胶体金标记工艺汇总
胶体金标记实验步骤
胶体金标记实验步骤点击次数：13 发表于：2008-08-19 14:02转载请注明来自丁香园来源：丁香园1、蛋白质的处理：胶体金标记蛋白的制备胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。
如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。
除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。
（1）待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1h，去除聚合物。
（2）待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。
标记IgG时，调至9.0；标记McAb时，调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记SPA时，调至5.9～6.2；标记ConA时，调至8.0；标记亲和素时，调至9～10.由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。
由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。
必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。
一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。
2、蛋白质最适用量的选择：胶体金与标记蛋白用量之比的确定（1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml.（2）将标记蛋白（以IgG为例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5µg/ml～50µg/m l，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。
对照管只加1ml稀释液。
（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。
（4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。
胶体金检测试纸生产工艺
胶体金检测试纸生产工艺本项目主要从事犬、猫传染病抗体胶体金检测试纸的生产，以微孔滤膜为固相载体，膜上包被已知抗体，待加入检测样本后，经毛细管虹吸作用或微孔滤膜的渗滤作用，使标本中的抗体与膜上包被的抗体或抗原结合，再通过胶体金标记物与复合物反应，可形成肉眼可见的红色产物。
目前应用最为广泛的胶体金免疫技术有侧向横流模式，又称金标免疫层析法（ImmUnOgoIdChrOmatograPhyASsay,GICA ）O金标免疫层析法试纸条主要是通过毛细管虹吸作用反应,它由以下几部分组成:样品垫、胶体金垫、NC 膜（硝酸纤维素膜）、吸水滤纸、以及PVC 底板，NC 膜（硝酸纤维素膜）上包括一条检测线（T 线）和一条质控线（C 线）一次层叠起来，如下图所示：图3 金标免疫层析法示意图在吸水材料的牵引下，待测抗原在试条上向上走，首先与金标抗体结合成抗原抗体复合物，抗原抗体复合物上行到检测线时，被测抗原的另一结合位点与包被在此处的单抗结合，形成两个抗体结合一个抗原（双抗体夹心）的金标复合物，因有金颗粒在此沉积，故T 线显红色。
未结合抗原的金标抗体上行到C 线时，与“抗金标抗体”结合，所以C 线也显红色。
检测结果判定：T 线与C 线均显线，表明检测结果为阳性；C 线显线，T 线不显，表明结果为阴性。
若C 线不显线，则检测结果无效。
工艺流程如下所示：NC«（跚咬纤假素膜）PVC 底板 测试线（TtK 1）M 析方向样品稀释液噪声：N ；一般固体废物：不合格品(S1)；废防粘纸(S2)；边角料(S3)；废包装物(S4)；危险废物：废一次性滴管(S5)玻璃器具清洗废水(S6)；玻璃器具淋洗废水(S7)；超声波清洗废水(S8)、超声波冲洗废水(S9)o图4胶体金检测试纸生产过程示意图工艺流程简述： (1)检测：外购硝酸纤维素膜、金结合垫、吸水垫、样品垫均人工目视进行检验。
①硝酸纤维素膜：人工目视干燥后的包被膜表面应洁净、无污染、破损等，如有，需用笔标出。
胶体金技术总结Ⅱ
胶体金技术总结Ⅱ一、胶体金技术原理胶体金技术的基本原理是将金金属离子还原成金纳米颗粒并通过其中一种方法使其分散在溶液中。
金纳米颗粒可以通过改变反应条件来调控其形貌和大小，以及表面性质。
其中，分散性是胶体金技术的重要特点，因为金纳米颗粒只有在分散状态下才能充分发挥其特殊性质。
二、胶体金技术制备方法化学还原法是最常用的制备胶体金的方法之一、它通过将金离子还原为金金属颗粒，并通过表面活性剂、电解质等调控分散性。
化学还原法制备的胶体金颗粒粒径较小且分散性好，但对条件要求较高。
溶胶-凝胶法是一种将溶胶中的颗粒逐渐转变为凝胶的制备方法。
通过控制凝胶形成的条件，可以调节金纳米颗粒的形貌和大小。
沉积法是通过将预制的胶体金颗粒沉积到底物表面，制备具有特定功能的薄膜或涂层。
该方法可以制备出均匀、稳定的胶体金薄膜，并且可以调控颗粒的形貌和密度。
光化学法是通过光化学反应将金离子还原为金颗粒。
光化学法制备的胶体金颗粒分散性好，并且可以调控颗粒的形貌和大小。
三、胶体金技术应用1.材料科学方面，胶体金可以用于制备纳米尺度的电子材料，如导电薄膜、导电纳米线等。
此外，胶体金还可以作为催化剂、催化剂载体、光催化材料等。
2.生物医学方面，胶体金颗粒具有良好的生物相容性和生物活性，可以用于制备药物载体、生物传感器、光热治疗等。
胶体金的表面还可以修饰生物分子，用于生物成像、生物分析等应用。
3.传感器方面，胶体金可以用于制备高灵敏度、高选择性的传感器。
通过修饰胶体金表面的功能分子，可以实现对特定分子的检测，并且可以通过纳米尺度的效应提高传感器的性能。
4.光电子方面，胶体金颗粒具有优异的光学性质，可以用于制备光电器件，如光伏器件、光探测器等。
胶体金颗粒的表面还可以修饰光子晶体，制备具有特殊光学性质的材料。
总之，胶体金技术是一种具有广泛应用前景的技术。
通过调控金纳米颗粒的形貌、大小和表面性质，可以制备出具有特殊功能的材料，并用于材料科学、生物医学、传感器、光电子等领域。
胶体金标记工艺
胶体金标记工艺胶体金标记工艺是一种常用于生物医学领域中的标记技术。
该技术利用纳米级的金颗粒作为标记物，通过将其附着在生物分子表面上，实现对分子生物学、细胞生物学等领域中的生物实体进行追踪和观察。
在医学领域中，胶体金标记工艺具有较高的生物相容性和生物学稳定性，并且该技术标记出的分子具有较明显的颜色，方便观察和分析。
胶体金标记工艺的步骤主要包括：制备胶体金溶液、表面修饰、选择适宜子和标记反应。
首先，需要制备胶体金溶液，一般采用还原金盐的方法制备，即在还原剂的作用下，将金盐还原成具有红色或蓝色色泽的胶体金颗粒。
其次，在得到的胶体金颗粒表面修饰，以增强这些颗粒的稳定性和生物相容性。
接着，通过选择适宜的生物分子，例如抗体、酶、 DNA 等，将其与表面修饰的胶体金颗粒结合，形成金标记化合物，标记出需要研究的生物实体，例如细胞、蛋白质等。
胶体金标记工艺具有一些优点，包括：①生物相容性优良，可以应用于生物体内；②标记物稳定性高，可以长时间保存；③信号强度高，可观察性好。
此外，该技术在应用上有很大的灵活性，可以选择不同大小、形状的胶体金颗粒和不同种类的生物分子，作为标记物进行应用。
然而，胶体金标记工艺也存在一些挑战，例如：①标记物数量难以准确控制；②标记物存在信号交叉的情况；③标记物在复杂生物环境下的作用机理尚不完全清楚。
此外，胶体金标记工艺的应用需要严格控制实验条件，以避免样本干扰和实验误差的影响。
综上所述，胶体金标记工艺是一种应用较广泛的标记技术，不仅在生物医学领域有着广泛的应用前景，也在其他领域，例如材料科学和化学分析等方面有所涉及。
然而，对于该技术进行应用时需要注意实验条件的控制，以便能够获得准确可靠的实验结果。
未来，随着生物技术的发展，胶体金标记工艺将会在更多领域得到应用和推广。
胶体金免疫标记技术
胶体金免疫标记技术胶体金免疫标记技术一、胶体金的制备一、胶体金的制备 根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm 的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm 范围内。
范围内。
在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。
水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。
使用不同种类、使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。
即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。
还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，因此产生的胶体金粒子数量越多，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。
但体积也越小。
但体积也越小。
粒子直径每增加一倍，数量减少为粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的1/8。
以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3～16nm 的胶体金。
因此一般胶体金探针均使用该方法进行。
但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。
聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。
此时在溶液中添加此时在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能够去除这些残基。
双标记或制备5-10 nm 的胶体金时建议使用该方法。
的胶体金时建议使用该方法。
利用柠檬酸为还原剂，可以制备12～150 nm 直径的胶体金。
但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。
因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16 12-16 nmnm 直径的胶体金。
金。
除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5 nm 的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。
磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，题，但所形成的金粒子体积变化较大。
磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法故该方法已经很少使用。
已经很少使用。
氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g 或1g ），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5 1.5 ml ml 试管分装为1 1 ml ml 保存（-20℃）。
胶体金标记工艺汇总知识讲解
免疫金的特性胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组织化学技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。
用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，这类胶体金结合物常称为免疫金复合物，或简称免疫金（immunogold）。
胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚，一般认为是物理吸附性的。
胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷，与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。
因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。
来源：Gold 2免疫金的制备1．用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。
原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。
但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。
在调节胶体金的pH值时应注意，胶体金会阻塞pH计的电极，不可直接将电极插入胶体金溶液中，宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇（PEG，20000）稳定胶体金后，再调胶体金的pH 值。
2．将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，放置室温反应2～5min。
由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度，应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐。
3．加入浓度为0.2％的PEG或BSA以饱和游离的胶体金。
4．离心分离，去除上清液中未结合的蛋白质。
离心条件视胶体金颗粒的粒径而异：对5nm 金颗粒可选用40000r/min离心1h；8nm金颗粒用25000r/min离心45min；14nm金颗粒用25000r/min离心30min，40nm金颗粒用15000r/min离心30min。
5．轻吸上清液。
沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心。
如此洗涤2～4次。
以彻底除去未结合的蛋白质。
6．免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。
稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。
几种胶体金技术详解(完整版)资料
几种胶体金技术详解（完整版）资料(可以直接使用，可编辑优秀版资料，欢迎下载）胶体金免疫分析技术详解随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。
前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。
这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。
它实际上属于快速斑点免疫结合分析，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA 和斑点免疫层析分析DICA。
本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。
金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术，是于1971年建立的一种信号显示技术。
此技术最初用于免疫电镜检查，由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。
此后，此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。
近10多年来，利用硝酸纤维素膜（NC）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。
胶体金是指金微小粒子（0-100nm）分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶，用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。
胶体金的制备和标记2
胶体金的制备和标记
• 1971年Faulk 和Taytor将胶体金引人免疫 化学 • 免疫组化（IHC） • 免疫层析法( immunochromatogra-phy) • 快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)
快速试剂常用标记物的特点对照表
特性 呈色清晰度 灵敏度 稳定性 颜色可视度 重现性 按比例递增 一步检测 多元检测 背景干净度 制备难易度 使用简易度 实用性 低成本 * 一般 ** 较好 ***很好 金 *** *** *** * *** *** *** *** *** *** *** ** *** 银 * * *** — *** *** *** *** *** *** *** ** *** 碳 *** ** ** * * ** *** ** * ** ** ** *** 乳胶 *** ** ** *** * * *** ** ** *** *** ** *** 染料 *** ** ** *** * * *** ** * ** ** ** *** 酶 *** *** * ** ** * — ** * ** * *** **
标记
• • • • 搅拌下加入抗体 搅拌反应一段时间后加入稳定剂 再搅拌反应一段时间 注意观察胶体金的颜色变化和有无颗粒出现
标记胶体金的纯化
• 离心纯化 • 过滤纯化
标记胶体金的鉴定
• 透射电镜法 •标记后肉眼观察 •特异性、灵敏度观察（主要）
胶体金的存放
• • • • 室温或4℃保存 避免低温冻存 避光无灰尘 制备完毕后最好在20天以内进行标记
胶体金的标记
蛋白质等电点性质
• 蛋白质颗粒在溶液中所带的电荷，既取决于其分子组 成中碱性和酸性氨基酸的含量，又受所处溶液的pH影 响。 • 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质游离成正、负离 子的趋势相等，即成为兼性离子(zwitterion,净电荷 为O)，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点 (isoelectric point,简写pI)。 • 处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。蛋白 质溶液的pH大于等电点，该蛋白质颗粒带负电荷，反 之则带正电荷。
胶体金标记流程
胶体金标记流程原理（一）免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技）在还原剂如柠檬酸三钠、白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、HAuCl术。
胶体金是由氯金酸（4称并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，为胶体金。
由于这可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，胶体金在弱碱环境下带负电荷，种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。
、PHA胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、等。
根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上ConA病理学和细胞生组织学、结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、物学等领域。
主要利用了金颗粒具有高电子密度的特(Immunogold labelling techique) 免疫金标记技术当这些标记物在相应的配体处大量聚在显微镜下可见黑褐色颗粒，性，在金标蛋白结合处，这一反因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。
（二）器皿及试剂的处理1.玻璃器皿的清洁制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。
如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成，形成的颗粒大小不一，颜色微红、无色或混浊不透明。
我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净，加入清洁液（重铬酸钾1000g,加入浓硫酸2500ml，加蒸馏水至10000ml）浸泡24h，自来水洗净清洁液，然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗3～4次，自来水冲洗掉洗洁剂，用蒸馏水洗3～4次，再用双蒸水把每个器皿洗3～4次，烤箱干燥后备用。
通过此方法的处理玻璃器皿不需要硅化处理，而直接制备胶体金。
也可用已经制备的胶体金溶液，用同等大小颗粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后弃去，再用双蒸水洗净，即可使用，这样效果更好，因为减少了金颗粒的吸附作用。
电镜胶体金标记方法
（1）超薄切片厚50～70nm左右，载于200～300网孔的镍网上。
（2）置1%H2O2内10min至1h（视树脂的硬度和切片的厚度而定），以去锇酸和增进树脂穿透性，有利抗体进入。
如切片很薄或于低温包埋时，此步可省略。
操作时，滴入1%H2O2液1滴于蜡板上，将网的载片面轻浮于液滴上。
对中枢神经系统切片，有主张以1%过碘酸钾（KIO4）代替H2O2的。
（3）双蒸水洗3次，每次10min，第1，2次洗法如（2），浮于液滴上，第3次以盛双蒸水的注射器沿镍网面冲洗，水流应有适当压力，但不宜过高强，用滤纸在网缘将水吸干。
（4）浮于正常羊血清（1：50～1：100）滴上，室温30～60min，以饱和固定剂中的游离醛基占据非特异性结合部位。
（5）PBS漂洗3min，洗1次（有人主张不洗）。
（6）滤纸吸干，孵育于第一抗体血清滴上，先室温预孵1h，再置于4℃24～36h。
（7）PBS漂洗3min，3次。
（8）PBS（内含1%的牛血清白蛋白）pH8.2中，5min，此步为胶体金结合作准备。
（9）胶体金标记抗体液1：30～1：100，淡红色为适宜稀释液，室温孵育10min至1h。
（10）双蒸水洗3min，3次。
如作双重染色，则应将镍网翻过来，用另一类抗体血清，重复上述步骤（2）～（10）。
胶体金标记蛋白A技术（Protein A-gold technique, PAg法）PAg复合物制备方法简便，作为第二抗体，无种属特异性，可以免去不同种属动物要制备不同的特异性免疫球蛋白。
PAg 复合物与包埋剂和细胞成分都极少发生非特异性的交互作用，蛋白A和金粒间非共价的结合特性既不影响蛋白A的活性，又能保持高度的稳定性，PAg复合物分子最小易于穿透组织。
PAg复合物的原液在4℃可保存达一年之久。
电镜水平的PAg染色法PAg法在电镜技术的应用原则是二步标记法，可用于包埋前和包埋后染色。
其主要区别于一般胶体金免疫染色在：①须1%卵白蛋白－PBs （pH7.4）或1%卵白蛋白—0.05mol/l Tris缓冲液（pH7.4）来封闭非特异性的结合部位，而不是采用羊或其它的动物的正常抗血清，因为PAg复合物能够与正常血清组中的Ig结合，从而给出假阳性结果；②在应用第一抗血清孵育和PBS冲洗后作第二抗血清即PAg复合物孵育前的准备时，应用的PBS或TBS 的pH应变更为pH8.2。
09胶体金标记流程
.胶体金标记流程（一）原理免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技）在还原剂如柠檬酸三钠、白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、HAuCl 术。
胶体金是由氯金酸（4称并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，为胶体金。
由于这胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。
、SPA、PHA胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如等。
根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上ConA病理学和细胞生结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、物学等领域。
主要利用了金颗粒具有高电子密度(Immunogold labelling techique) 免疫金标记技术当这些标记物在相应的配体处大的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，这量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。
器皿及试剂的处理（二）玻璃器皿的清洁1.如果玻璃器皿内制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。
无色颜色微红、不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成，形成的颗粒大小不一，我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流或混浊不透明。
）浸10000ml2500ml，加蒸馏水至水冲洗干净，加入清洁液（重铬酸钾1000g,加入浓硫酸次，自来水冲洗掉洗洁剂，43～泡24h，自来水洗净清洁液，然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗通过此方法的处次，烤箱干燥后备用。
再用双蒸水把每个器皿洗3～4用蒸馏水洗3～4次，用同等大而直接制备胶体金。
也可用已经制备的胶体金溶液，理玻璃器皿不需要硅化处理，小颗粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后弃去，再用双蒸水洗净，即可使用，这样效果更好，因为减少了金颗粒的吸附作用。
几种胶体金技术详解
几种胶体金技术详解胶体金免疫分析技术详解随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。
前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。
这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。
它实际上属于快速斑点免疫结合分析，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA和斑点免疫层析分析DICA。
本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。
金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术，是于1971年建立的一种信号显示技术。
此技术最初用于免疫电镜检查，由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。
此后，此技术要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。
同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，故需时间较长。
故此技术做到了名副其实的POCT。
原理：将氯金酸（HAuCl4）用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒（胶体金），标记金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）或抗体，用于免疫印迹、免疫组织化学定位或快速免疫渗滤、免疫层析实验。
金标记免疫渗滤技术的原理同一般的免疫斑点试验，也是用已知抗原或抗体包被NC膜，再用金标记抗体或抗原来进行快速快速测定，阳性时斑点呈胶体金的红色。
改进之处为采用了渗滤装置，更加简便。
金标记免疫层析则是利用NC膜条状纤维的毛细管作用，使样品在涌动中与金标记物及包被在NC膜上的抗原或抗体结合，出现呈色的阳性信号。
胶体金的制备：在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界线十分清楚。
金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电的排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定的胶体，所以称其为胶体金。
简化免疫胶体金标记技术
包埋后免疫胶体金标记技术1.试剂固定液：0.1M二钾砷酸鈉缓冲液pH7.4（4%多聚甲醛+0.1%戊二醛+4%蔗糖）洗涤液：0.1M二钾砷酸鈉缓冲液pH7.4（4%蔗糖）醛基灭活液：0.1M二钾砷酸鈉缓冲液pH7.4（4%蔗糖+0.1M甘氨酸）脱水剂：甲醇（ddH2O稀释成30%，50%，70%，80%，90%，95%）包埋剂：K4M (2.7g交联剂A+17.3单体B+0.1g引发剂C)标记封闭液：0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4(1%BSA+0.05%TritonX-100+0.05%Tween 20) 标记洗涤液：0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4抗体稀释液：0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4(1%BSA+0.05%Tween 20)染色液：醋酸铀（3-4g醋酸双氧铀+100ml50%甲醇）；柠檬酸铅pH12（1.33g硝酸铅+1.76g柠檬酸鈉+30mlddH2O）2. 主要仪器：镍网（喷有方华膜和碳膜）、镊子、Parafilm、自制小环、冰箱（4℃至-35℃）、紫外聚合箱、培养皿、透射电镜、离子溅射仪、超薄切片机、恒温箱（28℃）0.2二钾砷酸鈉缓冲液母液pH7.4：0.4M 二钾砷酸鈉（21.4g二钾砷酸鈉/250mlddH2O）0.2M盐酸（4.5ml/250mlddH2O）50ml二钾砷酸鈉(0.4M)中加入8ml左右0.2M盐酸，调节pH至pH7.2-7.4,加入ddH2O 至终体积为100ml，即为0.2二甲砷酸鈉缓冲液母液pH7.42.5%戊二醛母液pH7.4：25%戊二醛10ml +0.2M二钾砷酸鈉缓冲液50ml，加入ddH2O至终体积为100ml，pH无需再调，现配现用4%多聚甲醛pH7.4：a.16%多聚甲醛25ml+0.2M二钾砷酸鈉缓冲液50ml，加入ddH2O至终体积为100ml，pH无需再调，现配现用b. 2g多聚甲醛粉末+40ml ddH2O,70℃加热至粉末完全溶解，加入1.07g二钾砷酸鈉，用0.2M盐酸调至pH7.4，加入ddH2O至终体积为50ml，现配现用0. 1M磷酸盐缓冲液pH7.4：NaH2PO4∙H2O1.8g+23.25gNa2HPO4∙7H2O+NaCl 5.0g.加入ddH2O至终体积为1000mlK4M：2.7g交联剂A+17..3单体B至离心管中，充入氮气以使其充分混合，在加入0.1g引发剂C，继续充入氮气至其完全溶解，配置好的K4M包埋剂-20℃保存3%醋酸铀：3-4g醋酸双氧铀至100ml浓度为50%的甲醇中，静置过夜，过滤后4℃避光保存1%柠檬酸铅：1.33g硝酸铅+1.76g柠檬酸鈉至30mlddH2O中，剧烈混匀，加入8ml1MNaOH至溶液变得澄清，加入ddH2O至终体积为50ml，最终pH12左右3. 步骤及方法3.1 取材与固定对于培养与分离的细胞，随用随取，取材时越快越好，动物组织取材的最理想的方法是经过组织灌流固定后再用锋利的刀片将其切成1mm3以下大小的组织块，投入到固定液中继续固定。
胶体金法各种方法法原理
双抗体夹心法原理以FABP 为例（检测抗原）阳性反应Y1=F14A （标记了胶体金）Y2=F104B （固定在NC 膜上即T 线）Y3=羊抗鼠IgG （固定在NC 膜上即C 线）此方法较常用，主要用于较大分子量的蛋白（抗原）的检测。
要求两株抗体针对一个抗原的不同位点才可以。
也有个别的检测项目是双抗原夹心检测抗体的，原理类似。
样品（血清）含FABP蛋金标记F14A 抗体金-F14A-FABP金-F14A-FABP-F14A金-F14A-羊抗鼠IgG金【1】-F14A-FABP 羊抗鼠IgG显示红色 显示红色金标记F14A 抗体不显色 显示红色金-F14A-羊抗鼠IgG阴性反应阳性反应竞争法原理以吗啡为例（检测抗原）阳性反应Y1=胶体金标记的吗啡单抗 Y2=吗啡-BSA 偶联物 Y3=羊抗鼠此方法主要用于小分子抗原（毒品、农药、肽链等）的检测。
由于抗原分子量小不能直接固定于NC 膜上，常常用化学方法把小分子偶联到BSA 等大分子物质上再固定于NC 膜上。
此结果与双抗原夹心法相反，阴性CT 两条都是红线，阳性只有C 线一条红线。
金-吗啡抗体-吗啡吗啡-BSA金标记吗啡抗体显示红色不显色金-吗啡抗体-吗啡 羊抗鼠样品（尿液）含吗显示红色显示红色 金标记吗啡抗体金-吗啡抗体-羊抗鼠阴性尿液抗体-吗阴性反应阳性反应间接法原理以HIV 为例（检测抗体）此方法主要用于血清中抗体检测，纯化或者重组的抗原固定于NC 膜上，标记多为蛋白A(ProteinA 或叫SPA ，抗体Fc 端结合而与其它蛋白质不结合)。
此方法要求胶体金过量，一般来说样品再加入前需要稀释或者加极少量后再加缓冲液。
斑点免疫渗滤法使用就是间接法。
显示红色 显示红色显示红色不显色。
胶体金（纳米金GoldNanoparticles）的制备步骤和注意事项
胶体⾦（纳⽶⾦GoldNanoparticles）的制备步骤和注意事项胶体⾦（纳⽶⾦Gold Nanoparticles）的详细制备步骤和注意事项胶体⾦的制备⼀般采⽤还原法，常⽤的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏⾎酸、⽩磷、硼氢化钠等。
下⾯介绍最常⽤的制备⽅法及注意事项。
１、玻璃容器的清洁：玻璃表⾯少量的污染会⼲扰胶体⾦颗粒的⽣成，⼀切玻璃容器应绝对清洁，⽤前经过酸洗、硅化。
硅化过程⼀般是将玻璃容器浸泡于５％⼆氯⼆甲硅烷的氯仿溶液中１分钟，室温⼲燥后蒸馏⽔冲洗，再⼲燥备⽤。
专⽤的清洁器⽫以第⼀次⽣成的胶体⾦稳定其表⾯，弃去后以双蒸馏⽔淋洗，可代替硅化处理。
２、试剂、⽔质和环境：氯⾦酸极易吸潮，对⾦属有强烈的腐蚀性，不能使⽤⾦属药匙，避免接触天平称盘。
其１％⽔溶液在４℃可稳定数⽉不变。
实验⽤⽔⼀般⽤双蒸馏⽔。
实验室中的尘粒要尽量减少，否则实验的结果将缺乏重复性。
⾦颗粒容易吸附于电极上使之堵塞，故不能⽤pH电极测定⾦溶液的pH值。
为了使溶液pH值不发⽣改变，应选⽤缓冲容量⾜够⼤的缓冲系统，⼀般采⽤柠檬酸磷酸盐(pH3～5.8)、Tris-HCL (pH5.8～8.3)和硼酸氢氧化钠(pH8.5～10.3)等缓冲系统。
但应注意不应使缓冲液浓度过⾼⽽使⾦溶胶⾃凝。
３、柠檬酸三钠还原法制备⾦溶胶：取0.01％氯⾦酸⽔溶液100ml 加热⾄沸，搅动下准确加⼊１％柠檬酸三钠⽔溶液0.7ml，⾦黄⾊的氯⾦酸⽔溶液在２分钟内变为紫红⾊，继续煮沸１５分钟，冷却后以蒸馏⽔恢复到原体积，如此制备的⾦溶胶其可见光区最⾼吸收峰在535nm，Ａ1cm/535=1.12。
⾦溶胶的光散射性与溶胶颗粒的⼤⼩密切相关，⼀旦颗粒⼤⼩发⽣变化，光散射也随之发⽣变异，产⽣⾁眼可见的显著的颜⾊变化，这就是⾦溶胶⽤于免疫沉淀或称免疫凝集试验的基础。
⾦溶胶颗粒的直径和制备时加⼊的柠檬酸三钠量是密切相关的，保持其他条件恒定，仅改变加⼊的柠檬酸三钠量，可制得不同颜⾊的⾦溶胶，也就是不同粒径的⾦溶胶，见附表。
胶体金技术总结Ⅱ
胶体金技术总结Ⅱ胶体金试剂条（卡）的制备1.胶体金标记物的制备包括以下步骤：标记前蛋白的处理，最佳标记pH值，蛋白最适标记浓度。
1.1 胶体金联接机制研究人员普遍接受的理论为：三种特异的氨基酸残基在金颗粒与蛋白质的联接作用中发挥着重要的作用。
而赖氨酸、色氨酸和半胱氨酸这三种氨基酸与胶体金联接的作用机理各不相同。
a.赖氨酸带有较强的正电荷，因而自然吸附带负电荷的金颗粒；b.色氨酸主要通过疏水相互作用与胶体金相联接；c.半胱氨酸通过SH-与金表面以共用电子的形式形成配位键。
抗体通过这几种作用力与胶体金颗粒牢固、稳定的、不易分离的结合在一起。
1.2 待标记蛋白质的处理：a.透析除盐蛋白质溶液内应除去多余的电解质，不然过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的Zeta电位，影响蛋白质的吸附，因此，标记之前必须彻底除盐。
一般将蛋白质置入透析袋中然后直接放入双蒸水或极低浓度的盐水（0.005mol/l NaCl , pH7.0）透析。
b.去除蛋白质中的沉淀长期低温保存的蛋白质或4℃较长时间保存的抗体，特别是在浓度高于2mg/ml 的情况下，很容易形成聚合物，聚合物对标记过程及免疫金探针的稳定性有一定影响，因此，标记之前须离心以除去这些聚合物。
1.3 最佳pH值的确定一般认为是由于pH值等于或稍偏碱于蛋白质等电点时（pH=PI+0.5pH），蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金颗粒的表面，由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态，如果低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，二者极易静电结合形成大的聚合物。
如果pH高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷相互排斥而不能互相结合。
需要提高胶体金的pH值时可用K2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用稀HCl。
【VIP专享】胶体金标记技术
胶体金标记技术胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。
由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记，使定位更加精确。
因此已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。
现已广泛应用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断试剂的制造等领域。
用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初，1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。
1971年，Taylor又将胶体金引入电镜免疫标记技术中。
近年来的研究表明，胶体金也可作为体外免疫加层试验的指示物。
由于胶体金作为标记物具有很多优点，因此自其问世以来，在国内外的许多研究领域中得到了迅速的发展。
近年来，它更多的被应用于免疫学和细胞学相关分子水平的检测中。
尤其随着人们物质生活的改善，有关人类健康的问题在现实生活中已显得非常突出。
从90年代至今的多篇报道都是关于动物体或人体相关抗体和病原体检测的。
制备方法在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界线十分清楚。
金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电的排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定的胶体，所以称其为胶体金。
胶体金的制作方法有白磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。
通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例（即增加或减少还原剂的量）可得到所需不同直径的金颗粒。
但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一，所以目前常用后两种方法，以柠檬酸三钠还原法为例，有两种方法。
1．Frens标准方法：1)取0.01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL。
2)约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色，大约再过70s，蓝色突然转变为亮红色，3)继续煮沸约5分钟后结束反应。
4)冷却后用0.1M K2CO3溶液调至所需PH值。
5)此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。
胶体金技术
胶体金技术问：检测cle ，金标记抗体扩大后，烘干后检测各项指标良好，但室温保存一天后，T 线下降很多是由什么原因造成的？室内开除湿机，组装好的板子，在自封袋里加干燥剂。
我烘干用了一整天，30 多个小时了，还有方法进行改进吗，这个抗体还能用来生产吗？经检测还是金子出了问题，我就是先少量做，找出各个值，然后才扩大的。
我就是先3ml ，再10ml 。
T ：（涛哥）那可能是生产放大过程控制的问题。
重新试验，先小试，逐步放大。
这就不行了啊，这还算不上生产扩大呢，怀疑误操作，重复试验试试，3ml 的、10ml 的都做一下。
0 是啊，有时标记完检测后，T 线就下降（比预实验）T :标记完检测就下降，说明你标记本身就有问题呗。
你标记条件太脆弱，主要考虑你标记条件，重新优化下。
0 如果我再调整pH 值，抗体浓度，灵敏度就会达不到了T：通过其他途径提高灵敏度。
问：请问为什么C 线包被3mg/ml 不出现条带，而2mg/ml 的就有条带出现呢？T：正常，从蛋白固定基本原理出发，好好想想。
NC 结合蛋白的能力是有限的，其结合位点是会饱和的，假设其结合能力仅仅为2mg ，你包被3mg ，那边必然有相当一部分是结合不牢固或者压根就没固定住的，样本层析之后，金标蛋白结合了这些不牢固的蛋白，就会流走，不会显色。
检测线，也会有同样的情况，不过检测线包被过量的影响不止这么简单。
我主要指夹心法。
0 一般调整膜上浓度时在湿法时调整还是干法时调整啊？问：标记好的胶体金有沉淀是什么原因？T：常见的原因：标记条件不合适，封闭物质不纯，复溶液不合适都有可能，当然颗粒大了，也容易沉淀。
0 你们主要用什么方法摸索最佳PH 值？1.用碳酸钾用量调整，搞一排，然后看变色和离心后现象，还有检测结果啊。
0 这样岂不是需要很多抗体？呵呵2.标记又用不了多少抗体，又不是包膜。
0 离心后现象，怎么样的是理想的？3.就是没有预期想要的略微蓬松有红色的沉淀，比如贴壁、黑点、离不干净等，离心速度时间也要选好。
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免疫金的特性胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组织化学技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。
用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，这类胶体金结合物常称为免疫金复合物，或简称免疫金（immunogold）。
胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚，一般认为是物理吸附性的。
胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷，与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。
因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。
来源：Gold 2免疫金的制备1．用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。
原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。
但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。
在调节胶体金的pH值时应注意，胶体金会阻塞pH计的电极，不可直接将电极插入胶体金溶液中，宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇（PEG，20000）稳定胶体金后，再调胶体金的pH 值。
2．将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，放置室温反应2～5min。
由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度，应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐。
3．加入浓度为0.2％的PEG或BSA以饱和游离的胶体金。
4．离心分离，去除上清液中未结合的蛋白质。
离心条件视胶体金颗粒的粒径而异：对5nm 金颗粒可选用40000r/min离心1h；8nm金颗粒用25000r/min离心45min；14nm金颗粒用25000r/min离心30min，40nm金颗粒用15000r/min离心30min。
5．轻吸上清液。
沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心。
如此洗涤2～4次。
以彻底除去未结合的蛋白质。
6．免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。
稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。
缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液。
多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG和BSA是最常用的稳定剂。
稳定剂有两大作用：一为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。
稳定剂的合理选择是十分重要的，不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。
免疫胶体金制备１、蛋白质的处理：由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。
必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。
一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。
２、蛋白质最适用量的选择：将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml(含蛋白质5～40ug)加到1ml 胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1 ml 10％NaCl 溶液，混匀后静置2小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10％即为最佳标记蛋白量。
３、标记：在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。
下述标记步骤最为常见：①用0.1mol/L K2CO3 或0.1mol/L HCl 调节金溶胶至所需pH(标记SPA时调到pH6.0)。
②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液（体积为2～3ml），搅拌2～3分钟。
③加入5ml 1％PEG20000 溶液。
④于10000～100000g 离心30～60 分钟（根据粒径大小选择不同离心条件），小心吸去上清液（切忌倾倒）。
⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/ml PEG20000 的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以Ａ1cm/540nm=1.5 左右为宜，以0.5mg/ml 叠氮钠防腐，置4℃保存。
⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200 柱进行凝胶层析分离纯化，以含0.1％B SA的缓冲溶液洗脱。
通常用IgG 包被的金溶胶洗脱液pH 为8.2，以A蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0。
以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。
胶体金标记蛋白质的纯化纯化的目的就是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金及在标记过程可能形成的各种聚合物。
其纯化方法有超速离心法、色谱柱法以及以上二者相结合应用。
（一）超迷离心法根据胶体金颗粒大小不同及蛋白质种类不同，离心的转速和时间也不同。
用牛血清白蛋白稳定的胶体金标记羊抗兔IgG,可先从低速离心（20nm颗粒用250g;5nm用4800g20min），弃去聚集的金颗粒所形成的沉淀，然后将上清液5nm金标记物用60000g于4℃离心1h,20nm和40nm 金标记物用14000g于4℃离心1h.小心地吸出上清，将管底沉淀再用1%牛血清白蛋白缓冲液混悬至原量，平衡过夜后，重复离心2次，最后一次洗涤离心的沉淀，再用1%牛血清白蛋白缓冲液（含0.02mol/LNaN3）稀释到l:20.40nm金颗粒在520nm检验吸光度为0.35;20nm金颗粒为0.30;5nm金颗粒为0.25,用1%牛血清白蛋白缓冲液作空白。
制备的胶体金-蛋白探针可保存于4℃，如加入50%甘油可贮于0℃以下（-18℃）1年以上。
以聚乙二醇稳定的葡萄球菌A蛋白标记胶体金，按胶体金制备方法及所得颗粒大小不同，用不同离心转速分离纯化，以白磷还原法制备的5.0nm胶体金A蛋白，用125000×g离心；抗坏血酸法制备的11.3nm胶体金-A蛋白，用150000g离心45min,可见离心管底部附贴有小片紧密的沉淀，其上为较疏松的红色沉积物，再上为透明的上清液。
附贴管底的沉淀无用，以后操作步骤中不要搅起来，仍保持其贴于管底。
弃去上清液后，用等体积的0.0lmol/LPBS （pH7.2）溶解疏松红色沉积物，同上重复离心1次，小心移去上清液，剩余0.5ml上清液，将疏松红色沉积物溶解后，即为初步提纯的金标-A蛋白试剂。
（二）凝胶过滤法凝胶过滤法必须以BSA为稳定剂。
将前述胶体金-蛋白质复合物装入透析袋内，置硅胶中浓缩至原体积1/10左右，用蒸馏水冲洗软化透析袋后，取出浓缩液，以15000r/min离心15min （或用上述离心法纯化后的胶体金，再进一步用此方法纯化）。
吸取上清液加到丙烯葡聚糖S-400（SephacrylS-400,Pharmacia公司产品，Sweden）色谱柱上分离纯化。
柱床高20cm,直径0.8cm,加样体积为柱床体积的1/10.用0.02mol/LTBS液（内含0.1%BSA,0.05mol/LNaN3,pH8.2者用于胶体金标记IgG,pH7.0者用于胶体金标记蛋白A）洗脱，流速为8ml/h,按红色深浅分管收集洗脱液。
可见先滤出的液体呈微黄色，有时略浊，内含大颗粒聚合物等杂质。
纯化的金标记蛋白滤出液随浓度增加而红色逐渐加深，清亮透明，此后为略呈黄色的未标记蛋白组分。
表中列出胶体金与蛋白质结合后，用离心法纯化的条件。
表6-8列出几种免疫金探针离心纯化的条件，仅供参考。
超迷离心转速与金颗粒直径的关系胶体金颗粒/nm pH 标记蛋白质离心力/g 时间/min5 9.0 羊抗人IgG 45000 4510 8.2 McAb 45000 3015 6.5 链霉亲和素120000 4520 6.0 SPA 120000 3010 9.0 羊抗兔IgG 120000 60来源：赵需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。
测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可. 蛋白与胶体金结合的最佳pH测定：取若干1.5ml的试管，分别加入1ml胶体金用K2CO3将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10；去96孔培养板，按pH从高到低分别将上述胶体金分别取100ul加入孔中，重复三次；每孔分别加入20ul浓度为10%的NaCl溶液，混合，室温下放置10min；观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH。
最小蛋白用量的确定：光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml），分别加入5ml胶体金中，迅速混匀，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，摇匀，静置5min后测各管。
根据胶体金颗粒的大小，OD在520～580nm之间测定，以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。
图5.2中10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为45μg/ml。
来源：胶体金标记的实验操作（1）蛋白质的处理：胶体金标记蛋白的制备胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。
如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。
除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。
1）待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1h，去除聚合物。
2）待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。
标记IgG时，调至9.0；标记McAb时,调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记SPA 时，调至5.9～6.2；标记ConA时，调至8.0；标记亲和素时，调至9～10。
由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。
由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。
必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。
一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。
（2）蛋白质最适用量的选择：胶体金与标记蛋白用量之比的确定1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。
2）将标记蛋白（以IgG为例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5µg/ml～50µg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。
对照管只加1ml稀释液。
3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。
4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。