PCR HPVDNA荧光定量检测标准操作程序(整理).pptx
荧光定量PCR实验操作流程
荧光定量PCR实验操作流程1. 检查实验室条件在进行荧光定量PCR实验前，首先要检查实验室的环境是否适合实验。
实验室应该保持干燥、清洁和无菌。
检查PCR仪和读板器是否能正常运转，并准备所有必需的试剂和器械。
2. DNA/RNA的提取和纯化从组织和细胞中提取和纯化DNA/RNA是实验的第一步。
在提取和纯化DNA/RNA的过程中，需要保持无菌和正确的技术。
同时需要注意使用适当的缓冲液和酶切剂，以避免DNA/RNA的损伤和降解。
3. DNA/RNA质量检测检测DNA/RNA的质量和浓度，以确保实验结果的准确性。
可以使用紫外线光谱仪或其他质量检测设备。
同时，需要记录下每个样本的质量和浓度值。
4. 反转录如果需要检测RNA，需要首先进行反转录（Reverse Transcription，RT）。
反转录反应将RNA转录成相应的cDNA，可以使用逆转录酶和随机引物进行反转录反应。
5. 荧光定量PCR反应体系和引物设计荧光定量PCR反应体系包括模板DNA/RNA，荧光探针，引物和PCR反应缓冲液。
引物的设计是至关重要的，需要确保引物与目标序列的特异性和敏感性。
引物的设计可以使用NCBI或其他引物设计软件进行。
6. PCR反应设置PCR反应参数：温度梯度，反应时间和DNA量，浓度和样本装载量等。
注意反应器核心温度的控制，以确保反应的准确性和重复性。
7. 数据分析使用荧光定量PCR的结果进行数据分析。
可以使用数据分析软件，例如GenEx或其他软件。
计算出每个样本的阈值循环数（Ct值），并使用标准曲线法进行定量计算。
总之，荧光定量PCR是一种高灵敏度和高特异性的分子生物学检测技术，不仅可以用于基础研究，还可以用于临床诊断和治疗监测等领域。
在实验前需要认真准备，操作流程中需要注意无菌和正确的技术，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR仪操作流程资料
荧光定量PCR仪操作流程1、开启电脑，并打开Smart Cycler开关,启动Smart软件，系统用户名为Smart，密码为Cycler。
若Create Run 图标非灰色，表明机器已与电脑连接，否则应重新连接，直至Create Run 图标变亮。
2、定义一个程序⑴. 点击Define Protocols 图标。
⑵. 点击New Protocols 图标。
⑶. 输入一个独特的程序名。
⑷. 输入热循环参数。
⑸.点击Save Protocol按钮。
3、创建运行⑴. 点击Create Run 图标。
⑵. 输入一个Run Name。
⑶. 选择Dye Set。
⑷. 点击Add/Remove Site按钮⑷a. 突出一个程序名。
⑷b. 突出位点。
⑷c.点击右箭头。
⑷d.重复⑷a-⑷c步骤直到所有程序和点都被选定。
⑸.点击OK。
⑹.点击Start Run按钮。
4、实时监控反应过程（这一步可省）5、实验完毕，分析实验结果运行开始后，程序会自动切换到View Results栏。
在运行过程中，用户能实时监控温度和光学数据，选择图表，分析设置和样品类型信息。
在运行完成前后及运行期间，分析设置、图表和样品类型信息可以改变。
运行过程中，可以查看存在电脑中的以前的运行。
6、保存并输出实验数据⑴点击View Results显示栏的Export按钮。
⑵检查输出数据类型。
⑶点击Export Data根目录里的Export按钮。
⑷从Look In下拉菜单里选择一个文件夹。
程序默认为Smart Cycler文件夹里的Export文件夹。
⑸.输入一个文件名或接受一个默认的文件名，点击Save。
生物技术中心仪器管理人：李红兵2006年10月15日。
HPV-DNA标本处理的标准操作程序1
HPV-DNA标本处理的标准操作程序1一、目的：规范临床分子生物实验室对临床标本的处理，提高检测结果的准确率。
二、适用范围：人乳头状瘤病毒（HPV）基因微阵列分型检测试剂盒。
三、职责：由临床分子生物实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、程序：2.1对于宫颈脱落细胞标本，先振荡混匀临床样本10秒，取800l临床样本加入样本管，14000rpm离心5分钟，去上清液（若收集到的有效细胞太少的话，可再次吸取取800l临床样本加入样本管，14000rpm离心5分钟，去上清液）；2.2对于男性标本（棉拭子），先加入1ml生理盐水，充分振荡洗脱细胞，倒出洗脱液，14000rpm离心5分钟，去上清液；2.3对于血液太多的临床标本，可将收集到的细胞用已灭菌的蒸馏水漂洗一次，再离心收集细胞。
3、加入400l溶液Ⅰ(如果出现沉淀应在45℃水浴中预热)，将收集到的细胞振荡混匀，在100℃煮沸15分钟。
4、从沸水中取出样本管，点动离心，开盖，加入400l溶液Ⅱ，混匀后，室温下放置2分钟后，14000rpm离心5分钟，将上清液倒入废液缸，14000rpm离心1分钟，用200μl移液器，轻轻将剩余的上清液吸尽，枪头切勿碰到离心沉淀方向的管壁，以免将DNA吸掉。
5、开盖静置至少2分钟，加入60l溶液Ⅲ充分溶解，静置10分钟。
14000rpm离心1分钟取1l样品做PCR检测,或者贮存-20℃冰箱中备用。
lu08.1液转入HPV样本处理流程图此标准操作变更程序：如果本操作程序使用者在实际工作中发现其存在问题，则应向科室负责人提出，科室负责人则召集所有与本程序有关的的人员讨论，以决定是否需要变更本程序。
振荡取制定者吸审核者批准者年月日年月日年月日。
荧光定量PCR原理及操作步骤.课件
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荧光定量PCR的原理
• 在PCR反应过程中，随着DNA的扩增，荧光染料或荧光探针会 与新合成的DNA结合，产生荧光信号。荧光信号的积累与DNA 的扩增数量呈线性关系，通过荧光信号的实时监测，可以精确 地计算出起始模板的浓度。
荧光定量PCR的应用
• 荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、突变检测、病原体 检测和基因分型等领域。通过实时监测PCR反应进程，可以 精确定量目标基因的表达水平，检测基因突变，以及鉴定病 原体种类和基因型等。
实验结果解读注意事项
数据解读与处理
荧光定量PCR实验产生的数据需要进行解读和处理。实验人员应熟悉数据分析方 法，正确解读实验结果，避免因数据处理不当导致误判。
结果报告与交流
荧光定量PCR实验结果应按照相关规定进行报告和交流。实验人员应确保结果的 准确性和可靠性，避免因结果报告不准确导致误导或决策失误。同时，实验人员 还应与其他相关人员进行有效沟通，共同探讨实验结果和问题解决方案。
案例二：突变检测
总结词
荧光定量PCR是突变检测的有效手段，能够快速准确地检测DNA序列中的点突变、插入或缺失。
详细描述
针对目标基因的特定区域，设计包含突变信息的引物或探针，通过荧光定量PCR扩增后，利用熔解曲 线或高分辨率溶解分析等技术，判断是否存在突变。这种方法在遗传性疾病诊断、癌症研究等方面具 有重要应用。
解决方案3
对于引物二聚体问题，可以通过优化引物设计、 降低引物浓度等方法来解决。
建议3
在实验前对引物进行充分的评估和验证，避免使 用易形成二聚体的引物。
问题解决方案及建议
解决方案4
对于假阳性结果问题，可以通过 增加重复实验次数、设置阴性对 照等方法来避免。
荧光定量PCR操作流程
荧光定量PCR操作流程1.目的基因引物的合成设计合成200-300bp目的基因片段的引物，利用primer 5.0引物设计工具或者手工合成，引物合成过程中注意上下游的Tm值要相似、GC碱基在上下游的引物里均匀、引物与模板序列紧密互补、引物间避免形成稳定的二聚体或发夹结构等事项。
2 总RNA提取（1）准备研钵（灭菌）、离心管（1.5ML），枪头、手套（一次性）、异丙醇、乙醇，三氯甲烷2）取适量家蚕组织，加液氮充分研磨；匀浆加1ml RNAiso Plus后匀浆；3）室温放置5min （可在-70℃下保存1个月）4）加0.2ml氯仿（chloroform），振荡混匀，室温放置5分钟；5）12000g，15min，4℃；6）取上清（约0.6ml），加与上清等体积异丙醇，室温放置10分钟；7）12000g，10min，4℃；8）取沉淀（RNA呈胶状沉淀），加1ml 75%乙醇（可在-20℃保存1年）洗涤；9）12000g，5min，4℃；10）取沉淀，室温干燥10min；11）溶解于DEPC处理水中12）-80℃保存，尽快使用，或在8）保存。
3 反转录（TOYOBO试剂盒）Nuclease-free water up to 10ul5ⅹRT buffer 2ulRT Enzyme Mix 0.5ulPrimer Mix 0.5ulRNA 0.5-1ug4定量PCR反应（本实验室7300系统）SYBR 10ulForward Primer 1ulReverse Primer 1ulROXⅠ 0.4ulc DNA模板2ul一个模板重复三次以尽量减小误差；每个模板都要设内参。
内参是生物体或者细胞中稳定表达的基因，表达量几乎不变。
而后按照试剂盒说明操作流程设定仪器参数即可。
PPT荧光定量PCR(共31张PPT)
荧光
➢ Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针
荧光标记物的选择
绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本 的量，绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的 拷贝数或浓度
以不同稀释度的标准品为模板进行定量PCR并获得对应的CT，即可制作 标准曲线
25
y = -3.2461x + 26.443
20
R2 = 0.9976
15
E=103.2647%
10
5
0
0
2
4
6
8
以lg（CT）为纵坐标，lg（拷贝数）为横坐标，绘制标准曲线 扩增效率（E）= （10-1/斜率-1） × 100% 相关系数（R2）应大于0.99，越接近1越好 E应介于95%与105%，越接近100%越好
Ct值：每个反应管内的荧光信号达到荧光域值时所需的循环数。
✓ 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，
CT值越小
✓ 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可 从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数
非特异性荧光标记 ➢ SYBR Green I
❖ 引物质量尽可能避免自身及上下游错配、发卡 结构
❖ 跨越内含子设计引物
❖ Primer-BLAST确认引物的特异性，避免扩增出 1000 bp以下的非目的产物
方法
优点
缺点
适用范围
绝对定量
定量准确
工作量较大， 需额外绘制目 标基因的标准 曲线
所有
相对定量
HPV的检测及其临床应用PPT课件
环境 因素
宫颈 癌变
自身免 疫因素
第16页/共43页
HPV致宫颈癌机理
<30
>30
5--10years
HPV感染
持续HPV感染
免疫因素
细胞 分化异常CIN
高度 CIN
宫颈癌
辅助 — 致癌剂
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HPV E6癌蛋白与宫颈恶性病变的关系
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HPV E7癌蛋白的分子生物学特性
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宫颈癌的筛查
第33页/共43页
筛查对象
• 21岁以上有性生活史或具有性生活三年以上的任 何妇女。
• 高危人群：有多个性伴侣、性生活过早、HIV / HPV感染、机体免疫功能低下、卫生条件差/性保 健知识缺乏。
• 某些情况无需进行筛查，如因良性疾病摘除子宫 的妇女。
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HPV
乳头瘤病毒科属小DNA病毒
乳头瘤病毒的基因组主要编码三组 基因
三个癌基因，包括E5、E6和E7， 负责调节癌细胞转化过程；
两个调节基因，包括E1和E2， 负责调节转录和病毒基因组的 复制；
两个结构蛋白基因，包括L1和
L2，组成病毒颗粒
第1页/共43页
HPV感染
• 属于常见的性传播感染 • 直接的皮肤-皮肤接触是传播的最有效途径 • 病毒不通过血液或体液传播（例如精液）
• 2、连续2次HPV（-），细胞学检查（-） 可5～8年一次
• 3、高危人群：最好每年一次
（CIN及以上、特殊职业、30岁以上高危HPV感染者）
第36页/共43页
根据《中国癌症预防与控制规划纲要（2004-2010）》推荐，一般可以选择下面两种筛查方案。
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none(见表 1)
1
学海无 涯 ASJYK-LAB-C-P-53 第 2 页 ， 共 3 页
表 1: 设置四种荧光检测通道
Detector Name
Target
Reporter Dye
Quencher
FAM
12 种高危型 HPV FAM
none
(31, 33, 35,
39, 45, 51, 52,
以及一个空白对照)。转移到检测区，放入相应的荧光 PCR 检测仪内，记录样本
摆放顺序
3. PCR 扩增（在扩增区操作）
1. 打开稳压器电源，再打开计算机电源。
2. 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。
3. 设置四种荧光检测通道的报告荧光、淬灭荧光;Passive Reference 选择
2. 样本处理(在样本处理区进行)
1. 取宫颈脱落细胞样本 0. 5ml~1ml(如果细胞数量少可以加大体积到 2m1)
2.
13000 转/分钟离心 1 分钟
3. 弃上清，加入 0.5m1 细胞保存液重悬细胞
4.
13000 转/分钟离心 1 分钟，尽量弃干净上清
5. 每样本加入 50ul 细胞裂解液，充分振荡重悬细胞，煮沸 10 分钟。
5. 质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒 6. 标准操作： 1. 试剂准备（在试剂准备区操作） 1.将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻（临用前取出，用后立即放回冰箱， 反 复冻融不可超过三次），取出 PCR MIX,室温下避光解冻，上下颠倒混匀后，8000 转/分钟 10s 从试剂盒中取出 DVA 聚合酶，8000 转/分钟 lOs。 2.根据当次实验标本量，取出相应试剂（1 管=17.5ulPCR MIX +0.5ul DVA 聚 合酶）总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为 n (n=标本数+1 空白管对照+1 管阳性对照) 取 PCR 反应管转移至样本制备区。
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2. 适用范围： 1. 适用于进行高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的检验人员。 2. 适合仪器：LightCycler480 型核酸扩增荧光检测仪 3. 方法原理：采用 PCR 方法结合荧光探针的扩增技术 4. 样品要求：宫颈脱落细胞 3. 职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。 4.试剂来源：潮州凯普生物化学有限公司高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测试剂 盒。
Rate
Mode
(min:sec) (℃/sec)
Analysis Mode
1ห้องสมุดไป่ตู้
1
95
10:00min 20
None
None
95
2 45 60
15sec
20
None
None
60sec
Single Quantification
3
1
38
5sec
20
None
None
5. 检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。 6.将待反应的 PCR 反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在 程序中设定好样孔位置。 7. 按仪器操作规程开始循环。
2. 样本处理(在样本处理区进行)
1. 取宫颈脱落细胞样本 0. 5ml~1ml(如果细胞数量少可以加大体积到 2m1)
2.
13000 转/分钟离心 1 分钟
3. 弃上清，加入 0.5m1 细胞保存液重悬细胞
4.
13000 转/分钟离心 1 分钟，尽量弃干净上清
5. 每样本加入 50ul 细胞裂解液，充分振荡重悬细胞，煮沸 10 分钟。
5. 质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒 6. 标准操作： 1. 试剂准备（在试剂准备区操作） 1.将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻（临用前取出，用后立即放回冰箱， 反 复冻融不可超过三次），取出 PCR MIX,室温下避光解冻，上下颠倒混匀后，8000 转/分钟 10s 从试剂盒中取出 DVA 聚合酶，8000 转/分钟 lOs。 2.根据当次实验标本量，取出相应试剂（1 管=17.5ulPCR MIX +0.5ul DVA 聚 合酶）总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为 n (n=标本数+1 空白管对照+1 管阳性对照) 取 PCR 反应管转移至样本制备区。
荧光定量pcr检测步骤
荧光定量pcr检测步骤嘿，朋友们！今天咱就来唠唠荧光定量PCR 检测步骤这档子事儿。
你想想看啊，这就好比一场奇妙的旅程。
首先呢，咱得把要检测的样本准备好，这就像是给旅程准备行囊，可不能马虎呀！样本得纯净，不能有杂七杂八的东西捣乱。
然后呢，就是设计引物啦！这引物就像是旅程中的指南针，得特别精准，才能指引我们往正确的方向走。
设计得不好，那可就容易迷路啦，检测结果也会乱七八糟的。
接下来，就是配制反应体系啦！各种试剂就像旅途中的伙伴，得搭配好，让它们和谐共处，共同发挥作用。
这可不是随便倒倒就行的，得精确再精确。
再之后，把样本和反应体系混合好，放进PCR 仪里。
这PCR 仪啊，就像是旅程中的交通工具，带着我们的样本和反应体系一路前行。
在这个过程中，温度会不断变化，就像车子在不同的路况下行驶一样。
在 PCR 仪里跑了一段时间后，就到了检测荧光信号的时候啦！这荧光信号就像是旅途中的美景，我们得仔细观察，不能错过任何一个精彩瞬间。
嘿，你说这荧光定量 PCR 检测是不是很有意思？就像一次充满挑战和惊喜的冒险！每一步都得小心翼翼，却又充满期待。
要是哪一步出了差错，那可就前功尽弃啦！所以啊，做这个检测的时候，可得打起十二分的精神来。
就像你去旅行，总不能稀里糊涂的吧！得认真准备，认真对待每一个环节。
你想想，如果因为自己的不小心，导致检测结果不准确，那得多郁闷呀！这可关系到很多重要的事情呢，比如疾病的诊断、科学研究的进展。
哎呀，说了这么多，相信你对荧光定量 PCR 检测步骤也有了一定的了解啦！总之，认真对待，就像对待生活中的每一件重要事情一样，准没错！希望大家都能在这个奇妙的检测世界里顺利前行，得到准确又可靠的结果哟！。
荧光定量pcr操作流程
荧光定量pcr操作流程
荧光定量PCR技术是一种常用的实时PCR技术，可以检测DNA和RNA的含量。
它被广泛应用于病毒检测和转基因研究等。
本文将介绍荧光定量PCR技术的操作流程。
首先，在实验室中准备所需要的实验材料，包括样本，PCR引物，模板DNA，dNTP，DNA聚合酶和实时PCR荧光探针，缓冲液，水等。
其次，将样本进行DNase处理，解析得到模板DNA，将模板DNA 用合适的容量放入每个实验管中，以此来建立实验。
然后，将PCR反应液配制好，将与模板DNA一起放入PCR反应管中，包括PCR引物，dNTP，DNA聚合酶，实时PCR荧光探针，缓冲液，水等。
接下来，将放入PCR反应管中的反应液放入PCR设备里进行反应，PCR反应完毕分为一系列步骤，包括反应温度的上升，溶解和延迟，合成，放大等。
其中最重要的步骤是DNA聚合酶与模板DNA的结合，可加速DNA的复制。
最后，PCR反应完毕后，将反应管中的反应液进行荧光定量，将荧光的强度和弱度绘制成曲线，而反应体系中的DNA含量可以用曲线来测定，从而得出DNA的数量。
以上就是荧光定量PCR技术的操作流程。
它可以检测DNA和RNA 的含量，是实验室中常用的实时PCR技术。
它具有灵敏度高，操作简便，时间节约，可重复性好，可用于病毒检测和转基因研究等。
荧光定量pcr操作流程
荧光定量pcr操作流程荧光定量PCR操作流程。
荧光定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）是一种用于定量检测DNA或RNA的技术，通过测定PCR反应过程中的荧光信号来定量目标分子的含量。
本文将介绍荧光定量PCR的操作流程，希望能对相关研究工作者提供一些帮助。
1. 实验前准备。
在进行荧光定量PCR实验前，首先要准备好所需的试剂和设备。
包括PCR试剂盒、引物、模板DNA或RNA样品、荧光定量PCR仪等。
确保所有试剂和设备的质量良好，避免对实验结果产生影响。
2. 反应体系设计。
根据实验需要，设计好PCR反应体系，包括引物浓度、模板DNA或RNA浓度、试剂盒成分等。
合理的反应体系设计是保证实验成功的关键，需要根据目标分子的特性和实验要求进行合理的优化。
3. PCR反应条件设置。
根据所用的PCR试剂盒和目标分子的特性，设置好PCR反应的温度、时间和循环次数等条件。
合理的PCR反应条件能够提高PCR 反应的特异性和效率，减少非特异性产物的形成。
4. 荧光定量PCR仪操作。
将混合好的PCR反应体系加入到荧光定量PCR仪中，按照仪器操作手册设置好检测参数，并启动荧光定量PCR仪进行检测。
在检测过程中，要及时观察荧光信号的变化，并根据实验要求进行数据记录和分析。
5. 数据分析与结果解读。
根据荧光定量PCR仪输出的数据，进行数据分析和结果解读。
通过标准曲线法或绝对定量法，计算出目标分子的含量，并进行结果的统计和图表展示。
同时，对实验结果进行科学的解读和讨论，得出合理的结论。
6. 实验后清理。
实验结束后，要对实验台面和仪器进行清理，保持实验环境的整洁。
同时，对实验数据进行归档和整理，做好实验记录和报告。
以上就是荧光定量PCR的操作流程，希望能为相关研究工作者提供一些参考和帮助。
在进行实验时，一定要严格按照操作流程进行，确保实验结果的准确性和可靠性。
祝实验顺利！。
荧光定量PCR原理及操作步骤ppt课件
11
SYBR Green I 应用范围
• 起始模板浓度定量
• 融解曲线分析
– ---可区分单一产物、变异产物、多种产物和（ 或）引物二聚体
• 基因型分析
可编辑课件
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SYBR Green I 优点
SYBR Green I 缺点
可编辑课件
13
可编辑课件
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PCR程序指南
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UNG酶使用原理
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16
金牌Tag酶活性
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参比荧光：管家荧光ROX
可编辑课件
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ROX例
可编辑课件
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PCR曲线
可编辑课件
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标准曲线
可编辑课件
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• Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号 开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对 应的循环次数。
可编辑课件
5
定量原理
确定初始模板的浓度
初始 DNA量越多, 荧光 达到某一值（域值）时 所需要的循环数越少
Log浓度与循环数呈线 性关系，根据样品扩增 达到域值的循环数就可 计算出样品中所含的模 板量
TAGCCGTAGCATTA
G C
G C
A T
T A
GCGCA T
GT
C
AG
CA
C
变性: 无荧光信号
A CGACT A G G A T G GT A C A G T C G TG T GCTGA T C C T A C C A T GT C A G CA C
未结合SYBR Green 1 dye
HPV DNA检测标准操作程序
入空白对照、阳性质控、阳性DNA对照，建议加样编号顺序如下：首先依次是不同的样本编号，最后为阳性质控、阳性DNA对照、与空白对照管（蒸馏水）。
6.2.3 从冰箱中取出PCR试剂盒，将PCR Premix融化后，与Taq酶管一起放入离心机中点动离心。
6.2.4 将试剂放入生物安全柜内，将已点动离心了的PCR premix管、Taq酶管插在冰块上保持在低温条件下。
6.1.6 按照反应数计算所需的PCR各个组份的数量来准备PCR Mastermix（可参照PCR MIX与酶混合比例如下表）。
6.2.7 在生物安全柜内，按已计算好的PCR premix用量，从冰中取出相应的PCR premix管吸取准确量后加入对应的1.5ml离心管中，将PCR premix管放回冰块中。
6.2.8 垂直将枪头小心打入废液缸中，确保移液枪前臂没有碰到废液缸口。
6.2.9 从冰中取出Taq酶管，按计算好的用量（可参照PCR MIX与酶混合比例附表），吸取准确量后分别加入对应的1.5ml离心管中。
6.2.10 盖紧1.5ml离心管盖，同时将PCR premix管及Taq酶管从超净台中取出放回-20℃冰箱的原包装中，标注已使用数量。
6.2.11 将已加入PCR premix和Taq酶的1.5ml离心管在涡旋器上振荡5sec，放入离心机点动离心。
6.2.12 在生物安全柜中，将6种PCR混合液分装入对应的0.2ml PCR扩增管中，每管加入混合液18ul，加完后将所有PCR管盖盖上。
6.3 DNA提取6.3.1将临床样本及阴性对照品置室温下解冻，把标本编号，取出相应数量的样本管，对应编号。
6.3.2 将临床样本振荡混匀，伸入采集管底部吸取临床样本0.8ml 至管底，。
荧光定量PCR实验设计及优化PPT课件
3
第3页/共32页
PCR引物与探针
• SNP的Taqman双色检测中，突变探针一般Fam标记 • 相对定量分析中内参基因一般Hex标记
(例如Roche的UPL相对定量解决方案) • 对检测要求更高的建议Fam标记(灵敏度或者 定量 vs 定性)
扩增效率较差的建议Fam标记
4
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Reaction Conditions
14
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PCR的建立与优化
PCR试剂体系
引物、探针的设计
核酸纯化与逆转录
15
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细胞中RNA的种类和含量
不同丰度 高丰度
中丰度
低丰度 高丰度
组织名称 肝脏 脾脏 心脏 大脑 胚胎 肾脏 肺 膀胱 骨 脂肪
成纤细胞 人白细胞
样品量 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 105 105
Primers and Probes
Concentration Range (final con.)
• Primers: 0.1 µM – 1.0 µM each
• Probes: µM
0.1 µM – 0.5
Standard Concentrations (final conc.)
Example: Universal ProbeLibrary assay
• Transcriptor reverse transcriptase
carrier NA (10 ng/µl), e.g. MS2 RNA
9
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Basic Optimization:
MgCl2 Titration
HPV荧光PCR
人乳头状瘤病毒（HPV）实时荧光定量PCR 培训大纲一、实时荧光定量PCR技术所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出。
与常规PCR相比，它具有特异性更强，有效解决PCR产物污染、自动化程度高，同时能对起始模板进行准确定量等特点。
该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。
这是DNA定量技术的一次飞跃。
1、实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
实时荧光定量PCR 反应是在常规PCR的一对引物之外，加入一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针。
在探针完好的状态下，5′端报告荧光基团的激发光被3′端的淬灭荧光基团所抑制。
PCR反应过程中，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合位置，发挥它的5′→3′外切核酸酶活性，将荧光探针切断，释放出报告荧光基团的荧光信号，每合成一个模板，一个报告基团的信号释放，被释放的激离报告荧光基团的数目和PCR产物是一对一的关系。
通过定量PCR仪定时动态监测每一循环，可以得到样品实际扩增曲线，找到PCR扩增的对数期。
软件通过标准品的待测品的对数期比较，得到每一样品模板DNA的起始拷贝数。
1.1 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念—— Ct值。
C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。
图1. Ct值的确定1.2. 荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SD cycle 6-151.3. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。
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2. 样本处理(在样本处理区进行)
1. 取宫颈脱落细胞样本 0. 5ml~1ml(如果细胞数量少可以加大体积到 2m1)
2.
13000 转/分钟离心 1 分钟
3. 弃上清，加入 0.5m1 细胞保存液重悬细胞
4.
13000 转/分钟离心 1 分钟，尽量弃干净上清
5. 每样本加入 50ul 细胞裂解液，充分振荡重悬细胞，煮沸 10 分钟。
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单位及实验室名称
项
目
编号：ASJYK-LAB-C-P-53
检验科
HPV-DNA 扩 增 荧 光 定量检测标准操作 程序
日期：XXXX 年 6 月 21 日 版本：第一版，第 1 次修订
第 1 页，共 3 页
1.目的：明确高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确 进行巨细胞病毒核酸定量的检测。
6.
13000 转/分钟离心 10 分钟，保留上清备用(上清中为释放的 DNA)。
7. 取上清 2.0ul 作为 PCR 扩增的模板，其余保存于一 20℃
8.在对应的 PCR 反应管中分别加入 2ul 处理好的样本 DVA,空白对照、阳性对 照
，盖
紧管盖，稍做离心(反应总体积为 2o u 1/人份，每次反应需要设置一个阳性对照
3
56, 58, 59
66，68)
HEM
HPV16
HEX/JOE
none
ROX
HPV18
ROX/Red 610
none
Cy5
β-globin
Cy5
none
6.3.4 将循环条件设定为
Incubation Temperature
Program Cycles Temperature (℃) Time
Transition Acquisiton
ASJYK-LAB-C-P-52 第 3 页 ， 共 3 页 8. 扩增结束后取出 PCR 反应管，关闭扩增仪电源，反应管直接放入焚烧垃圾 桶内。 9. 分析数据，在 Analysis Notes 窗口中注明检测基线值、试剂批号、阳参批号
2
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等相关信息，进行结果分析。 6.3.10 关闭计算机。 4. 检验结果判断： 1.基线，阂值的设定:基线的确定为:取 3-15 个循环的荧光信号:阈值设定: 使 阈值线超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且 Ct 值为 Under 2. 质控对照 1 阴性对照 Ct 值均应显示为 Undet 2 阳性对照 Ct 值≤36 3内对照β-globin 在 Cy5 通道 Ct 值≤40 符合以上三个条件，此反应是为有效 6.4.3 结果判断 1 样本在 FAM、HEX、ROX 通道 Ct 值显示为 Undet，内对照β-globin 在 Cy5 通道 Ct 值≤40,判断为阴性 2 样本在 FAM、HEX、ROX 通道 Ct 值≤40, 内对照β-globin 在 Cy5 通道 Ct 值≤ 40 判断为阳性 3 若样本在 FAM、HEX、ROX 通道 40<Ct 值<45 的样本建议重做，重做结果 Ct 值<40 者为阳性，否则为阴性 7. 支持性文件： 1.《高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒(PCR 一荧光探针法)》说明书（潮 州凯普生物化学有限公司） 2. 检测结果报告程序。 3. LightCycler480 型核酸扩增荧光检测仪说明书 8.此标准操作变更程序：如果本操作程序使用者在实际工作中发现其存在问题， 则应向科室负责人提出，科室负责人则召集所有与本程序有关的人员讨论，以决 定是否需要变更本程序
Rate
Mode
(min:sec) (℃/sec)
Analysis Mode
1
1
95
10:00min 20
None
None
95
2 45 60
15sec
20
None
பைடு நூலகம்
None
60sec
Single Quantification
3
1
38
5sec
20
None
None
5. 检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。 6.将待反应的 PCR 反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在 程序中设定好样孔位置。 7. 按仪器操作规程开始循环。
2. 适用范围： 1. 适用于进行高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的检验人员。 2. 适合仪器：LightCycler480 型核酸扩增荧光检测仪 3. 方法原理：采用 PCR 方法结合荧光探针的扩增技术 4. 样品要求：宫颈脱落细胞 3. 职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。 4.试剂来源：潮州凯普生物化学有限公司高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测试剂 盒。
5. 质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒 6. 标准操作： 1. 试剂准备（在试剂准备区操作） 1.将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻（临用前取出，用后立即放回冰箱， 反 复冻融不可超过三次），取出 PCR MIX,室温下避光解冻，上下颠倒混匀后，8000 转/分钟 10s 从试剂盒中取出 DVA 聚合酶，8000 转/分钟 lOs。 2.根据当次实验标本量，取出相应试剂（1 管=17.5ulPCR MIX +0.5ul DVA 聚 合酶）总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为 n (n=标本数+1 空白管对照+1 管阳性对照) 取 PCR 反应管转移至样本制备区。
none(见表 1)
1
学海无 涯 ASJYK-LAB-C-P-53 第 2 页 ， 共 3 页
表 1: 设置四种荧光检测通道
Detector Name
Target
Reporter Dye
Quencher
FAM
12 种高危型 HPV FAM
none
(31, 33, 35,
39, 45, 51, 52,
以及一个空白对照)。转移到检测区，放入相应的荧光 PCR 检测仪内，记录样本
摆放顺序
3. PCR 扩增（在扩增区操作）
1. 打开稳压器电源，再打开计算机电源。
2. 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。
3. 设置四种荧光检测通道的报告荧光、淬灭荧光;Passive Reference 选择