电荷程度
31
MCAT策略流程：定性
Lys只在Trypsin酶切后的末端，所以产生的b离子都没有被修饰；所有的y 离子带Lys，因此被修饰。
在MS/MS图谱上，所有的b离子是单一条带出现，所有的y离子是成对出现， 丰度比例一样，且相差同样的m/z。
容易区分b离子和y离子，容易读出氨基酸序列。
32
MCAT策略流程：定量
蛋白质组学定量研究常见方法-PPT课件
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1：双向电泳
基于2D-PAGE 的经典定量分 析方法。 1、样品准备 和定量：抽提 对照组和各种 不同实验组的 蛋白质。 2、蛋白质分 离：蛋白质经 过2D-PAGE分离 后染色（银染、 考染等）。 3、蛋白质的 定性与定量分 析：通过与对 照组相Image Master 7.0分 析出实验组中 差异点，质谱 鉴定差异点蛋 白质,同时应用 软件分析出其 表达量的变化。
4：化学标记法—ICAT
ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子 的空间位阻 （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每 个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特 异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化， （4） ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修饰 物，会增加数据库搜索的复杂性 （5）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会造 成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。 （6）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生β -消除反应 使部分标签断裂。
蛋白质组学定量研究常见方法
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蛋白质组学定量研究常见方法
1：常规双向电泳 2：DIGE 3：15N等同位素标记 4：ICAT 5：iTRAQ 6：SILAC
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定量蛋白质组学的技术及其应用
定量蛋白质组学的技术及其应用随着生物技术的不断发展，蛋白质组学已经成为目前最火热的领域之一。
其中定量蛋白质组学被认为是极具前景的技术，能够高通量地同时比较多份样品中成千上万个蛋白质的表达量水平，从而明确不同组织、状态或疾病的生理或病理生理学差异。
本文将介绍定量蛋白质组学技术的原理、方法、应用范围以及未来发展趋势。
一、定量蛋白质组学的原理在定量蛋白质组学中，最常见的方法是使用质谱技术。
利用液相色谱技术分离样品中的蛋白质，然后用质谱仪进行代谢指纹图和肽质量谱的分析，以确定蛋白质的结构和数量。
在质谱仪中，将质量/电荷比 (m/z) 作为自变量，将每个分子的质量以及分子的相对丰度 (也称为丰度) 表示为因变量。
二、定量蛋白质组学的方法由于质谱技术的复杂性，定量蛋白质组学的方法是多样的。
在这里我们举例两种常见的方法：1、 TMT 组识别法Tandem Mass Tag (TMT) 是通过标记样品中生物分子的专利方法，它可以同时检测到多达10个不同样品的蛋白质，并使结构相似的蛋白质以预定的比例标记标识。
TMT 标记的水平和单个蛋白质质量的频谱群体，可以唯一地确定每个蛋白质的背景丰度。
2、SILAC 技术SILAC 是 Stable Isotope Labelling by Amino acids in Cell culture 的缩写，即细胞培养过程中使用含有不同重稳定同位素的氨基酸标记试验样品。
标记的样品与非标记的样品混合，并进行液相色谱/质谱分析。
SILAC通过使用同位素的缩放系数，计算出蛋白质浓度的相对变化。
它优点是对样品不受限制，同时由于与增加等量重的同位素的可中和性不同而导致的分子质量的差异，因此有助于区分样品和对照组。
三、定量蛋白质组学的应用1、癌症生物标志物的鉴定蛋白质组学在癌症生物标志物的鉴定中表现出了很多潜力。
癌症生物标志物通常是包含在体液中的特定蛋白质，其表达因肿瘤而发生变化。
通过定量蛋白质组学技术，可以在大规模存储的样本中同时分析成千上万个蛋白质，从而鉴定并量化癌症生物标志物，以提高癌症的早期检测率。
定量蛋白质组学研究技术
定量蛋白质组学研究技术定量蛋白质组学研究技术是一种基于质谱技术，通过分析蛋白质组学中的定量变化，来研究细胞、组织或生物体内蛋白质表达的数量变化。
这种技术可以用于诊断疾病、评估治疗效果、揭示蛋白质功能等方面的研究。
本文将介绍定量蛋白质组学研究技术的原理、方法和应用。
定量蛋白质组学研究技术的原理是通过质谱仪来定量分析蛋白质样品中的各个蛋白质的相对或绝对数量。
常用的定量方法有定量蛋白谱法（QuantiSpectrum）、定量蛋白同位素标记法（SILAC）、定量蛋白肽标记法（iTRAQ）和定量蛋白质异位素标记法（TMT）等。
定量蛋白谱法是通过比较不同实验组样品中的质谱图峰强度来确定蛋白质的数量变化。
它可以分别应用于肿瘤细胞研究、生物标志物发现等方面。
SILAC是一种利用同位素标记技术来定量蛋白质的方法。
在该方法中，通过在不同实验组中添加不同重量比的同位素标记的氨基酸（通常是L-谷氨酰-[U-13C6，U-15N2]丙氨酸），然后进行蛋白质提取、消化、质谱分析。
通过比较同位素标记蛋白质和未标记蛋白质的质谱峰强度，就可以定量蛋白质的数量变化。
iTRAQ是一种通过修饰蛋白质消化产物来定量蛋白质的方法。
在iTRAQ实验中，将不同实验组的蛋白质消化产物用不同的寡肽修饰标记物标记，然后混合，并进行液相色谱-质谱分析。
通过比较同位素标记的寡肽的质谱峰强度，就可以定量蛋白质的数量变化。
TMT也是一种利用同位素标记技术来定量蛋白质的方法。
在TMT实验中，将不同实验组的蛋白质消化产物用不同的同位素标记物标记，然后混合，并进行液相色谱-质谱分析。
通过比较同位素标记的蛋白质肽段的质谱峰强度，就可以定量蛋白质的数量变化。
定量蛋白质组学研究技术在医学、生物学和蛋白质化学等领域有广泛的应用。
例如，在临床医学中，可以用定量蛋白质组学研究技术来寻找患者体内具有预后价值的蛋白质标志物，以辅助诊断、预测疾病进展和评估治疗效果。
在生物科学研究中，可以用定量蛋白质组学研究技术来揭示细胞信号转导通路、细胞功能调控机制等方面的问题。
蛋白质组学第10期定量方法介绍
蛋白质组学第10期定量方法介绍•蛋白质组学第1期-认识基础概念•蛋白质组学第2期-认识蛋白质组学原始数据•蛋白质组学第3期-蛋白质组学的三大元素•蛋白质组学第4期文章搜库过程复现•蛋白质组学第5期搜库软件之MaxQuant 再介绍•蛋白质组学第6期搜库软件之MaxQuant 结果数据介绍•蛋白质组学第7期复现文章数据- 预处理之Perseus 的使用•蛋白质组学第8期文章复现之数据处理•蛋白质组学第9期文章数据分析之差异蛋白筛选和功能分析•知识回顾定量蛋白质组学一、无标定量（相对定量）1.概念2.原理参考文献3.理论基础方法一方法二4.流程5.特点二、有标定量1.概念2.原理3.种类4. ITRAQ1）参考文献2）原理3）ITRAQ4）实验流程5）峰谱结果6）特点5、SILAC1）基本原理和流程2）参考文献3）优势知识回顾我们先来回顾以下蛋白质组学bottom up的流程先将蛋白用胰酶酶，酶切肽段上质谱检测，搜库软件搜库，数据分析img定量蛋白质组学对处不同时期、不同条件下蛋白质表达水平变化的研究，识别功能模块和路径，监控疾病的生物标志物，这些研究都需要对蛋白质进行鉴定和定量参考文献（Quantitative mass spectrometry in proteomics : acritical review）img文章展现了：代谢标记、化学标记、合成标准肽、无标定量（lable free)，虽然文章时间较早，但是对于不同方法的比较描述很清楚一、无标定量（相对定量）1.概念无标记定量法是一种质谱分析方法，目的是测定两个或两个以上生物样品中蛋白质的相对含量，不使用含有稳定同位素的化合物蛋白质。
2.原理参考文献基于质谱的定量蛋白质组学策略和方法研究进展. 中国科学 : 生命科学 , 2015.3.理论基础方法一基于离子流色谱峰(extracted ion current, XIC)的定量算法（MaxQuant）img在保留时间(retention time, RT)轴上, 根据肽段母离子的质荷比提取不同保留时间下的相应同位素峰簇的信号强度, 重构 XIC, 并利用XIC 的面积或信号加和等指标作为肽段的定量结果.（Maxquant) 方法二谱图计数（Spectral Counting）方法。
蛋白质组学定量研究常见方法
蛋白质组学定量研究常见方法蛋白质组学定量研究是通过测定蛋白质样本中蛋白质的相对或绝对含量来了解生物系统中蛋白质表达的变化。
在蛋白质组学定量研究中，有很多常见的方法，包括质谱法、免疫学法、色谱法和光谱法等。
以下将对其中几种常见方法进行介绍。
1.质谱法质谱法是蛋白质组学定量研究中应用最广泛的方法之一、质谱法可以利用质量比较准确测定蛋白质的绝对或相对含量。
常见的质谱方法包括二维凝胶电泳质谱法（2D-DIGE）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）和同位素标记质谱法（SILAC），通过这些方法，可以高效准确地测定蛋白质的绝对或相对表达水平。
2.免疫学法免疫学法是一种广泛使用的定量蛋白质组学方法，其基本原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，并通过与荧光或酶标记结合进行测定。
常见的免疫学方法包括Western blot、ELISA、流式细胞术和蛋白质芯片技术等。
这些方法具有高灵敏度和高特异性，可以快速准确地测定蛋白质的表达水平。
3.色谱法色谱法是一种常见的蛋白质组学定量方法，通过色谱柱的分离和去除杂质，从而获得纯净的蛋白质。
色谱法可以分为离子交换色谱、逆向相色谱、尺寸排除色谱和亲和层析等。
通过这些技术，可以高效准确地测定蛋白质的含量和纯度。
4.光谱法光谱法是一种快速准确测定蛋白质含量的方法。
在紫外-可见吸收光谱法中，通过测定蛋白质在特定波长下的吸光度，可以间接测定其含量。
此外，还有荧光光谱法和圆二色光谱法等。
这些光谱法可以快速定量蛋白质的含量，并了解蛋白质的构型和结构。
除了上述方法外，还有一些辅助分析方法，如蛋白质互作法（如蛋白质关联网分析）、功能学法（如蛋白质酶活测定）和结构分析法（如X射线晶体学）等，可以进一步了解蛋白质的功能和结构。
总结起来，蛋白质组学定量研究常见方法包括质谱法、免疫学法、色谱法和光谱法等。
这些方法在蛋白质组学研究中发挥重要作用，可以用于研究蛋白质的表达变化、功能与结构。
随着技术的不断发展，蛋白质组学定量研究方法也在不断更新和完善。
蛋白质的定量分析方法
蛋白质的定量分析方法1．蛋白质的常规检测方法1.1凯氏定氮法一种最经典的蛋白质检测方法。
原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与硫酸作用变成硫酸铵。
然后加碱蒸馏放出氨，氨用过量的硼酸吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。
优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好。
缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大。
1.2双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。
原理：双缩脲是三分子的脲经180℃左右加热，放出一份子氨后得到的产物，在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽链中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅和蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。
优点：较快速、干扰物质少、不同蛋白质产生的颜色深浅相近。
缺点：灵敏度差、三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。
1.3Folin酚试剂法原理：与双缩法大体相同，利用蛋白质中的肽键和铜离子结合产生双缩脲反应。
同时也由于Folin酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。
在一定条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比，由此可测定蛋白质的含量。
优点：灵敏度高、对水溶性的蛋白质含量的测定很有效。
缺点：费时，要精确控制操作时间；Folin酚试剂的配制比较繁琐，且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂（二硫代苏糖醇、巯基乙醇）、EDTA和尿素均会干扰反应。
1.4紫外吸收法原理：蛋白质中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在280nm处具有紫外吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在280nm处的吸光值与肽键含量成正比。
利用一定波长下蛋白质溶液的吸光值与蛋白质含量的正比关系可以测定蛋白质含量。
优点：简便、灵敏、快速、不消耗样品，测定后能回收。
缺点：测定蛋白质含量的精确度差、专一性差；干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶等能吸收紫外光的物质会出现较大的干扰。
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法主要有两种：定性分析和定量分析。
1. 定性分析：常用的定性分析方法有蛋白质质谱技术，如蛋白质液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）。
这些方法能够对样品中的蛋白质进行分离、鉴定和定性分析，可以确定蛋白质的氨基酸序列和特定的修饰情况。
2. 定量分析：常用的定量分析方法有标记蛋白质定量和非标记蛋白质定量。
标记蛋白质定量方法包括同位素标记法和化学标记法。
同位素标记法主要包括稳定同位素标记法（如氘代谱标法）和放射性同位素标记法（如放射性同位素测量法）。
化学标记法主要包括功能分子标记法（如荧光标记法和生物素标记法）和反应性标记法（如对硝基苯甲酸标记法和丙煮醛标记法）。
非标记蛋白质定量方法常用的有相对定量法和绝对定量法。
相对定量法主要通过蛋白质相关的性质，在样品中不同蛋白质的含量所具有的差别来进行定量。
常用的相对定量方法有比较蛋白质的荧光标记法、差减荧光凝胶法和差异凝胶电泳法等。
绝对定量法主要使用内标法，通过加入已知浓度的内标蛋白质来计算目标蛋白质的浓度。
常用的绝对定量方法有多重反应监测法（MRM）和定量蛋白质标准曲线法等。
定量蛋白质组学研究技术
定量蛋白质组学研究技术质谱法是一种使用质谱仪来分析蛋白质的方法。
它可以通过测量蛋白质分子的质量和电荷比例，来确定蛋白质的存在和数量。
质谱法有多种不同的变体，包括质谱法，液相色谱质谱法（LC-MS），以及多反应监测质谱法（MRM）。
这些方法结合了高效液相色谱（HPLC）和质谱仪，可以实现高通量的蛋白质分析，同时还可以检测蛋白质的修饰和亚细胞定位。
标记法是一种通过引入标记分子来量化蛋白质的方法。
常用的标记分子包括放射性同位素、生物素、荧光染料和金纳米颗粒等。
这些标记分子可以与蛋白质特定的官能基结合，并通过测量其信号强度来定量蛋白质的存在和数量。
标记法适用于大规模的蛋白质组学研究，可以同时测量大量的样品。
免疫法是一种使用抗体来定量蛋白质的方法。
这种方法通过引入与特定蛋白质结合的抗体，然后使用荧光或酶作为信号分子，来测量蛋白质的数量。
免疫法可以用于分析特定蛋白质或蛋白质家族的表达和定量。
同时，由于抗体具有高度的特异性，免疫法还可以用于检测蛋白质的修饰和亚细胞定位。
除了上述常用的方法，还有一些新兴的定量蛋白质组学研究技术。
例如，双重标记代谢组学（DIA）是一种结合了质谱法和标记法的新方法，可以同时测量整个蛋白质组的表达和修饰。
单细胞蛋白质组学是一种用于分析单个细胞蛋白质组的技术，可以揭示细胞间的异质性和复杂性。
总之，定量蛋白质组学研究技术是一种重要的工具，可以帮助我们更深入地了解生物体内蛋白质的存在和功能。
这种技术可以通过多种方法实现，包括质谱法、标记法和免疫法等。
随着技术的发展，新的定量蛋白质组学研究技术也在不断涌现，将为蛋白质组学研究带来更多的机会和挑战。
定量蛋白质组学分析方法及应用
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简述定量蛋白质组学技术
定量蛋白质组（quantitative proteomics）是把一个基因组所表达的全部蛋白或者是一个复杂体系所有的全部蛋白进行鉴定和定量的方法。
蛋白质组丰度的动态变化对各种生命过程都有重要影响。
例如在许多疾病的发生和发展进程中，常常伴随着某些蛋白质的表达异常。
发展至今，传统的基于双向电泳的2D和2D-DIGE技术正在逐渐被基于NanoLC-MS/MS的液质联用技术取代；后者需要的样品量更少（25ug蛋白），灵敏度更高（ng级），通量也更高（一次分析可以鉴定和定量超过5000种蛋白）。
定量蛋白质组学常见技术如iTRAQ/TMT、Label Free、三类定量方法，百泰派克均可为您提供服务。
在这里我们给大家简要介绍一下这三种定量蛋白质组学方法：iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)技术分别由美国AB Sciex公司和Thermo Fisher公司研发的多肽体外标记定量技术。
该技术采用多个（2-10）稳定同位素标签，特异性标记多肽的氨基基团进行串联质谱分析，能够同时比较多达10种不同样本中蛋白质的相对含量，可用于研究不同病理条件下或者不同发育阶段的组织样品中蛋白质表达水平的差异。
分析原理iTRAQ/TMT标签包括三部分，如下图：1. 报告基团（reporter group）：指示蛋白样品丰度水平。
2. 平衡基团（balance group）：平衡报告基团的质量差，使等重标签重量一致，保证标记的同一肽段m/z相同。
3. 肽反应基团（amine-specific reactive group)：能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接，从而标记上肽段。
来自不同样品的同一肽段经试剂标记后具有相同的质量数，并在一级质谱检测（MS1）中表现为同一个质谱峰。
当此质谱峰被选定进行碎裂后，在二级质谱检测（MS2）中，不同的报告基团被释放，它们各自的质谱峰的信号强弱，代表着来源于不同样品的该肽段及其所对应的蛋白的表达量的高低。
蛋白定量方法
蛋白定量方法蛋白定量是生物学实验中常见的一项重要技术，准确的蛋白定量对于许多实验都至关重要。
在科研实验中，我们常常需要知道样品中蛋白的浓度，以便进行后续的实验操作。
因此，选择合适的蛋白定量方法对于实验结果的准确性和可靠性有着重要的影响。
目前常用的蛋白定量方法包括比色法、BCA法、Lowry法和荧光法等。
每种方法都有其特点和适用范围，下面将对这些方法进行简要介绍。
比色法是一种常用的蛋白定量方法，其原理是利用蛋白质与某些化学试剂作用后产生颜色反应，通过测量反应产生的颜色强度来确定蛋白质的浓度。
比色法操作简单，灵敏度高，适用于常规的蛋白质浓度测定。
BCA法是另一种常用的蛋白定量方法，其原理是利用蛋白质与BCA试剂在碱性条件下发生蓝色化合物的形成，通过测量产生的蓝色溶液的吸光度来确定蛋白质的浓度。
BCA法对于含有干扰物质的样品有较好的耐受性，适用于复杂样品的蛋白定量。
Lowry法是一种经典的蛋白定量方法，其原理是利用蛋白质与碱性铜离子和碱性蛋白质共存时产生的蓝色络合物来测定蛋白质的浓度。
Lowry法对于蛋白质浓度较高的样品有较好的灵敏度和稳定性。
荧光法是一种高灵敏度的蛋白定量方法，其原理是利用蛋白质与荧光染料结合后产生荧光信号来测定蛋白质的浓度。
荧光法对于蛋白质浓度较低的样品有较好的检测能力，适用于高灵敏度的蛋白定量。
在选择蛋白定量方法时，需要根据样品的特点以及实验的要求来进行选择。
在进行蛋白定量实验时，还需要注意操作的规范性和准确性，避免因操作不当而导致的误差。
另外，不同的蛋白定量方法在操作上也有一些细微的差别，需要根据具体的实验要求来进行选择。
总的来说，蛋白定量是生物学实验中非常重要的一项技术，选择合适的蛋白定量方法对于实验结果的准确性和可靠性至关重要。
希望本文对您在蛋白定量方法的选择和实验操作上能够提供一些帮助。
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定量蛋白质组学的方法有哪些？
1背景和意义
从生命活动的直接执行者——蛋白质的角度研究生命现象和规律（特别是疾病防治和病
理研究）已成为研究生命科学的主要手段。
而这些研究往往离不开对细胞、组织或器官中含有蛋白质种类和表达量的研究。
对处不同时期、不同条件下蛋白质表达水平变化的研究，识别功能模块和路径，监控疾病的生物标志物，这些研究都需要对蛋白质进行鉴定和定量。
生物质谱技术的出现和不断成熟为蛋白质差异表达分析提供了更可靠、动态范围更广的研究手段。
基于质谱技术，科学家们不断开发出新的定量蛋白质组学方法，来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。
2方法学介绍
目前较主流的定量蛋白质组学方法有 5 种，分别是Label-free 、 iTRAQ 、 SILAC 、
MRM(MRM HR) 、和 SWATH 。
简述如下：
2.1Label-free
Label-free 定量，即非标记的定量蛋白质组学，不需要对比较样本做特定标记处理，只
需要比较特定肽段 /蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变
化，通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。
Label-free 操作简单，可以做任意样本的总蛋白质差异定量，但对实验操作的稳定性、
重复性要求较高，准确性也较标记定量差。
因此，Label-free 技术适合于大样本量的定量比较，以及对无法用标记定量实现的实验设计。
2.2 iTRAQ
iTRAQ 定量是目前定量蛋白质组学应用很广泛的技术，该技术的核心原理是多肽标记
和定量，将多肽的含量转化为 114、115、116 和 117 同位素的含量 (或 113、114、115、116、117、118、119 和121 的 8 标记 )，从而简化了定量的复杂性，最终通过多肽定量值回归到蛋
白的定量值，从而最终测定出不同样本之间蛋白质的差异。
iTRAQ定量不依赖样本，可检测出较低丰度蛋白，胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外
蛋白等，且定量准确，可同时对8 个样本进行分析，并可同时得出鉴定和定量的结果，特别
适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析。
金开瑞质谱平台应用
iTRAQ 定量技术，可鉴定多达 6000 种蛋白（以人 HepG2 为例），重复样品间的蛋白表达量
相关性可达到0.95 以上。
2.3SILAC
SILAC 定量的基本原理是分别用天然同位素(轻型 )或稳定同位素(中性或重型 )标记的必
需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经 5-6 个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基
酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。
不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋
白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定，根据一级质谱图中两个同位素型肽段的面积
比较进行相对定量，属于体内代谢标记法。
SILAC 属于体内标记技术，更接近样品真实状态，标记效率高达100% ，且标记效果稳
1
定，不仅适合于进行全细胞蛋白分析，还适合于膜蛋白的鉴定和定量，每个样本只需要几十
微克的蛋白量。
SILAC定量适用于活体培养细胞的分析，对多个样品或同一样品不同条件
下全细胞蛋白或亚细胞蛋白进行差异比较。
2.4 MRM和MRM HR
MRM 是一种基于已知信息或假定信息设定质谱检测规则，对符合规则的离子进行信号
记录，去除大量不符合规则离子信号的干扰，从而得到质谱信息的一种数据获取方式，属于目标蛋白质组。
其关键在于首先要能够检测到具有特异性的母离子，然后只将选定的特异性
母离子进行碰撞诱导，最后去除其他子离子的干扰，只对选定的特异子离子进行质谱信号的
采集。
金开瑞依据前人的工作在AB SCIEX 的 5600-plus 仪器上开发出了MRM HR技术，因为 MRM HR采纳了高精度的数据，因此选择Transition 更加可信，定量更加准确。
MRM HR技术通过两级离子选择，排除大量干扰离子，使质谱的化学背景降低，目标检
测物的信噪比显著提高，从而实现检测的高灵敏度，并具有重现性好、准确度高等特点，特
别适合于已知蛋白质序列的蛋白质表达量差异验证，可以检测较低丰度的蛋白，但一次
MRM 实验只能检测到20 个左右的目标蛋白。
2.5SWATH
SWATH 是瑞士苏黎世联邦理工学院的RuediAebersold 博士及其团队与 AB-SCIEX 于2012 年联合推出的一项全新的质谱采集模式技术，是MS/MS ALL技术的一种扩展。
与传统
的shot-gun 技术相比， SWATH 采集模式能够将扫描区间内所有的肽段母离子经过超高速扫
描并进行二级碎裂，从而获得完整的肽段信息，是一种真正全景式的、高通量的质谱技术。
金开瑞现有的 Triple-TOF 5600-plus 质谱系统，使 SWATH 定量具有较高的准确度和动态范
围，可检测到蛋白质的丰度差异极大，跨越 4 个数量级。
应用 SWATH 采集模式，一次实验即可获得完整的定量与定性结果，无需进行方法优化。
它可以采集样品中所有化合物的信息，可以对所有化合物进行追溯、查询和分析。
定量方法采用高分辨模式，可以消除干扰，提高选择性，且定量能力可与三重四级杆质谱相媲美，灵
敏度和动态范围与SRM 分析水平相当。
针对亚细胞结构、细菌、真菌、细胞分泌物等样本，SWATH 定量的效果非常好。
3结语
学是对一个细胞或组织所表达的蛋白质进行的系统分析，分析技术包括分离蛋白质和肽
的分离科学、识别和定量分析物的分析科学和数据管理和分析的，是其关键性分析工具。
该技术现在已经被作为普遍的发现工具来动态检测一个细胞或组织对外来或内部干扰反应，即定量蛋白质组学。
针对不同的样本，不同的实验分析目的，可选择不同的定量分析技术。
2。