实用胶体金标记技术
胶体金标记工艺
胶体金标记工艺胶体金标记工艺是一种常用于生物医学领域中的标记技术。
该技术利用纳米级的金颗粒作为标记物，通过将其附着在生物分子表面上，实现对分子生物学、细胞生物学等领域中的生物实体进行追踪和观察。
在医学领域中，胶体金标记工艺具有较高的生物相容性和生物学稳定性，并且该技术标记出的分子具有较明显的颜色，方便观察和分析。
胶体金标记工艺的步骤主要包括：制备胶体金溶液、表面修饰、选择适宜子和标记反应。
首先，需要制备胶体金溶液，一般采用还原金盐的方法制备，即在还原剂的作用下，将金盐还原成具有红色或蓝色色泽的胶体金颗粒。
其次，在得到的胶体金颗粒表面修饰，以增强这些颗粒的稳定性和生物相容性。
接着，通过选择适宜的生物分子，例如抗体、酶、 DNA 等，将其与表面修饰的胶体金颗粒结合，形成金标记化合物，标记出需要研究的生物实体，例如细胞、蛋白质等。
胶体金标记工艺具有一些优点，包括：①生物相容性优良，可以应用于生物体内；②标记物稳定性高，可以长时间保存；③信号强度高，可观察性好。
此外，该技术在应用上有很大的灵活性，可以选择不同大小、形状的胶体金颗粒和不同种类的生物分子，作为标记物进行应用。
然而，胶体金标记工艺也存在一些挑战，例如：①标记物数量难以准确控制；②标记物存在信号交叉的情况；③标记物在复杂生物环境下的作用机理尚不完全清楚。
此外，胶体金标记工艺的应用需要严格控制实验条件，以避免样本干扰和实验误差的影响。
综上所述，胶体金标记工艺是一种应用较广泛的标记技术，不仅在生物医学领域有着广泛的应用前景，也在其他领域，例如材料科学和化学分析等方面有所涉及。
然而，对于该技术进行应用时需要注意实验条件的控制，以便能够获得准确可靠的实验结果。
未来，随着生物技术的发展，胶体金标记工艺将会在更多领域得到应用和推广。
胶体金免疫标记技术
胶体金免疫标记技术胶体金免疫标记技术一、胶体金的制备一、胶体金的制备 根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm 的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm 范围内。
范围内。
在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。
水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。
使用不同种类、使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。
即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。
还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，因此产生的胶体金粒子数量越多，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。
但体积也越小。
但体积也越小。
粒子直径每增加一倍，数量减少为粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的1/8。
以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3～16nm 的胶体金。
因此一般胶体金探针均使用该方法进行。
但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。
聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。
此时在溶液中添加此时在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能够去除这些残基。
双标记或制备5-10 nm 的胶体金时建议使用该方法。
的胶体金时建议使用该方法。
利用柠檬酸为还原剂，可以制备12～150 nm 直径的胶体金。
但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。
因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16 12-16 nmnm 直径的胶体金。
金。
除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5 nm 的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。
磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，题，但所形成的金粒子体积变化较大。
磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法故该方法已经很少使用。
已经很少使用。
氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g 或1g ），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5 1.5 ml ml 试管分装为1 1 ml ml 保存（-20℃）。
胶体金标记技术
胶体金标记技术胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。
由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记，使定位更加精确。
因此已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。
现已广泛应用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断试剂的制造等领域。
用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初，1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。
1971年，Taylor又将胶体金引入电镜免疫标记技术中。
近年来的研究表明，胶体金也可作为体外免疫加层试验的指示物。
由于胶体金作为标记物具有很多优点，因此自其问世以来，在国内外的许多研究领域中得到了迅速的发展。
近年来，它更多的被应用于免疫学和细胞学相关分子水平的检测中。
尤其随着人们物质生活的改善，有关人类健康的问题在现实生活中已显得非常突出。
从90年代至今的多篇报道都是关于动物体或人体相关抗体和病原体检测的。
制备方法在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界线十分清楚。
金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电的排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定的胶体，所以称其为胶体金。
胶体金的制作方法有白磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。
通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例（即增加或减少还原剂的量）可得到所需不同直径的金颗粒。
但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一，所以目前常用后两种方法，以柠檬酸三钠还原法为例，有两种方法。
1．Frens标准方法：1)取0.01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL。
2)约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色，大约再过70s，蓝色突然转变为亮红色，3)继续煮沸约5分钟后结束反应。
4)冷却后用0.1M K2CO3溶液调至所需PH值。
5)此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。
胶体金标记探针与酶联免疫斑点技术
胶体金标记探针与酶联免疫斑点技术
胶体金标记探针和酶联免疫斑点技术（ELISA）是免疫学检测中最常用的技术，它可以用来检测抗原或抗体，是许多实验室检测中最重要的技术之一。
胶体金标记探针技术是一种核酸和蛋白质的检测技术，它可以用来快速检测抗原或抗体的存在。
它的原理是将一种特定的核酸或蛋白质（抗原或抗体）与金纳米粒子结合，得到一种特殊的标记探针，使用这种标记探针可以检测抗原或抗体的存在。
酶联免疫斑点技术（ELISA）是一种可以用来检测抗原或抗体的免疫学技术，它可以用来检测抗原或抗体的存在。
ELISA是一种高灵敏度的检测技术，它可以用来检测微量抗原或抗体的存在。
ELISA 的原理是将待测样品中的抗原或抗体与一种特定的抗原或抗体抗体结合，然后将一种特定的酶结合到抗原或抗体抗体上，最后通过观察酶活性的变化来检测抗原或抗体的存在。
总之，胶体金标记探针和酶联免疫斑点技术（ELISA）是实验室检测中最常用的技术之一，它们可以快速检测抗原或抗体的存在，是实验室检测中不可缺少的技术。
胶体金标记抗体技术实验原理
胶体金标记抗体技术实验原理胶体金标记抗体技术是一种常用的生物分析技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
本文将介绍胶体金标记抗体技术的实验原理。
胶体金是一种具有特殊光学性质的纳米材料，其颗粒大小约为5-100纳米。
在胶体金标记抗体技术中，将胶体金颗粒与抗体分子进行特异性结合，使抗体的检测变得更加灵敏和准确。
实验过程中，首先需要制备胶体金溶液。
一般采用氢氯酸还原法，将金盐溶液与还原剂混合后，通过调节pH值和温度等条件，使金离子还原生成金纳米颗粒。
随后，通过离心等方式将胶体金颗粒分离出来，并进行洗涤和稳定处理。
接下来，需要将抗体与胶体金颗粒进行结合。
这一步骤需要将抗体分子与胶体金表面的化学官能团进行共价结合或吸附结合。
共价结合一般采用交联剂如戊二醛等进行，而吸附结合则是通过静电作用或亲疏水性相互作用实现的。
结合完成后，可以对标记的抗体进行检测。
常用的方法包括光谱分析、电化学分析和显微镜观察等。
通过测定胶体金颗粒的表面等离子共振吸收峰位移、电流变化或颗粒颜色变化等参数，可以定量或定性地检测目标物质的存在与否。
胶体金标记抗体技术的原理基于胶体金颗粒特殊的光学性质。
胶体金颗粒在可见光波长范围内具有很高的吸收和散射能力，这是由于表面等离子共振现象的存在。
当胶体金颗粒与抗体结合后，抗体的特异性识别能力可以将胶体金颗粒引导到目标分子的位置。
这种结合可以通过光谱分析等方法进行定量或定性检测。
胶体金标记抗体技术具有许多优势。
首先，胶体金颗粒具有较高的物理化学稳定性和生物相容性，可以在生物样品中稳定存在。
其次，胶体金颗粒的表面容易与抗体等生物分子进行结合，使得标记过程简单方便。
此外，由于胶体金颗粒的尺寸可调控性较好，可以通过调节颗粒大小来实现信号放大效应，提高检测的灵敏度。
总结起来，胶体金标记抗体技术是一种重要的生物分析技术，其原理是利用胶体金颗粒的光学性质和抗体的特异性识别能力进行目标物质的检测。
通过合理设计实验方案和优化实验条件，可以实现高灵敏度、高选择性和低成本的生物分析。
胶体金技术——精选推荐
胶体金技术问：检测cle，金标记抗体扩大后，烘干后检测各项指标良好，但室温保存一天后，T线下降很多是由什么原因造成的？室内开除湿机，组装好的板子，在自封袋里加干燥剂。
我烘干用了一整天，30多个小时了，还有方法进行改进吗，这个抗体还能用来生产吗？经检测还是金子出了问题，我就是先少量做，找出各个值，然后才扩大的。
我就是先3ml，再10ml。
T：（涛哥）那可能是生产放大过程控制的问题。
重新试验，先小试，逐步放大。
这就不行了啊，这还算不上生产扩大呢，怀疑误操作，重复试验试试，3ml的、10ml的都做一下。
0 是啊，有时标记完检测后，T线就下降（比预实验）T：标记完检测就下降，说明你标记本身就有问题呗。
你标记条件太脆弱，主要考虑你标记条件，重新优化下。
0如果我再调整pH值，抗体浓度，灵敏度就会达不到了T：通过其他途径提高灵敏度。
问：请问为什么C线包被3mg/ml不出现条带，而2mg/ml的就有条带出现呢？T：正常，从蛋白固定基本原理出发，好好想想。
NC结合蛋白的能力是有限的，其结合位点是会饱和的，假设其结合能力仅仅为2mg，你包被3mg ，那边必然有相当一部分是结合不牢固或者压根就没固定住的，样本层析之后，金标蛋白结合了这些不牢固的蛋白，就会流走，不会显色。
检测线，也会有同样的情况，不过检测线包被过量的影响不止这么简单。
我主要指夹心法。
0一般调整膜上浓度时在湿法时调整还是干法时调整啊？问：标记好的胶体金有沉淀是什么原因？T：常见的原因：标记条件不合适，封闭物质不纯，复溶液不合适都有可能，当然颗粒大了，也容易沉淀。
0你们主要用什么方法摸索最佳PH值？1.用碳酸钾用量调整，搞一排，然后看变色和离心后现象，还有检测结果啊。
0这样岂不是需要很多抗体？呵呵2.标记又用不了多少抗体，又不是包膜。
0离心后现象，怎么样的是理想的？3.就是没有预期想要的略微蓬松有红色的沉淀，比如贴壁、黑点、离不干净等，离心速度时间也要选好。
胶体金标记抗体的方法
胶体金标记抗体的方法
论文题目：胶体金标记抗体的方法
一、背景介绍
胶体金标记抗体技术是一种用于识别特定的抗原分子的技术，经常用于实验，特别是免疫组织化学实验，因为它可以使实验处理变得非常容易和简单。
利用胶体金标记抗体技术，可以可靠的识别和定位细胞内外的抗原物质，由此可以定位抗原的生物功能。
改变标记抗体的发光属性，使得研究者可以使用它来测量抗原的广泛性和准确性，比如表观遗传的分布及活性等。
二、胶体金标记抗体的基本原理
胶体金标记抗体技术是将猪胰抗体固定到表面的胶体金粒子上，这些抗体除了能够和其特殊抗原结合之外，还可以结合各种抗原，使得它们可以同时具有多种抗原的识别能力，而不必更换抗体。
三、胶体金标记抗体的方法
1.准备胶体金标记抗体
首先需要准备好抗体，抗体需要具有较强的稳定性，能够长期稳定保存。
抗原物质可以通过血清或免疫实验中获得，此外，免疫实验也可以检测出异常表达抗原。
2.培养胶体金标记抗体
培养抗体需要使用胶体金粒子，这些粒子可以通过电离法制备。
制备好的胶体金粒子可以用来培养抗体。
培养抗体需要将抗体溶液稀释到一定浓度，然后将稀释好的抗体注射到胶体金粒子表面，使得抗
体结合到胶体金粒子表面上。
3.加入抗原
将抗原溶液加入胶体金标记抗体溶液，使抗体和抗原结合，产生特定的复合体。
4.检测抗原
完成抗原结合到胶体金标记抗体上之后，可以使用荧光显微镜或免疫荧光来检测结合的抗原，从而得到抗原的准确位置。
四、结论
胶体金标记抗体技术可以有效的识别不同抗原的位置，使得实验处理变得更加容易，并且效果也得到改善。
胶体金标记技术
⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。
通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2，以A蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0。
以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。
（4）胶体金标记蛋白的纯化1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。
用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心（20nm金胶粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min）20min，弃去凝聚的沉淀。
然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4℃离心1h；20nm～40nm胶体金结合物，14 000g，4℃离心1h。
仔细吸出上清，沉淀物用含1%BSA 的PB液（含0.02%NaN3），将沉淀重悬为原体积的1/10，4℃保存。
如在结合物内加50%甘油可贮存于-18℃保存一年以上。
为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10%～30%蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。
2）凝胶过滤法：此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。
将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1/5～1/10。
再经1 500r/min离心20min。
取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝胶S-400）层析柱分别纯化。
层析柱为0.8 cm×20cm，加样量为床体积的1/10，以0.02Mol/L PBS液洗脱（内含0.1%BSA，0.05%NaN3，pH8.2者用IgG标记物），流速为8ml/h。
按红色深浅分管收集洗脱液。
一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。
继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。
胶体金标记技术.ppt
胶体金标记技术
一、原理
胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏 血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗 粒（10、15、20、30、50nm），并由于静电作用成为一种稳 定的胶体状态，称为胶体金。
在适合的pH下，胶体金可与蛋白质分子的基团形成牢固 的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生 物特性。
➢ 胶体金免疫凝集试验。该试验具有试剂稳定、用量少、反 应快、结果易判定的特点。
➢ 胶体金免疫光镜染色。用标记有胶体金颗粒的抗体与组织 切片反应，在光学显微镜下观察胶体金颗粒结合部位，可 进行抗原定位分析。
➢ 胶体金免疫电镜染色。将病毒等抗原置于铜网上，加抗体 反应，再与SPA包被胶体金颗粒反应，在电镜下观察胶体 金结合部位，可用于抗原或抗体检测。
体效价水平。 如果T线无色带，则猪瘟抗体水平为0 如果T线颜色很深，则刚接种疫苗或野毒感染 如果Ab ≥24 ，则Ab水平较高 如果Ab < 24 ，则Ab水平偏低，不能抵抗猪瘟病毒感染
《动物检疫检验技术专业教学资源库》
胶体金标记技术 阳性 无效
阴性
无效
《动物检疫检验技术专业教学资源库》
胶体金标记技术
（2）将检测卡和检测样品恢复至室温后，再从铝箔袋中取 出，水平放置并做好标记。
（3）在检测卡的加样孔内加பைடு நூலகம்2-3滴待检学清，无气泡。 （4）静置20分钟，将观察窗内色带与比色卡色带滴度进行
对比，判断抗体效价水平。
《动物检疫检验技术专业教学资源库》
胶体金标记技术
3. 结果判定
（1）先观察C线，如果C线无色带，则检测卡无效，重新检测。 （2） C线有色带，再将T线的色带与比色卡色带比较，判断抗
胶体金技术及其应用
胶体金技术及其应用
针对胶态金技术及其应用做如下介绍：
一、什么是胶体金技术？
胶体金技术是一种布朗旋转微、纳米粒子，又称“金纳米粒子”，该颗
粒有着蓝色的外表，它具有超强的光学特性，如反射特定波长的光。
胶体金技术的优点是易于操作、成本低廉、制备简便、标记物强度高、分布精确、胶体悬浮稳定等。
二、胶体金技术的应用
1、生物医学检测
胶体金技术在生物医学检测方面有着广泛的应用，其用于标记生物样品，从而使得诊断检测获得更加准确、灵敏及快速的报告。
此外，胶
体金技术也可以用于表观遗传学研究，协助进行EXPRESS蛋白鳞片和蛋白质结构分析，构建蛋白质复合物，以及研究致病核苷酸突变的分
布状况。
2、生物传感
胶体金技术可以用于制备生物传感器，用于快速检测和鉴别各种物质、对象、分子组成及其变化，如探测水中有害污染物、感知信号蛋白；
检测和识别蛋白抗体，蛋白质，DNA破坏产物，抗原抗体反应，糖、
有机碳等。
3、化学分析
胶体金技术可以用于色谱分析，用于检测醇和醛，衍生类芳香胺，生
物碱，醋酸类，酯类，酰胺，羧甲基化合物等量的检测；甚至可以检
测DNA核苷酸序列，检测RNA外源小RNA物质，检测蛋白质等。
四、结论
胶体金技术是一种具有优异技术性能的传感技术，它的发展已经被应
用于医学检测、生物传感以及化学分析等功能，使得它成为传感器研
究领域的一个重要分支，发挥着非常重要的作用。
未来，研究人员将
会继续致力于不断改进和完善胶体金技术，以期获得更多的性能优势，进一步拓展该技术在其他领域的应用。
胶体金标记技术在免疫学中的应用
胶体金标记技术在免疫学中的应用胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的免疫组化法外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。
1．液相免疫测定：将胶体金与抗体结合，建立微量凝集试验检测相应的抗原，如间接血凝一样，用肉眼可直接观察到凝集颗粒。
利用免疫学反应时金颗粒凝聚导致颜色减退的原理，建立均相溶胶颗粒免疫测定法（Sol particle immunoassay ,SPIA）已成功地应用于PCG的检测，直接应用分光光度计进行定量分析。
2．金标记流式细胞术：胶体金可以明显改变红色激光的散射角，利用胶体金标记的羊抗鼠Ig抗体应用于流式细胞术，分析不同类型细胞的表面抗原，结果胶体金标记的细胞在波长632nm时，90度散射角可放大10倍以上，同时不影响细胞活性。
而且与荧光素共同标记，彼此互不干扰。
3．胶体金固相免疫测定法（1）斑点免疫金银染色法（Dot－IGS／IGSS）是将斑点ELISA与免疫胶体金结合起来的一种方法。
将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反应后，再滴加胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点，此称为斑点免疫金染色法（Dot－IGS）。
此反应可通过银显影液增强，即斑点金银染色法（Dot－IGS／IGSS）。
（2）斑点金免疫渗滤测定法（dot immuno－gold filtration assay, DIGFA）此法原理完全同斑点免疫金染色法，只是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。
在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。
此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。
胶体金方法
胶体金方法
胶体金方法，哇塞，这可真是个厉害的东西呢！
胶体金方法呢，简单来说就是利用胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。
它的步骤呀，首先要准备好所需的试剂和样本，然后进行样本处理，让样本中的待测物质充分暴露出来。
接下来就是关键的一步啦，将胶体金标记的抗体或抗原与处理后的样本进行反应。
这时候可一定要注意啦，反应的条件要严格控制，比如温度、时间这些都得把握好，不然结果可能就不准确啦！还有哦，操作过程中一定要小心谨慎，别把试剂弄洒了或者污染了。
在这个过程中，胶体金方法的安全性那是相当高的呀，不用担心会有什么危险的化学反应或者有害物质产生。
而且它的稳定性也很不错呢，只要按照要求保存试剂，一般都能保证结果的可靠。
胶体金方法的应用场景那可多了去啦！它可以用于医学诊断，比如检测传染病、肿瘤标志物等，是不是很厉害？它的优势也很明显呀，操作简单快捷，不需要复杂的仪器设备，结果也容易判断。
这就好比是我们生活中的一把钥匙，能轻松打开疾病诊断的大门呢！
我给你说个实际案例哈，在某次传染病爆发的时候，胶体金方法就大显身手啦！快速地对大量人群进行检测，及时发现了感染者，为防控工作提供了重要的支持。
你想想，如果没有胶体金方法，那得耽误多少时间和精力呀！这效果，简直太棒啦！
胶体金方法真的是个非常有用的技术呀，它就像我们的好帮手，在医学和其他领域都发挥着重要的作用，为我们的健康和生活保驾护航！我们应该好好利用它，让它为我们创造更多的价值！。
17.2-金免疫标记技术
一 洗 净 双 手
四
立 即 加 1 2 滴 缓 冲 液
操作
二 用 采 血 针 采 指 尖 血
样三 孔将 1 滴 指 尖 血 滴 入 加
？？结果
步骤5：15分钟读 取结果
？？结果
讨论分析
胶体金标记技术 (Immunogold labeling technique)
是以胶体金作为示 踪标记物，应用于 抗原抗体反应的一 种新型免疫标记技 术。
讨论分析
制备高质量胶体金的注意事项
（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃 器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双 馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活 化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。 （2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用 双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的 试剂经超滤或微孔滤膜（0.45µ m）过滤，以除去其中 的聚合物和其它可能混入的杂质。
讨论分析
2．鞣酸—枸橼酸钠还原法 A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。 B液：1％枸橼酸三钠4ml，1％鞣酸0.7ml，0.1Mol/L K2CO3液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。
将A液、B液分别加热至60℃，在电磁搅拌下迅速将 B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变 成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm。如需 要制备其它直径的金颗粒，则按表15-1所列的数字 调整鞣酸及K2CO3的用量
讨论分析
示踪剂：以胶体金为指示剂，本 身形成免疫分析过程后的颜色标记
符号显示结果
自带质控对照
快速：全部检测过程 仅需 3-20分钟。
简便、经济实用
可单份检测，稳定性好
免疫胶体金标技术
免疫胶体金标技术胶体金是由金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液，这种金颗粒呈红色，并能与蛋白质等大分子物质结合，因此，可用胶体金作为标记物来检测标本中的抗原或抗体。
典型的测定方法为斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等。
胶体金技术具有简便、快速等优点，目前已广泛应用于临床实验室诊断。
一、斑点免疫渗滤试验（dot immunogold filtration assay，DIFA）以双抗体夹心法检测尿液绒毛膜促性腺激素（HCG）为例。
预先在硝酸纤维素膜的中央滴加已知的纯化抗体，为膜所吸附。
当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中所含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等则滤出膜片。
其后加入的胶体金标记的抗体也在渗滤中与已结合在膜上的抗原结合。
因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央呈现红色斑点。
【材料】HCG金标反应板（已预先吸附已知抗HCG抗体）、抗HCG金标抗体、洗涤液、待测尿液等。
【方法】1．将反应板平放于实验台上，在小孔内滴加待测尿液1～2滴，待其完全渗入。
2．于小孔内滴加抗HCG金标抗体1～2滴，待其完全渗入。
3．在小孔内滴加2～3滴洗涤液，待其完全渗入。
4．判断结果。
【结果】在膜中央有清晰的淡红色或红色斑点显示为阳性反应，反之为阴性反应。
斑点成色的深浅相应地提示阳性强度。
二、斑点免疫层析试验（dot immunochromatographic assay，DICA）斑点免疫层析试验简称免疫层析试验（ICA），它也以硝酸纤维膜为载体，将多个试剂组合在一个约6mm×70mm的塑料板条上，成为单一试剂条（如图4-3），试剂条上端（A）和下端（B）分别为粘贴吸水材料，金标抗体干片粘贴在近下端（C）处，紧贴其上为硝酸纤维膜条。
硝酸纤维素膜条上有两个反应区域，测试区（T）包被有特异性抗体，参照区（R）包被有抗小鼠IgG。
测定时将试纸下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条移动。
【doc】胶体金标记抗体技术
【doc】胶体金标记抗体技术胶体金标记抗体技术《免痉学杂志》19曲年第5胶体金标记抗体技术任先平湖北省卫生防疫站武汉自1971年Faulk菩flJ首次报道胶体金作为标记钧应用于免疫组织化学研究以来, 胶体金标记技术在生物学和医学研究的各个领域内都迅速得到推广应用,成为把形态结构和功能代谢的研究紧密结合在一起的最重要的方法之一国外已有许多报道,近来也受到国内的重视.本文简要介绍该技术的原理,方法及其应用一一肢体盒标记抗体技术柏再曩和特意胶体金印金的水溶液,由氯化金涪液在还原剂作用下,使其金离子还原成金原子,从而聚台形成特定大小的金颗粒,困其中正负离子组成腔粒的双电层结构,而使溶胶处于稳定状态,故称胶体金a).腔体金颗粒通过表面的负电荷,能迅速面稳定地吸附带正电荷的高分子物质(如抗体分子,植镑凝集素和蛋白A等)而不破坏其生物活性.因此,利用胶体金的物理和生物学特性?首先标记上某些在光学显薇镜或电子显微镜下可见的标记物,然后将其作为探针去定位组织细胞内相应的抗原.此技术与每内外已广泛采用的免疫荧光法和免疫酶法相比较,具有下列优越性;染色步募简便,不需用有致癌性的显色底物, 可同时应用光学显微镜和电子显微镑,电镜下分辩率高,不影响原有超微结构的观察, 可进行多重免疫标记'敏感性均高于免疫荧光法和免疫酶法,是迄夸最敏感的免疫细胞化学方法.=,胺体盎的脚?方法国矫已有许多报道,大致可分为两类: 分散法与凝聚法(也称还原法).目前多采用后法制备金溶胶,现介绍如下方法; 1.白磷遗原,法gsigmondy1905年报道了此方法.具体过程是l取0.01HAu C1.水溶液100ml,用0.2MK:CO3调节pH 至7.2,加热煮沸,在刚开始沸腾时,迅速加入0.5mi自磷的饱和乙醚溶液,振摇混匀,至溶液呈现橙红色对即可此法制得的胶体金颗粒小,较均匀一致,直径为3n 岵右. 但自磷易燃易爆,配制时应十分小心(.). 2.抗坏血酸还原法Stathis1958年报道用此法制备的胶体金颗粒直径为8--13 tim将预冷至4?的1HAuC1'水溶液l m1,0.2MK:?j1.5rnl,双蒸水25mi混匀后, 搅拌下加入1mlO.7%抗坏血酸水溶液,溶液印呈紫红色,然后再加入双蒸水~100mI, 加热至溶液呈红色为止【5).3.构椽酸三钠还原法Frens1973年报道I取0.01%HAuCI.水溶液100mi加热至沸腾,迅速加入4mll拘橼酸三钠水溶液, 约5m{n后出现橙红色.肢体盒颗粒直径约 15nm.如将枸橼酸三钠的量分别减至1.5, 1.0或0.75ml,剐肢体金颗粒直径分别增至约3050或60rim.按此法适当变换枸橼酸兰钠加入量就可选择控静l金溶胶颗粒的大小?4.乙醇一超声波还原法Baigent等1980年提出此法t将1%HAnCI.水溶液0.1 ml加入50ml~蒸水中,以O.2MKlCOj 调节 pH至7.2,再加0.5m1乙醇,以20KC,125 W超声波探头侵入溶液振荡,制备的胶体金颗粒直径为6,10nm(.5.嘲氩化钠还琢法Trchopp等1982年报道l在预冷至4?的40mlgg蒸水中,加入 0.6ml1%HAuCl'水溶液及0.2MKlCO0.2ml,剧烈搅拌下,迅速加入新鲜配置的硼氢化钠水溶液(0.5g/mI),重复3,5欢加入,直至溶液颜色从兰紫色变为橙红色后不再改变为止.继续搅拌5rain,所得胶体宝颗粒直径为2,5nmc】.6.鞣酸,枸橼酸纳还原法自Slot 1985年报道以来,该法已作为最常用方法之一.其优点是可根据鞣酸加入量来改变生成胶体金颗粒的直径.具体方法:将1ml1 HAuCIl水溶液加入79m1双蒸水中混匀为A 液,另将4m1枸镩酸钠,一定量的l鞣酸和l{4鞣酸体积的0.1MK:CO{混合双蒸水至2O ml为B液,两液同时加温至60~C,搅拌下将B 掖迅速加入A液,继续加温搅拌至溶液呈亮红色.B掖中的鞣酸含量直接影响金颗粒的直径,当鞣酸含量从0.O1ml增至4m1时, 金颗粒的直径由15:1m 减至3.3?KCO的用量对金颗粒的大小影响不大.值得注意的是?所配试剂鞣酸溶液一定要避光保存;温Y;,否则均会影响胶体金颗度必须控制在60粒的大小和均一性").制备金溶胶过程中,玻璃器皿必须绝对干净,蒸馏水洗后作硅化处理.所有溶液都应用双蒸水配制,并用微孔滤膜(0.45m孔径)过滤,去掉水中的杂质,杂质污染有可能干扰肢体金的形成.又匿氯{艺金为一高度亲水性结晶化台物,故配制时宜将整安瓿内含量一次配成1的水搭液,配制的溶液置室温备用半年如出现少许絮状物,仍可使用".三,吱体金标记蛋白质如前所述,胶体金与蛋白质的结台是通过正负间的静电力所吸附,两者之间当达到范得瓦尔引力范髓内而形成牢固的结台,本结合是一种物理过程.因此,标记体系的pH, 离子浓度以及两者的比例均影响胶体金对蛋白质的吸附".1.标记体系的pH选择一般说来,当 pH值接近和稍硷于蛋白质的等电点时,胶体金蛋白质的吸附力最强.反之,当胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时,则会聚集丽失去结合能力.如在制备葡萄球菌A蛋白一金(PAG)复合物时,A蛋白的等电点是pH 5.1,因此,在标记时,胶体金的pH 值宜调至 5.8,6.1之间.但在制备抗体一胶体金复合物时,则难以满足各种蛋白质分子的等电点要求.最近有人建议在蛋白质与胶体结合时, 宜用最小的稳定量,从而保证在最佳pH值和离子强度时,每一蛋白质分子能有尽量多的点和胶体金颗粒界面接触(j'. 标记是否成功的另一重要因素是胶体金与被标记蛋白质的用量比饲.其原理与确定某种蛋白质保护金溶胶稳定性的金数相同,即胶体金颗粒的直径越小,颓粒所具有的总表面积就越大,加入的被标蛋白质量也应越大.为了保证能获得最佳标记率,故最好每次标记前都进行蛋白质的最小稳定量的测定,可参照Horisber~er[d的方法进行; 将待标记的蛋白质逐级稀释后,各取等体积按顺序加入一组装有等量胶体金的试管内, 并迅速混匀,使这些试管中的蛋白质含量逐管递增,一般为5~Lg--4Obtg.另设一管不加蛋白作对照.3,5rain后,再于每管加入1 mIlO%NBC1并迅速棍匀,放置5min一2h, 在580rim波长时测定其光密度.将各管的最大吸光值绘成益线,取益线中晟早与X轴渐进的一点,即为蛋白质能稳定胶体金的虽小量值,只有达到这个标记比,才能较好地保持标记物的稳定性(I".2.胶体金一蛋白质复台物的分离扼忆胶体金标记蛋白质后,必须进行纯化和浓缩,以去除未参与标记的过量的蛋白质,宋完全稳定的胶体金颗粒以及各种可能形成的聚合物.目前,有两种方法可用来纯化免疫胶体金试剂t(1)超速离心法离心的转速及耐问受肢体金颗粒大小以64及蛋白质的不同种类而异.如以牛血清蛋白的稳定的胶体金标记革抗兔IgG,先低速离心(20rim颗粒,用250g,5m用4800g) 20min,弃去聚集的胶体金颗粒的沉淀,然后取上清液以60000g(5nm)或14000g (20nm)在4?离心1h'弃去上清,将沉淀以原体积的0.02MPBSpH8.2(内含1 BSA)溶解,如上重复离心三次,最后将沉淀溶于原体积十分之一的上述PBS中,并含 0.05的叠氮钠,保存于4?备用.用不同方法制备的胶体金,根据颗粒大小需采用不同的离心力和离心时间,如以自磷还原法制备的5.9mn胶体一A蛋白,用 125000目抗坏血酸法制备的11.3rim胶体金一A蛋白用50000gJ枸橼酸钠还原法制备的15.5rim胶体金一A 蛋白用15000g离心 45mln.为了得到颗粒均匀一致的免疫胶体金试剂,可根据SlotC'所建议的用10~30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度离心,分带收集不同大小颗粒的胶体金标记蛋白制剂.此法不仅具有制备量大,操作简便和获得率高等优点,而且纯化的胶体金标记抗体颗粒直径均一性好"".(2)凝胶过滤法采用此法纯化胶体金标蛋白质,岿须选用牛血清白蛋白作为稳定剂.将胶体金一蛋白质复合物装入透析袋内,置硅胶中浓缩至原体积的十分之一左右.用蒸馏水冲洗软化透析袋后,取出浓缩以1500r/rain离C,15min.上清用丙烯葡聚塘S一40O柱层析,拄床高20 cm,直径0.8cm,加样体积为拄床体积的十分之一,以O.02MPBS浓(内含0.1%BSA及 0.05叠氮钠,pH8.2者用于胶体金标记 IgG,pH7.0者用于胶体金标记蛋白A)洗脱,流速为8ml/h,按颜色深浅分管收集流出液.首先流出的是较大颗粒的聚合物或一些杂质呈微黄色,中间流出清彻透明深红色区带就是纯化的金标蛋白,最后流出的略呈黄色的属未标记蛋白姐分.此方法用凝胶层析代替密度梯度超速离心来纯化胶体会标抗体,不仅降低成本,节省时间,且因胶体金颗粒无离心后的聚集倾向,提高了制剂的稳定性和染色质量.本法制备的胶体金标记抗体,颗粒大小均匀一致,直径可在3.5, 18nm间自由选定,因而可用于电镜的多重免疫标记,有很好的推广应用价值"".3.胶体金标记蛋白质的鉴定纯化的胶体金标蛋白质,主要鉴定其颜色,颗粒均匀程度,平均直径以及进行免疫标记的特异性和敏感性实验.胶体金颗粒的水溶液颜色与其直径的大小有关.颗粒越小,则其引起的散射光波长越短.胶体金在波长5l0,550nm之间出现最大吸光值峰,颗粒愈大,此峰愈向波长大的一端移动.其颜色从橘黄色变至紫红色, 甚至棕色,颗粒形状和大小如变异太大或出现聚沉则使吸光峰变宽.胶体金标蛋白质的颗粒直径可在透射电镜下测量,其方法是.用有支持膜的镍网 (普通铜网也可)沾取金标蛋白试剂,空气中自燃干燥后,在电镜下观察胶体金颗粒的大小及均匀度,计算100个颗粒的平均直径''cJ.】.胶体金标记抗体的特异性和敏感性测定,可用免疫细胞化学滤纸模型鉴定,其效率高且更为方便".4.胶体金标蛋白质的保存胶体金标蛋白质必须有少量电解质作稳定荆,但过量的电解质可能导致溶腔失去稳定性而很快凝结,故应去除多余的电解质.在活化后的胶体金中,加入一定量的聚乙二醇后无菌条件下,置4?可存放数月或一年以上".如在胶体金中加入0.01NaNs维持其生物活性达数年之久,如将其对45%甘油/磷酸盐缓冲液透析后,冰冻保存时间则可更长ll.四,应用胶体金标记技术主要是用来进行免疫组织化学和细胞化学方面的研究,即是把免疫学中抗原抗体反应的高度特异性,敏感性与组织化学中形态的可见性有机地结台起来, 从而可以在光镜及电镜下定性,定位乃至定量研究含有抗原物质的组织,细胞及亚细胞结构,把机能代谢研究与形态研究更紧密地结台起来.1.在光镜方面的应用GeeghKen(I"等巳用于定量测定人外周血液中B淋巴细胞的数量.也有人用胶体金溶胶中的金能催化还原银离子的原理,结合摄影显影技术,成功地用银显技术增强了金标抗体在光镜下的可见性,运用于临床病理诊断学中.徐玉会等于1986年成功地在光镜水平显示了小鼠肝组织内的FN和LN(1. 2.在电镜方面的应用Horisberger(和Nurden~.'用多标记法分别观察了人的红细胞和血小板表面各种凝集素的受体位置.Tanaka('用A蛋自一胶体金复合物标记观察了成人T淋巴细胞白血病相关抗原和成人T淋巴细胞白血病病毒抗原在Mt一2细胞表面的分布情况.夏诗茂等c2"利用此项技术在轮状病毒的形态发生学研究上,揭示TRY许多新的生物学特性, 对巨细胞病毒结构蛋白的定位研究中,进一步明确了CMV颗粒和致密体的膜结构具有同一的抗原性}并对流行性出血热病毒结构蛋白的定位和抗原特性进行了研究,均获得了较强想结果.杨萍等("应用免疫胶体金技术对神经胶质瘤抗原作超级结构定位,对肿瘤标本进行了免疫电镜的研究. 近来Fuliton在mRNA亚细胞定位研究中,把桉酸杂交技术与胶体金标记技术结台起来,应用巳获得一些进展.可以预想t 随着对此次技术和研究不断完善,将会在生物学,医学及遗传学上更为广泛的应用,从而取代酶免疫和同位素标记技术.参考文黛1FaulkWet址Immunochem1971;&l嘴l 2F诎Wct址,NatureNBi瞳1971;231:1011R(咖臣ct址HiBstXx~AcademicPT鞋 AmsterdanlNewO~or~l984 4HcMct址J盟qtod哪!977;2295SS蛐Fcct址JOlornlndl27=蠲06HMct址Histochem~l37 FrenQNatl~升1呱241:?&H姆M~dl197~,强253qct址耐?曲l哑36【4):472 10.T~hcVp工ctaLProc??/AcSdUSAl9s王79(23):747411.SlolJW,c【址Im扪氆?l9啦!5.383 12.Ml删曲Ex~tia19g,~38:l127 l玉馀玉会,等.腔体金免疫细胞化学技术讲义武汉学院l9g714.G.o时??wnd址J]Sstot:h~Q阳19722量llg715.岛眦JW,d址JOB_dl她l:9Q533 1&WangBaaled址Hi咖阳nl9数啦韶109 ld址CdlBiollmR印l她l;88918.SlotIW,etaLAcadPressA时darnYork,D~xt,1984nG印曲印?WI),et址Imm衄oIgCOIII~U1978;20.Nurde~AT,d址Expelientia19~0;36521,Hofi蝴MctatjM娜1979,,115.97 22TmakaHctaLom甜P,~erch1%电44=瑚j 23馀玉会,等.JT0.1M.duniv1987;7【4): ?2—2昕24豆寿菠,等.巾国学科学院19既9c1): 勋一5325n1orIA且cIaL跚19847矩工保乐.等.免疫学快报l985【5):37 丑杨萍,等.第州军大学1%瞬2):1?【收稿几期1嘲年S月20日)。
免疫电镜胶体金抗体标记
免疫电镜胶体金抗体标记
免疫电镜胶体金抗体标记，这可真是个神奇的技术啊！你知道吗，它就像是一把神奇的钥匙，能打开微观世界里那些隐藏的秘密大门。
胶体金颗粒，那小小的玩意儿，却有着大大的能量。
它就像是黑夜中的星星，在免疫电镜的领域里闪闪发光。
当抗体与胶体金结合后，哇塞，那简直就是如虎添翼！这就好比给战士配上了最锋利的宝剑，让它们能够更精准地去识别和标记目标。
在这个过程中，每一个步骤都至关重要。
从样本的处理，到抗体的选择，再到胶体金的标记，每一个环节都不能有丝毫马虎。
这可不是闹着玩的呀！就好像盖房子，根基不稳，房子怎么能牢固呢？
而且你想想看，通过免疫电镜胶体金抗体标记，我们能够看到那些平时肉眼根本无法察觉的微小结构和分子。
这难道不令人惊叹吗？这就好像我们突然拥有了一双能够穿透迷雾的眼睛，能看清一切隐藏的真相。
它在生物学、医学等领域的应用，那可真是广泛得很呢！帮助我们诊断疾病，了解生物过程，探索未知的领域。
这难道不是一件超级了不起的事情吗？它让我们对生命的奥秘有了更深入的理解，让我们能够更好地应对各种挑战。
免疫电镜胶体金抗体标记，它不是简单的技术，它是我们探索微观世界的有力工具，是我们解开生命谜题的重要线索。
它就像是一束光，照亮了我们前进的道路，让我们在科学的海洋中不断前行，不断发现新的奇迹。
难道我们不应该为这样伟大的技术而感到骄傲和自豪吗？它真的是太神奇，太重要了！我们要好好珍惜它，让它发挥出更大的作用，为人类的进步做出更大的贡献！。
胶体金法原理
胶体金法原理
胶体金法是一种常用的生物标记技术，通过在生物分子表面包裹金纳米颗粒来实现对生物分子的检测和定位。
其原理是利用金纳米颗粒的表面等离子共振效应和局域表面等离子共振效应，使得金纳米颗粒呈现出特定的光学性质，从而实现对生物分子的检测。
首先，金纳米颗粒具有很强的表面等离子共振效应，当金纳米颗粒的尺寸控制在10-100纳米之间时，会出现特定的吸收光谱峰。
这个吸收峰的位置和强度与金纳米颗粒的大小、形状、表面修饰以及周围介质的折射率等因素有关，因此可以通过调控这些因素来实现对金纳米颗粒光学性质的调控。
其次，金纳米颗粒还具有局域表面等离子共振效应，即当金纳米颗粒与生物分子表面相互作用时，会出现局域电磁场增强效应，使得金纳米颗粒周围的电磁场强度显著增强。
这种增强效应可以使得金纳米颗粒在特定波长下呈现出明显的荧光信号，从而实现对生物分子的检测和定位。
基于以上原理，胶体金法可以应用于生物分子的检测和定位。
例如，可以将金纳米颗粒修饰成特定的生物亲和分子，如抗体、核
酸等，通过它们与生物分子的特异性结合来实现对生物分子的检测。
同时，还可以利用金纳米颗粒的荧光性质来实现对生物分子的定位，通过观察金纳米颗粒的荧光信号来确定生物分子的位置和分布。
总之，胶体金法是一种基于金纳米颗粒的生物标记技术，利用
金纳米颗粒的表面等离子共振效应和局域表面等离子共振效应，实
现对生物分子的检测和定位。
通过对金纳米颗粒光学性质的调控和
对生物分子的特异性识别，可以实现对生物分子的高灵敏度和高特
异性的检测，具有广泛的应用前景。
胶体金生物素标记工艺
胶体金生物素标记工艺嘿，你有没有想过，在我们肉眼看不见的微观世界里，有一种超级酷的标记工艺正在发挥着巨大的作用呢？那就是胶体金生物素标记工艺。
我有个朋友叫小李，他就在一个生物实验室里工作。
有一天，我去他的实验室参观，就像走进了一个充满神秘和惊喜的微观宇宙。
他指着那些装着胶体金溶液的小瓶子对我说：“你可别小看这玩意儿，它可是我们标记生物分子的神器呢！”那胶体金到底是什么呢？胶体金啊，就像是微观世界里的小金子颗粒，它们非常非常小，小到你得用特殊的显微镜才能看清它们的模样。
这些小金颗粒分散在溶液里，就像一群调皮的小精灵在液体里游动。
而生物素呢，它是生物体内一种很重要的小分子。
就好比是一把独特的小钥匙，在生物反应的大锁里有着特殊的作用。
那把胶体金和生物素结合起来，就像是给这些小金颗粒穿上了一件带有特殊标记的衣服。
小李告诉我，这个标记工艺可不是随随便便就能完成的。
首先得准备好高质量的胶体金溶液。
这就像厨师做菜，得先准备好新鲜的食材一样。
如果胶体金的质量不好，那后面的标记就像是在摇摇欲坠的地基上盖房子，肯定是不行的。
然后就是生物素的处理。
这得小心翼翼的，就像对待易碎的珍宝。
他们要确保生物素的活性没有被破坏，不然的话，就像一把断了齿的钥匙，怎么能在生物反应这个锁里发挥作用呢？在标记的过程中，那简直就是一场微观世界里的精细舞蹈。
每一个步骤都得恰到好处。
把生物素连接到胶体金上，就像是给金颗粒和生物素牵红线，要让它们稳稳地结合在一起。
我好奇地问小李：“这是不是就像把两个小零件精准地组装起来呀？”小李笑着说：“差不多吧，不过这个组装可是在纳米级别的哦，比你能想象到的最精细的手工活儿还要精细无数倍。
”这个胶体金生物素标记工艺在生物检测方面有着巨大的用途。
比如说检测疾病。
想象一下，在我们的身体里，有一些病菌或者病变的细胞，它们就像隐藏在黑暗中的小怪兽。
而标记了生物素的胶体金就像是带着追踪器的小侦探。
一旦把带有标记的胶体金注入到身体里，它们就会凭借生物素和病变细胞或者病菌上特定分子的亲和力，像磁铁吸引铁屑一样，紧紧地黏附上去。
胶体金标记蛋白A技术(ProteinA-goldtechnique,PAg法)
0.05mo1／LTris 缓冲生理盐水：氯化钠 8.5-9g；0.5mo1／L，pH7.4Tris-Hcl 缓冲液 100m1；加双蒸水至 1000m1，调 pH 值至 7.4。
0.02mo1／LTris 缓冲生理盐水：氯化钠 8.5-9g； o.5mo1／L， pH7.4Tris-Hcl 缓冲液 40m1， 加双蒸水至 l000m1，调 pH 值至 8.2。
那本书被木子用得很小心。袁慕野毕业要走的时候，木子去买了一块德芙巧克
对中枢神经系统切片，有主张以 1%过碘酸钾代替 H2O2 的。
2、双蒸水洗 3 次，每次 10min，第 1，2 次 浮于液滴上清洗，第 3 次以盛双蒸水的注射器沿 镍网面冲洗，水流应有适当压力，但不宜过高强， 用滤纸在网缘将水吸干。(0.05mo1／LTBSpH7.4 洗 5min×3 次?)
后染色。其主要区别于一般胶体金免疫染色在：
须 1% 卵 白 蛋 白 － PBs 或 1% 卵 白 蛋 白 0.05mol/lTris 缓冲液来封闭非特异性的结合部 位，而不是采用羊或其它的动物的正常抗血清， 因为 PAg 复合物能够与正常血清组中的 Ig 结合， 从而给出假阳性结果；②在应用第一抗血清孵育 和 PBS 冲洗后作第二抗血清即 PAg 复合物孵育前 的准备时，应用的 PBS 或 TBS 的 pH 应变更为 pH8.2。其它可参照本节中包埋后染色法进行。
关键词：胶体蛋白标记胶体金标记蛋白 A 技 术 ProteinA-goldtechniquePAg 法胶体金 PAg 复 合物制备方法简便，作为第二抗体，无种属特异 性，可以免去不同种属动物要制备不同的特异性 免疫球蛋白。PAg 复合物与包埋剂和细胞成分都 极少发生非特异性的交互作用，蛋白 A 和金粒间 非共价的结合特性既不影响蛋白 A 的活性，又能 保持高度的稳定性，PAg 复合物分子最小易于穿 透组织。PAg 复合物的原液在 4℃可保存达一年 之久。电镜水平的 PAg 染色法 PAg 法在电镜技术 的应用原则是二步标记法，可用于包埋前和包埋
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胶体金标记的实验操作
（1）蛋白质的处理：胶体金标记蛋白的制备
胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。
如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。
除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。
1）待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1h，去除聚合物。
2）待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH 值。
标记IgG时，调至9.0；标记McAb时,调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记SPA时，调至5.9～6.2；标记ConA时，调至8.0；标记亲和素时，调至9～10。
由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。
由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。
必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。
一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。
（2）蛋白质最适用量的选择：
胶体金与标记蛋白用量之比的确定
1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。
2）将标记蛋白（以IgG为例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5µg/ml～50µg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。
对照管只加1ml稀释液。
3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。
4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。
以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10％～20％。
将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml(含蛋白质5～40ug)加到
1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1ml 10%NaCl溶液，混匀后静置2小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10%即为最佳标记蛋白量。
（3）标记：胶体金与蛋白质（IgG）的结合
将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。
常用稳定剂是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。
加入的量：5％BSA使溶液终浓度为1%；1%聚乙二醇加至总溶液的1/10。
在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。
下述标记步骤最为常见：
①用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH(标记SPA时调到pH6.0)。
②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液（体积为2～3ml），搅拌2～3分钟。
③加入5ml1%PEG20000溶液。
④于10000～100000g离心30～60分钟（根据粒径大小选择不同离心条件），小心吸去上清液（切忌倾倒）。
⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以A1cm/540nm=1.5左右为宜，以0.5mg/ml叠氮钠防腐，置4℃保存。
⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含
0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。
通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2，以A蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0。
以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。
（4）胶体金标记蛋白的纯化
1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。
用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心（20nm金胶粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min）20min，弃去凝聚的沉淀。
然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4℃离心1h；20nm～40nm胶体金结合物，14 000g，4℃离心1h。
仔细吸出上清，沉淀物用含1%BSA的PB液（含0.02%NaN3），将沉淀重悬为原体积的1/10，4℃保存。
如在结合物内加50%甘油可贮存于-18℃保存一年以上。
为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10%～30%蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。
2）凝胶过滤法：此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。
将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1/5～1/10。
再经1 500r/min 离心20min。
取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝胶S-400）层析柱分别纯化。
层析柱为0.8 cm×20cm，加样量为床体积的1/10，以0.02Mol/L PBS液洗脱（内含0.1%BSA，0.05%NaN3，pH8.2者用IgG标记物），流速为8ml/h。
按红色深浅分管收集洗脱液。
一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。
继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。
将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装,4℃保存。
最终可得到70%～80%的产量。
胶体金蛋白结合物的质量鉴定
（1）胶体金颗粒平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。
或用醋酸铀复染后观察。
计算100个金颗粒的平均直径。
（2）胶体金溶液的OD520nm值测定：胶体金颗粒在波长510nm～550nm之间出现最大吸收值峰。
用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1%BSA，0.02%NaN3）将胶体金蛋白试剂作1:20稀释，OD520＝0.25左右。
一般应用液的OD520应为0.2～0.4。
（3）金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法（MF－IGSSA）。
将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。