双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体

双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体

1.什么是双荧光素酶报告基因测试系统（DLR）

DLR测试系统灵敏，方便，在一个系统中用于测量两个单独的荧光素酶报告基因，萤火虫荧光素酶及海洋海肾荧光素酶(Renilla reniformis)，DLR测试系统可用于细胞裂解物及无细胞的翻译系统。

2.有哪些海肾荧光素酶载体

海肾荧光素酶载体pRL用于在转染的哺乳细胞中组成性地表达海肾荧光素酶。这类载体还有T7启动子，可用T7RNA聚合物在体外合成海肾荧光素酶，有4个不同的载体：

A pRL-SV40载体??? pRL-SV40载体含SV40增强子及早期启动子区域，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。pRL-SV40载体还含有SV40的复制起始区，可在表达SV40大T抗原的细胞中，如COS-1，COS-7细胞中，瞬时及附加体似地复制。

B pRL-CMV载体pRL-CMV载体含有CMV极早增强子及启动子，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。 a pRL-TK载体

pRL-TK载体含HSV胞嘧啶激酶启动子区域，在多种细胞中组成性地弱表达海肾荧光素酶。

b pRL-null载体

pRL-null载体缺真核启动子及增强子，在海肾荧光素酶基因的上游含有多克隆位点。

3.用双报告基因有何优点

一般地说，实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而另一个报告基因作为内对照，以提供实验报告基因测试的归一化。将实验报告基因的活力与内对照报告基因的活力作归一化可消除实验中不同测试间所固有的变化，这些变化减弱实验准确度，其中包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率。海肾荧光素酶可用作对照报告基因及实验报告基因。在双荧光素酶报告基因测试中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。

4.相比用CAT或β-半乳糖苷酶对表达数据作归一化，双荧光素酶报告基因测试系统有何优点

用双荧光素酶报告基因测试（DLR）有几个优点：

∙快速

∙DLR测试不需保温或对样品作预处理。用被动裂解液将共转染有萤火虫及海肾荧光素酶基因的细胞裂解，制备细胞抽提物。加入Stop&Glo试剂后，可同时湮灭萤火虫荧光素酶活力并激活海肾荧光

素酶发光，需立即测试海肾荧光素酶活性。在几秒钟内可完成荧光素酶测试实验并作定量测试。而其

他一些如CAT及β-gal的报告基因系统在定量前需要长时间的保温。

∙灵敏度

∙萤火虫及海肾荧光素酶的测试线性范围，是酶浓度的7个对数。其他报告基因的灵敏度及线性应答受限。通常不存在内源荧光素酶使背景活力低。

∙方便

∙在单管中完成测试，不需拆分样品，可用被动裂解液将培养在96孔板中的细胞快速裂解。

5.海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶相比的相对活性如何

在ATP，镁，及氧存在时，萤火虫荧光素酶作用于甲虫荧光素，而来源于海洋腔肠（Renilla reniformis）的荧光素酶在氧的存在下作用于海肾荧光素。

6.将两个报告基因载体作共转染应用什么条件

当用双荧光素酶报告基因测试系统来测量等重量的萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶时，可观察到它们释放的光几乎相等。萤火虫荧光素酶的分子量为61kD，而海肾荧光素酶的分子量为36kD，当测试等重量的两个酶时，所测的海肾荧光素酶分子实际多69%。如以每摩尔为基础，据实验确定，用双荧光素酶报告基因试剂测试的萤火虫荧光素酶的荧光强度比海肾荧光素酶强大约53%。

共转染质粒所含启动子间的反式效应有可能会影响到报告基因的表达。当对照或实验报告基因载体含有很强的启动子/增强子时，需要特别加以注意。载体pRL上的TK，SV40，CMV调节因子据报道可在大多数哺乳类细胞中表达，但它们在不同细胞中的表达水平不同。载体pRL-TK中HSV胞嘧啶激酶启动子相对较弱，使海肾荧光素酶的组成性表达成低到中度水平。早SV40极早CMV的增强子/启动子转录水平高，当实验载体所具有的调节因子较强时，这类启动子不太适用于双报告基因实验。

为使实验报告基因及对照报告基因的基因表达相对独立，每次实验时转染混和液中载体DNA的量及共转染报告基因载体的比例需作优化。可采用实验载体与共转染报告基因载体的组成比在10：1到50：1或更大的范围，这有利于抑制启动子间的交互作用。有时为有利于实验，共转染混和液中的实验载体应选择为少量部分。

7.需用荧光测试仪对双荧光素酶报告基因测试系统的荧光素酶作测定吗

作DLR测试时应使用荧光测试仪。液闪仪的灵敏度相比太低，不易获得可重复的结果。

8.作荧光素酶报告基因测试时，如何使用单或双加样的荧光测试仪

对于单加样的荧光测试仪，在管子中预先加入荧光素酶测试试剂II，再加入细胞裂解物并测萤火虫荧光素酶的活力，接下来，用荧光测试仪上的加样管加入Stop&Glo试剂，并测海肾荧光素酶的活力。

对于双加样的荧光测试仪，在管子中加入细胞裂解物后，放入荧光测试仪中，从加样管I中加入荧光素酶测试试剂II并测萤火虫荧光素酶的活力，从加样管II中加入Stop&Glo试剂，并测海肾荧光素酶的活力。

需对背景作预测试的荧光测试仪需关闭这一功能。

9.如何从荧光测试仪中清理Stop&Glo试剂

Stop&Glo试剂中的一个荧光素酶湮灭成份对塑料物质有一定的亲和力。这一组份对于自动加样管的塑料管及吸管的内壁有可逆结合。接触过Stop&Glo试剂的加样管如没充分清洗，会将残留的湮灭试剂遗漏到随后通过加样管的溶液中。如这样的情况发生，则非常少量的污染湮灭试剂就会极大地抑制萤火虫荧光素酶的活力。因此在使用萤火虫荧光素酶测试中，如要用自动法加样LARII，则需对已接触Stop&Glo试剂的加样管作充分的清洗。如荧光测试仪有两个加样管，则要将每个管子固定加样一种溶液。在完成一次实验后必须彻底清洗，请按下面的步骤清洗管子并维修仪器。

普通加样管清洗步骤：

1，用3倍于吸管箱体积的去离子水反复清洗加样管子以除去Stop&Glo试剂。

2，准备70%的乙醇作为清洗试剂，用5ml70%的乙醇将箱及加样管完全清洗，可将加样管浸泡在这一溶液30分钟后，再用去离子水清洗。