菠萝蛋白酶的提取、初级纯化及活性鉴定

（3）5%TCA（三氯乙酸）：200ml。
3、透析袋处理 • 将10 cm长的透析袋置于1000ml含1mmol/L EDTA-Na2的2%碳酸氢钠溶液中煮沸10min后，用 干净镊子取出，经蒸馏水煮沸、漂洗，即可使用。
四.实验步骤
1、粗酶提取 生菠萝皮（每一组） 30g+50ml PBS 0.1 mol/L pH7.8 ↓ 电动搅拌 ↓ 2～4层纱布过滤于烧杯中 ↓ 分装于离心管（10ml/管） ↓
实验一
菠萝蛋白酶的提取、初级纯化 及活性鉴定
一、实验目的
• 系统地学习和掌握生命大分子物质分离纯化技 术的原理及基本实验技术。 • 熟练掌握饱和硫酸铵沉淀法、透析法、测定蛋 白质含量、蛋白酶活性检测等实验技术。
二、实验原理
1、生命大分子物质分离纯化的一般程序：
（1）选择有效成分含量丰富、稳定性好的样品材料。 （2）材料处理。 （3）确定分离纯化的方法，使粗品的纯度达到预定要求。 （4）建立灵敏、特异、精确的检测手段。
(二)层析 主要有：离子交换层析，凝胶过滤，亲和层析
透析和超滤
• 透析是将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里， 扎紧袋口放在缓冲液中进行的。 •超滤是利用压力和离心力，借助于超滤膜将不同分子量 的物质分离的技术。
3、菠萝蛋白酶活性测定
酪蛋白
ห้องสมุดไป่ตู้菠萝蛋白酶
酪氨酸 （275nm）
三．实验试剂
1、缓冲液 （1） PBS 0.1moL/L 3000ml pH7.8 （2） PBS 0.01 mol/L 4000ml pH7.8
37℃ 10min 水浴
酶活单位：在上述条件下(37℃,酶促反应10min)，每 10min增加0.01个光吸收值的酶量为一个酶活力单位 （U）。
3、透析去盐
•把测酶活后所剩的酶蛋白吸到透析袋中,系紧,置于PBS 0.01 mol/L pH7.8的3000ml的烧杯中,置于磁力搅拌机上, 进行透析；或静止透析1～2天，间中要换缓冲液3次。
2、测酶活试剂 （1）1%酪蛋白（pI4.8）：200ml。
用0.1 mol/L PBS pH7.8配，50-55℃水浴溶解，不停搅 拌，需1h才能溶解。 2g酪蛋白+200ml PBS（0.1 mol/L pH7.8）。
（2）激活剂 100ml（现配现用）
20 mmol/L半胱氨酸-盐酸盐，1 mmol/L EDTA-Na，用 0.1 mol/L pH7.8 PBS配制至100ml。
2、蛋白质的分离纯化方法：
(一)沉淀法 • 盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚 乙二醇（PEG）沉淀法等。
• 在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升 高，这种现象称为盐溶。 • 但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降， 直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析。
•一般进行蛋白质沉淀时，选用的盐是硫酸铵。 优点： ①溶解度大，对温度不敏感； ②分级效果好； ③有稳定蛋白质结构的作用； ④价格低廉。 缺点：盐浓度含量高。
平衡离心 10000r/10min ↓ 弃沉淀，取上清液，量体积倒入小烧杯 ↓ 加固体（NH4）2SO4盐析，0～30%饱和度，缓慢加入， 边加边搅拌至完全溶解，倒入离心管 ↓ 4℃，1～2h ↓ 平衡离心，10000r/10min ↓ 取沉淀，再加5～8ml PBS 0.1 mol/L pH7.8溶解，如果不 能完全溶解，平衡后离心10000r/5min ，弃沉淀，留上 清，进行酶活测定和透析。
五．实验结果分析
– 各实验组进行分析，讨论实验结果，再由老 师进行归纳总结。 – 做好实验数据的原始记录。 – 交实验报告，对实验结果进行综合分析，并 对该实验提出一些可行性意见。
2、酶活测定方法（每组）
试剂 TCA(ml) 酪蛋白（ml） 酶液（ml） 激活剂（ml） TCA(ml) A275石英比色杯 酶活（U） 酶活（U）平均 值 0 0 对照(调零) 3 1 0.1 0.9 实验1 — 1 0.1 0.9 3 静置 5min 滤纸过滤 实验2 — 1 0.1 0.9 3 实验3 — 1 0.1 0.9 3