光电比浊法测定微生物数量
几种常用的细菌计数方法
几种常用的细菌计数方法1、计数器测定法即用血细胞计数器进行计数。
取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。
由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。
本法简便易行，可立即得出结果。
本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。
因此，要求菌悬液中不含任何碎片。
3、活细胞计数法常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。
取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。
此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。
使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确;②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O.001%2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC);③本法限用于形成菌落的微生物。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。
4、比浊法比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。
细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。
此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。
5、测定细胞重量法此法分为湿重法和干重法。
湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重;干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。
此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。
微生物实验微生物数量和大小测定
目镜测微尺 镜台测微尺
1.利用镜台测微尺 测定目镜测微尺旳 每格绝对值
2.目镜测微尺每格 长度（um）＝两 重叠线间镜台测微 尺格数×10/两重 叠线间目镜测微尺 格数
测定细胞数量旳常用措施 ➢稀释平板计数法 对样品稀释培养，据形成旳菌落数计数。 优点：活菌计数措施，对设备要求不高。 缺陷：操作复杂。
➢显微镜直接计数法 使用血球计数板在显微镜下直接计数。 优点：操作简便，计数直观。 缺陷：计数成果为活细菌和死菌体旳总和。
➢光电比浊法
光电比浊法是利用在一定旳范围内，微生物细 胞浓度与透光度成反比旳原理。当细菌细胞在 溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中 测定时所吸收旳光线越多。
2、细胞大小旳测量
酵母菌悬液滴在载玻片上，盖上盖玻片，置显微镜 载物台上。用目镜测微尺测量细胞宽和长。
三、试验成果
1.计算出目镜测微尺校正成果（物10×和40×） 2.酵母菌大小测定酵母菌大小测定,选择5-8个 酵母菌，测定其40×大小范围。
四、思索题 p51 2(2)
试验(二) 微生物数量旳测定
微生物实验微生物数 量和大小测定
试验(一) 微生物大小旳测定
一、目旳要求
学习使用镜台测微尺和目镜测微尺；在显微镜下测定微生 物大小。
二、试验原理
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线旳载玻 片，一般是l mm等分为100格，每格长0.01 mm(即10 um) ，用于校正目镜测微尺每格旳相 对长度。
一、目旳要求
1、明确血细胞计数板计数旳原理。 2、掌握使用血细胞计数板进行微 生物计数旳措施。
细菌计数简述
细菌计数【目的要求】1、掌握倾注培养法、活菌计数法和光电比浊计数法。
2、熟悉菌落形成单位（cfu）含义。
【器材和试剂】1、器材无菌平皿（直径90mm）、孵育箱、水浴箱、菌落计数仪、无菌刻度吸管、灭菌空试管、坐标纸。
2、培养基普通营养琼脂（每支15ml）、液体培养基。
3、其他待检样品，如饮用水、饮料、食品、药品、化妆品等。
【步骤和方法】1、倾注培养和活菌计数（1）按食品微生物学检验和医药化妆品检验国家标准（GB）的要求处理样品，如固体标本用无菌研钵研碎制成匀浆、油脂类物品用分散剂Tween-80、医药标本宜加入消除药物作用的中和剂等。
所有操作过程必须严格无菌，防止污染。
（2）将标本用无菌生理盐水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀释。
（3）取不同稀释度液体1ml注于直径90mm的无菌平皿，迅速加入已熔化并冷却至50℃的营养琼脂15ml，立即在平面上向同一方向平稳转动，使之混匀，待凝固后翻转平板。
一个稀释度接种两个平板。
（4）置35℃孵育18~24h，计数菌落形成单位（colony forming unit，cfu），求出每毫升或每克标本中所含活菌数。
1ml标本中活菌数=全平板cfu×稀释倍数（5）菌落计数方法：1）平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要使用放大镜检查，以防遗漏。
记下各平板上的菌落数后，应求出同一稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。
2）在求同一稀释度的平均数时，若其中一个平板有较大片状菌落时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。
3）若片状菌落不足平板一半，而其余一半中菌落数分布均匀，则计数后乘2代表全平板菌落数，然后再求该稀释度的平均菌落数。
（6）不同稀释度平均菌落数的确认：1）平均菌落数在30~300之间：①若两个稀释度的比值＜2，报告两个稀释度的平均菌落数，如表1-3-1例2；若比值≥2，应报告两个稀释度中较大菌落数者，如表1-3-1例3、例4.②当只有一个稀释度的平均菌落数在30~300之间时，即以该平均菌落数乘以稀释倍数报告之，如表1-3-1例1。
微生物计数方法
微生物计数方法微生物计数是许多领域中重要的分析方法，包括环境科学、食品科学、医学和生物技术。
正确的计数方法能够准确地估计样品中微生物的数量，对于研究和工业应用都是至关重要的。
下面将介绍几种常用的微生物计数方法。
血细胞计数器法是一种使用显微镜进行微生物计数的经典方法。
该方法使用血细胞计数器对微生物样品进行计数，每个格子中的微生物数量被计算出来，然后进行统计分析。
此方法的优点是准确性高，但是耗时长，操作繁琐，需要熟练的操作人员。
流式细胞术是一种使用流式细胞仪进行微生物计数的现代方法。
该方法将微生物样品通过流式细胞仪进行计数和分析，能够快速准确地测定样品中的微生物数量和种类。
此方法的优点是速度快、精度高、可自动化操作，但是设备成本高，维护成本也较高。
自动细胞计数器法是一种使用自动细胞计数仪进行微生物计数的现代方法。
该方法使用自动细胞计数仪对微生物样品进行计数，能够快速准确地测定样品中的微生物数量和种类。
此方法的优点是速度快、精度高、可自动化操作，而且设备相对较为经济实惠，易于推广应用。
平板计数法是一种常用的细菌计数方法。
该方法将微生物样品涂布在平板上，培养后计算菌落数量，从而得出样品中的细菌数量。
此方法的优点是简单易行、成本低，但是结果受培养条件和操作者技能水平的影响，准确性相对较低。
不同的微生物计数方法具有不同的优缺点，应根据具体的研究目标和实际情况选择合适的方法。
为了提高计数的准确性，需要注意样品的采集、保存、制备和处理等方面的问题，确保样品的质量和代表性。
微生物的分离与计数是微生物学中重要的实验技术之一。
通过分离和计数，我们可以获得微生物群体的相关信息，如种类、数量、生长状况等，对于微生物学研究、应用以及工业生产等领域都具有重要的意义。
选择合适的培养基：根据目标微生物的种类和生长需求，选择适合的培养基。
培养基应具有营养丰富、透明度高、易于观察等特点。
制备样品：从目标环境中采集样品，如土壤、水、食品等，并进行预处理，以去除不需要的杂质和大型生物。
测定细菌数量的方法
测定细菌数量的方法1、计数器测定法：即用血细胞计数器进行计数。
取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。
由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。
本法简便易行，可立即得出结果。
本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法:电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。
因此，要求菌悬液中不含任何碎片。
3、活细胞计数法常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。
取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。
此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。
使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。
4、比浊法比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。
细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。
此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。
5、测定细胞重量法此法分为湿重法和干重法。
湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。
此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。
实验七微生物数量的测定
五、实验报告
1、结果记录： 将计数结果记录下表。A表示五个中方格 中的总菌数。B稀释倍数为102。
注:1 mL菌液总数=A/5×25×104×B=5×107×A
五、实验报告
1、思考题： （1）在显微镜下直接测定微生物数量有什么优 缺点？
（2）根据你的体会，说明用血球计数板计数的误 差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力 求准确？ （3）某单位要求知道一种干酵母粉的活菌存活率 请设计1-2种可行的检测方法。
5. 计算方法：
酵母菌细胞数/mL= （X1+X2+X3+X4+X5） 25（或16）X 10 X 1000 x 稀释倍数 X 5
6. 注意事项：压在方格线上的菌体，以压在底线和 右侧线上的菌体计入本格内；遇到有芽体的酵母时， 若芽体超过母体一半以上，就按单个酵母计数。 7. 计数完毕后，血球计数板要立即清洗干净，并用 吸水纸吸干，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内。
下次实验：微生物大小的测定
ห้องสมุดไป่ตู้
1. 取清洁无油的血球计数板（在显微镜下检查，如不 干净清水冲洗，不可用硬毛刷刷洗），在计数室上面 加盖玻片。
2. 取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴， 使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。 3. 静止5min后，用低倍镜观察并将计数室移至视野 中央。 4. 在高倍镜下计数：随机计数五个中格的平均值， 然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出 一大格中的总菌数，最后再换算到每mL菌液中的含菌 数。
实验七
微生物数量的测定
一、目的要求
1．明确血细胞计数板计数的原理 2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的 方法。
二、基本原理
微生物个体生长的时间较短，很快进入分裂 繁殖阶段，个体生长难以测定。它们的生长一般 以繁殖即群体生长作为微生物生长的指标。群体 生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。 测定数目的方法有显微镜直接计数法、平板计数 法、光电比浊法等。 显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液 置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上， 于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的 方法。
比浊法测定发酵液中的生物量实验报告
比浊法测定发酵液中的生物量实验报告发酵液是指在适宜的温度、pH值和营养条件下，微生物利用有机物质进行代谢活动产生的液体产物。
测定发酵液中的生物量对于研究微生物代谢活动和发酵过程的控制具有重要意义。
比浊法是一种常用的测定生物量的方法，通过测量发酵液的浑浊度来间接反映其中的生物量。
本实验旨在通过比浊法测定发酵液中的生物量，并探究不同因素对生物量的影响。
实验步骤：1. 实验前准备：准备好所需的发酵液样品和比浊仪器，确保仪器处于良好的工作状态。
2. 校准比浊仪器：使用标准溶液（如硫酸铵溶液），按照仪器说明书进行校准，以确保测量结果的准确性。
3. 取一定量的发酵液样品，注意避免氧气的接触，以免影响测量结果。
4. 将发酵液样品置于比浊仪器中，按照仪器操作说明进行测量。
5. 记录测量结果，并进行数据处理和分析。
实验结果：通过比浊法测定，我们得到了不同时间点下发酵液的浊度值。
根据浊度值和校准曲线，可以求得相应的生物量。
实验讨论：1. 比浊法的原理：比浊法是利用物质颗粒对光的散射作用来间接测定物质浓度的方法。
发酵液中的微生物和代谢产物会形成颗粒，这些颗粒对光的散射作用与其浓度成正比，因此可以通过测量散射光的强度来间接测定生物量。
2. 比浊法的优点：比浊法简单、快速、经济，不需要复杂的仪器设备，适用于大量样品的测定。
3. 比浊法的局限性：比浊法只能测定总的生物量，无法区分不同种类的微生物或代谢产物。
此外，发酵液中其他因素的影响（如溶解气体、颜色物质等）可能干扰测量结果，需要进行适当的修正。
4. 影响测量结果的因素：发酵液的浑浊度与微生物的生长状况和代谢活动有关，因此受到温度、pH值、营养条件等因素的影响。
在实验中，可以控制这些因素的变化，研究其对生物量的影响。
实验总结：本实验通过比浊法测定发酵液中的生物量，探究了不同因素对生物量的影响。
比浊法是一种简便、经济的测量方法，适用于大量样品的测定。
然而，比浊法只能测定总的生物量，无法区分不同种类的微生物或代谢产物。
测定微生物数量的方法
测定微生物数量的方法1.计数器测定法：即用血细胞计数器进行计数。
取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。
由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。
本法简便易行，可立即得出结果。
本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法:电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。
因此，要求菌悬液中不含任何碎片。
3、活细胞计数法常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。
取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。
此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。
使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。
4、比浊法比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。
细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。
此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。
5、测定细胞重量法此法分为湿重法和干重法。
湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。
此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。
光电比浊法测定微生物数量
三、实验器材
1．菌种：大肠杆菌培养液
2．仪器、材料：722s分光光度计，血细胞计 数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌 生理盐水等。
四、操作步骤
1．标准曲线制作 （1）编号 取无菌试管6支，分别编号为1、2、 3、4、5、6。
（2）调整菌液浓度 用血细胞计数板计数培养 24小时的酿酒酵母菌悬液，并用无菌生理盐水分别 稀释调整为每毫升1×106、2×106、4×106、 6×106、8×106、10×106菌量的悬液。分装入编号 的无菌试管中。 （3）测OD值以无菌生理盐水作空白对照，不同 浓度的菌悬液摇匀后于560nm波长测定OD值。
标准曲线制作1编号取无菌试管6支分别编号为122调整菌液浓度用血细胞计数板计数培养24小时的酿酒酵母菌悬液并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升1104以光密度od值为纵坐标以每毫升细胞数为横坐标绘制标准曲线光电比浊法Biblioteka 定微生物数量一、实验目的及要求
1．了解光电比浊计数法的原理。
2．学习、掌握光电比浊计数法的 操作方法。
二、基本原理
当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散 射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范 围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密 度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确 测出。 用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作 出光密度－菌数标准曲线。然后，以样品液所测 得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。 制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计 数板计数，平板菌落计数或细胞干重测定等方法。 本实验采用血细胞计数板计数。
(4)以光密度(OD)值为纵坐标，以每毫升细胞 数为横坐标，绘制标准曲线。
2．样品测定 待测样品用无菌生理盐水适当稀释， 摇匀，560nm波长测定光密度。测定时用无菌生 理盐水作空白对照。
实验十二 平板菌落计数法和光电比浊计数法
三、水产养殖水质净化、水产养殖水环境净化和水 产养殖池底净化处理处恶臭等。 功效：
• 1、快速分解水体中的残饵，粪便，死藻等，维护水质，有效 预防泛塘和鱼虾病害，减少换水量。 • 2、降解形成的小分子有机物及矿物质能促进藻类、原生动物 等的生长，为鱼虾提供活体饵料。 • 3、在水体中形成有益菌优势群种，抑制有害细菌的繁殖，维 持水体中的微生态环境平衡。 • 4、枯草芽孢杆菌本身是安全，有益的微生物，动物食入适量 菌体后，能减少鱼虾病害，提高鱼虾对饵料的消化吸收效率。 • 5、增强鱼虾的消化吸收功能，使其充分吸收利用饲料中营养 成分及天然色素，增强其天然着色度和使用风味，使鱼虾色泽 鲜亮。
二、基本原理——光电比浊计数法
当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用 使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度 不透光度成反比，不光密度成正比，而光密度或透光度可 以由光电池精确测出。 用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度—— 菌数标准曲线。然后，就可以以样品液所测得的光密度， 从标准曲线中查出对应的菌数。 制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数、平 板菌落计数或细胞干重测定等方法。本实验采用平板菌落 计数法。
2、平板菌落计数：
（1）编号：取无菌平皿9套，分别标明为10-4、10-5、10-6各三套， 另取6支无菌试管，装入4.5mL无菌水，依次标记为10-1、10-2、 10-3、10-4、10-5、10-6； （2）稀释：任选一支上述盛有已测OD值的菌悬液的试管，如1号试 管，精确地取0.5mL至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将10-1的 试管振荡混匀。另换一支吸头插入10-1试管中来回吹吸菌液三次， 进一步将菌体分散、混匀。再用此吸管精确吸取10-1菌液0.5mL至 10-2试管中，此即为100倍稀释，依次类推； （3）取样：用移液器分别吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌悬液各 0.2mL ，对号放入编好号的无菌平皿中； （4）倒平板：尽快向上述盛有丌同稀释菌液的平皿中倒入融化后 冷却至45℃的牛肉膏蛋白胨培养基约20mL，置水平位置迅速旋动 平皿，使培养基不菌液混合均匀； （5）培养：待培养基凝固后，平板倒置于37℃培养箱中培养48h；
水产微生物实验—微生物大小及数量测定
实验八微生物大小及数量测定一、基础知识（一）微生物大小测定微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。
微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将lmm等分为100格，每格长 m)。
镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺0．01mml(即10每格的相对长度。
目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格两种。
测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。
由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。
因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。
球菌用直径来表示其大小，杆菌则用宽和长的范围来表示。
如金黄色葡萄球菌直径约为0．8µm。
枯草芽孢杆菌大小为0.7-0.8×2-3µm。
（二）微生物数量的测定单细胞微生物个体生长时间较短，很快进入分裂繁殖阶段，因此，个体生长难以测定，除非特殊目的，否则单个微生物细胞生长测定实际意义不大。
微生物的生长与繁殖(个体数目增加)是交替进行的，它们的生长一般不是依据细胞的大小，而是以繁殖，即群体的生长作为微生物生长的指标。
群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。
测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法、平板菌落计数法、光电比浊法、最大近似值法(MPN)，以及膜过滤法等，测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、RNA和DNA的含量测定，代谢产物的测定等。
总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况要求加以选择。
实验10-细菌计数
实验10 细菌计数返回目录一、显微镜直接计数法【原理】显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌板)，于显微镜下直接计数细菌的一种简便、快速、直观的方法。
该法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，目前国内外常用的计菌板有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌板以及Hawksley计菌板等，血球计数板适用于菌体较大的酵母菌或霉菌孢子的计数，后两种计菌板适用于一般细菌的计数。
这几种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，盖玻片和载玻片之间的距离只有0.02mm，可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚，不能使用油镜。
这里介绍血球计数板方法计数酵母菌数量。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽所构成的3个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是一个大方格分为16个中方格(四角的四个大方格)，每个中方格又分25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格(中央的一个大方格)，而每个中方格又分成16个小方格，即计数区都由400个小方格组成(图1-3-12)。
图1-3-12 血细胞计数板构造计数区（一个大方格）边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。
盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l/4000mm3。
使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每mL菌液(或每g样品)中微生物细胞的数量。
已知：1ml体积＝10mm×10mm×10mm＝1000mm3所以：1ml体积应含有小方格数为1000mm3／(1／4000mm3)＝4×106个小方格。
因此：每ml菌悬液中含有细胞数＝4×106×每个小格中细胞平均数×菌液稀释倍数。
常见生物量的统计方法（干重DCW、体积、比浊OD、细胞数N、黏度、核酸、代谢物P、总氮）及...
常见生物量的统计方法（干重DCW、体积、比浊OD、细胞数N、黏度、核酸、代谢物P、总氮）及...生物量（biomass）是指某一时刻单位面积内实存生活的有机物质（包括生物体内所存食物的重量）总量，通常用kg/m2或t/hm2表示。
广义的生物量是生物在某一特定时刻单位空间的个体数、重量或其含能量，可用于指某种群、某类群生物的（如浮游动物）或整个生物群落的生物量。
狭义的生物量仅指以重量表示的，可以是鲜重或干重。
与生产力是不同的概念，某一特定时刻的生物量是一种现存量（standing crop）。
本文主要针对微生物发酵过程中生物量的检测方法，进行整理和分析，具体如下：1、体积测量法通过测定一定体积培养液中所含菌丝的体积来反映微生物的生长状态。
取一定量的待测培养基体积为V1，放在有刻度的离心管内，设定一定的离心时间t和转速r，离心完成后到，倒出上清液并测得体积为V，则离心机压缩体积：PMV∣（t，r）=V1-V/V1特点：粗放、简便、快速、偏差大、常含有非菌体固形物，对于醪液发酵培养基不适用。
2、细胞干重法 DCW将单位体积的微生物培养液经离心收集并用水反复洗涤菌体，经常压或真空干燥后精确称重，即可计算出培养物的总生物量。
一般1mg细菌干重约等于4～5mg湿菌鲜重或相当于4×109～5×109 个细胞，可以以此作标准从干重做需要的转换。
特点：繁琐、耗时，不方便在线分析，本法适用于含菌量高、不含或少含非菌颗粒性杂质的环境或培养条件。
3、比浊法OD微生物的生长引起培养物浊度的增高、通过紫外分光光度计测定固定波长下的吸光值则可判断该微生物的生长状况。
通常在600nm处，测得吸光值（OD值）。
特点：常用与细菌、酵母，方便、快捷、在线监测反馈；对于浑浊程度较高的发酵醪液因超出检测范围需要进行稀释操作，稀释溶液最好为培养基。
4、细胞计数N（直接计数法）常用计数法包括：血球计数板法、平板菌落法，或者用电子计数器计数。
微生物生长的几种检测方法
一、生长量测定法1.1体积测量法：又称测菌丝浓度法。
通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。
方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。
菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。
这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。
1.2称干重法：可用离心或过滤法测定。
一般干重为湿重的10-20%。
在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1-5次，进行干燥。
干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80℃或40℃下真空干燥，干燥后称重。
如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40℃下进行真空干燥。
称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（activity dry yeast, ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。
1.3比浊法：微生物的生长引起培养物混浊度的增高。
通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。
对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。
将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。
该法主要用于发酵工业菌体生长监测。
如我所使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计，在波长600nm 处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600，以此监控E.Coli的生长及诱导时间。
1.4菌丝长度测量法：对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度，或是利用一只一端开口并带有刻度的细玻璃管，到入合适的培养基，卧放，在开口的一端接种微生物，一段时间后记录其菌丝生长长度，借此衡量丝状微生物的生长二、微生物计数法2.1血球计数板法:血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1 mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1 mm2面积上刻有400个小方格。
微生物数量测定
微生物数量测定在生物学和医学领域，微生物的数量测定是一个重要的实验技术。
通过对微生物数量的测定，我们可以了解生物体在不同环境中的适应性和生存能力，评估环境的健康状态，以及监测和治疗疾病等。
微生物数量测定的基本原理是利用单位体积或单位面积上的微生物细胞数，通过统计和计算得到微生物的数量。
常用的方法包括显微镜计数法、比浊法、平板计数法等。
显微镜计数法是一种直接计数法，通过显微镜观察并计数样品中的微生物数量。
该方法需要将样品均匀涂布在载玻片上，干燥后进行染色和固定，然后使用显微镜观察并计数。
该方法的优点是简单易行，适用于微生物数量较少的样品，但不适用于大量样品。
比浊法是一种通过测量样品的浊度来测定微生物数量的方法。
该方法是通过将样品与标准曲线进行比较，得出微生物的数量。
该方法的优点是快速、简便、准确度高，适用于大量样品的测定。
但是，该方法需要使用标准曲线，对于某些微生物可能不太准确。
平板计数法是一种通过培养微生物并计数菌落数量来测定微生物数量的方法。
该方法是将样品稀释后涂布在培养基上，培养一定时间后统计菌落数量，然后计算出微生物的数量。
该方法的优点是准确度高，适用于各种微生物的测定，但需要一定的培养时间和人力。
微生物数量测定的应用领域非常广泛，包括环境科学、医学、食品科学、农业科学等。
例如，在环境科学中，微生物数量测定可以用来评估污染物的毒性对生态环境的影响；在医学中，微生物数量测定可以用来监测和治疗疾病；在食品科学中，微生物数量测定可以用来控制食品的质量和安全；在农业科学中，微生物数量测定可以用来了解土壤的健康状况和作物的生长情况等。
微生物数量测定是一种重要的实验技术，广泛应用于生物学和医学等领域。
通过对微生物数量的测定，我们可以更好地了解生物体的适应性和生存能力，评估环境的健康状态，监测和治疗疾病等。
未来随着科技的不断进步和应用领域的不断拓展，微生物数量测定的方法和应用将更加多样化和精准化。
在生物学和医学领域，微生物的大小和数量的测定对于研究生命过程、疾病诊断和治疗等方面都具有重要的意义。
土壤微生物量及土壤酶活性测定方法
土壤微生物量及土壤酶活性测定方法土壤中的微生物是维持土壤生态系统健康的重要组成部分，土壤酶活性则可以作为评价土壤肥力和生物活性的重要指标。
因此，在土壤微生物量和土壤酶活性测定方面的研究非常重要。
本文将介绍几种常用的土壤微生物量和土壤酶活性的测定方法。
一、土壤微生物量测定方法1.铺平法：将土壤样品铺平在玻璃板上，使用显微镜对土壤中的微生物进行直接观察和计数。
这种方法的优点是简单易行，但需要大量的时间和人力。
2.累积碳法：通过测定土壤中的有机碳含量来间接估算土壤微生物量。
有机碳水平与微生物量密切相关，所以可以通过测定土壤中的有机碳来推测微生物的数量和活性。
3.培养法：将土壤样品接种到适当的培养基上进行培养，然后通过菌落计数或直接计数来估算微生物的数量。
这种方法适用于数量较多的微生物，如细菌和真菌。
4.傅里叶变换红外光谱法（FTIR）：通过测量土壤样品的傅里叶变换红外光谱，分析土壤中的微生物量。
该方法具有快速、准确、非破坏性等优点。
1.浊液法：通过观察测定液中的混浊度来测定土壤中的脲酶、过氧化氢酶等氧化酶的活性。
这种方法简单易行，但对于不同种类的土壤酶效果不一样。
2.比色法：采用酶底物与酶催化产物之间的化学反应，通过测定反应产物的颜色来估算土壤酶活性。
比色法可以用于测定脱氢酶、脱氢酶、脱氧核苷酸酶等酶的活性。
3.荧光法：将有机物和荧光试剂一起加入土壤样品中，经过反应后，在荧光分析仪中测定产生的荧光强度来测定土壤酶的活性。
荧光法适用于测定蔗糖酶、酚氧化酶和脱氢酶等酶的活性。
4.比浊法：通过加入酶底物后，观察土壤样品的混浊度来测定土壤中酶的活性。
比浊法适用于黄酶、脱氢酶等酶的活性测定。
5.电导法：通过测定土壤样品溶液中的电导率变化来估算土壤中酶的活性。
电导法适用于磷酸酶和脱氢酶等酶的活性测定。
总结起来，土壤微生物量和土壤酶活性的测定方法多种多样，选择合适的方法需要考虑样品特性和实验条件等因素。
每种方法都有其优点和局限性，研究者应根据需要选取合适的方法进行测定。
微生物生长量的测定
微生物学研究中常常要进行微生物生长量的测定。
有多种方法可用于微生物生长量的测定，概括起来常用的有以下几种：(一)自接计教法(又称全数法)1．计数器直接测数法取定量稀释的单细胞培养物悬液放置在血球计数板(细胞个体形态较大的单细胞微生物，如酵母菌等)或细菌计数板(适用于细胞个体形态较小的细菌)上，在显微镜下计数一定体积中的平均细胞数。
换算出供测样品的细胞数。
(1)血球计数板及细胞计数血球计数板是一种在特定平面上划有格子的特殊载片。
在划有格子的区域中，有分别用双线和单线分隔而成的方格。
其中有以双线为界划成的方格25(或16)格，这种以双线为界的格子称为中格(见图5-10)。
其内有以单线为界的16(或25)小格。
因此，用于细胞计数的区域的总小格数为：25×16=400。
该400个小格排成一正方形的大方格，此大方格的每条边的边长为1mm，故400个小格的总面积为1mm2。
在进行细胞计数前，先取盖玻片盖于计数方格之上．盖玻片的下平面与刻有方格的血球计数板平面之间留有0．1mm高度的空隙。
含有细胞的供测样品液被加注在此空隙中。
加注在400个小格(1mm2)之上与盖玻片之间的空隙中的液体总体积应为：1．0mm×1．0mm×0．1mm=0．1mm3一般表示样品细胞浓度的单位为亿个/mL。
因此，在计数后。
获得在400个小格中的细胞总数，再乘以104，以换算成每mL所含细胞数。
其计算公式如下：菌液的含菌数／mL=每小格平均菌数×400×10 000×稀释倍数在进行具体操作时，一般取；个中格进行计数，取格的方法一般有两种：①取计数板斜角线相连的5个中格；②取计数板4个角上的4个中格和计数板正中央的1个中格。
对横跨位于方格边线上的细胞，在计数时，只计一个方格4条边中的2条边线上的细胞，而另两条边线上的细胞则不计。
取边的原则是每个方格均取上边线与右边线或下边线与左边线。
微生物数量的测定方法
微生物数量的测定方法work Information Technology Company.2020YEAR微生物数量的测定1.计数器测定法：即用血细胞计数器进行计数。
取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。
由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。
本法简便易行，可立即得出结果。
本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法:电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。
因此，要求菌悬液中不含任何碎片。
3、活细胞计数法常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。
取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出活菌数。
此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。
使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。
4、比浊法比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。
细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。
此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。
5、测定细胞重量法此法分为湿重法和干重法。
湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。
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(4)以光密度(OD)值为纵坐标，以每毫升细胞 数为横坐标，绘制标准曲线。
2．样品测定 待测样品用无菌生理盐水适当稀释， 摇匀，560nm波长测定光密度。测定时用无菌生 理盐水作空白对照。
3．根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每 毫升的含菌数。
五、实验报告
1.结果 每毫升原液菌数=标准曲线查得每毫升的菌 数×稀释倍数 2．思考题 (1)光电比浊计数的原理是什么?这种计数 法有何优缺点? (2)光电比浊计数在生产实践中有何应用价 值? (3)试考虑如何绘制大肠杆菌生长曲线
光电比浊法测定微生物数量
一、实验目的及要求
1．了解光电比浊计数法的原理。
2．学习、掌握光电比浊计数法的 操作方法。
二、基本原理
当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散 射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范 围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密 度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确 测出。 用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作 出光密度－菌数标准曲线。然后，以样品液所测 得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。 制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计 数板计数，平板菌落计数或细胞干重测定等方法。 本实验采用血细胞计数板计数。
三、实验器材
1．菌种：大肠杆菌培养液
2．仪器、材料：722s分光光度计，血细胞计 数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌 生理盐水等。
四、操作步骤
1．标准曲线制作 （1）编号 取无菌试管6支，分别编号为1、2、 3、4、5、6。
（2）调整菌液浓度 用血细胞计数板计数培养 24小时的酿酒酵母菌悬液，并用无菌生理盐水分别 稀释调整为每毫升1×106、2×106、4×106、 6×106、8×106、10×106菌量的悬液。分装入编号 的无菌试管中。 （3）测OD值以无菌生理盐水作空白对照，不同 浓度的菌悬液摇匀后于560nm波长测定OD值。