病毒感染微生物学检查方法浅谈
病毒感染与检测——【医学微生物学精品讲义】
5、细胞凋亡 apoptosis
是一种由基因控制的细胞自主性死亡， 受多种基因调节。在某些病毒感染时可由于 病毒本身或病毒编码的蛋白间接作用诱导细 胞凋亡。
a、慢性感染 chronic infection
症状轻微或缺如；可排毒；病程不一定但呈进 行性发展。
b、 潜伏性感染 latent infection
原发感染后，病毒基因存在于一定的组织或细 胞中，但并不产生感染性病毒，也不出现临床症状。
显性或隐性感染后
激活
病毒基因组潜伏于组织或细胞中
c、 慢发病毒感染 slow viral infection
主要感染途径 传播方式与 媒介 病毒种类
呼吸道
空气、飞沫
消化道
污染水或食物
输血、注射或 污染血或血制品
器官移植
、污染注射器等
眼或泌尿生殖 接触、游泳池或
道
性接触
破损皮肤
昆虫叮咬、狂犬 、鼠类
流感病毒、 麻疹病毒等
脊髓灰质炎病毒 、轮状病毒等
人类免疫缺陷病 毒、乙肝病毒和 丙肝病毒等
人类免疫缺陷病 毒、乳头瘤病毒
病毒的感染与免疫
病毒的传播方式
一、水平传播 (horizontal infection) 二、垂直传播 (vertical infection)
水平传播：是指病毒在人群不同个体间的 传播所导致的感染，其传播途径包括：呼 吸道、消化道、 泌尿生殖道、 眼和破损 皮肤等。 垂直传播：是病毒感染的特点之一，病毒 通过胎盘、产道等途径由亲代传给子代， 常见的是RUV、CMV、HBV、HIV。
病毒感染的实验诊断
病毒感染的实验诊断病毒感染的实验诊断（一）● 考点病毒的生物学性状病毒的实验室检查方法常见病毒的感染 [讲义编号NODE70103300270100000101：针对本讲义提问]【内容讲解】第一节概述一类非细胞型微生物，个体极小，可通过细菌滤器，需用电子显微镜观察。
仅含一种核酸作为遗传物质，外被蛋白质衣壳或还有包膜。
病毒只能在活细胞内寄生，以复制的方式进行增殖。
在临床微生物感染中，近75%的传染病是由病毒引起的。
[讲义编号NODE70103300270100000102：针对本讲义提问]一、病毒的基本性状（一）形态结构 1.大小和形状：大小：测量单位用纳米表示，一般在20-300nm之间。
形态大致可分为：球形或近似球形、杆状、弹形、砖形、蝌蚪形等。
[讲义编号NODE70103300270100000103：针对本讲义提问]2.结构[讲义编号NODE70103300270100000104：针对本讲义提问]（二）病毒的增殖病毒必须依赖宿主细胞，以特殊的自我复制方式进行增殖。
病毒的复制周期：吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装与成熟、释放6个阶段。
[讲义编号NODE70103300270100000105：针对本讲义提问]异常增殖：顿挫感染：病毒进入细胞后的环境不利于它的复制，不能合成本身的成分或不能组装和释放有感染性的病毒颗粒。
缺陷病毒：由于病毒基因组不完整或基因位点改变而不能进行正常增殖的病毒。
[讲义编号NODE70103300270100000106：针对本讲义提问]干扰现象：当两种不同的病毒或两株性质不同的同种病毒，同时或先后感染同一细胞或机体时，可发生一种病毒抑制另一种（三）噬菌体以细菌、真菌等为宿主，能引起细菌等裂解的病毒。
噬菌体特异性识别细菌表面受体，可用于进行细菌的鉴定与分型。
噬菌体感染细菌后产生两种后果：溶菌周期和溶源性周期。
[讲义编号NODE70103300270100000107：针对本讲义提问]（四）非寻常病毒比病毒更小更简单的致病因子，又称为亚病毒因子，包括类病毒、卫星病毒和朊粒等。
病毒感染的实验诊断
采集各种器官时要分开使用器械和
容器。
最新课件
10
（二）标本的运送和保存
标本采集后注意无菌、冷冻、保湿、 立即送检。
分离培养病毒的标本要尽快送到实 验室处理和接种。如不能及时送检，可 在4℃冷藏数小时，如需较长时间保存则 应 置 -70℃ 。 放 置 在 -20℃ ， 病 毒 容 易 灭 活，冻存液中需加入甘油或二甲亚砜等 作保护，避免反复冻融使病毒灭活。
应部位采取标本，处理标本时要考虑病
毒的生物学特性。常见分离病毒标本的
选择见教材P64表4-2。
（1） 心脏疾病
（2） 中枢神经系统感染
（3） 先天或新生儿感染
（4） 胃肠道疾病
（5） 呼吸道感染
最新课件
6
3．常见标本的采集方法
（1） 血液：以无菌手续抽取抗凝血10ml， 抗凝剂可选用100u/ml肝素钠。为了血清 学检查的需要，应抽取另一管5ml血液， 不抗凝送检。
程度上取决于标本的恰当采样和处理，为了保 证标本质量，应注意以下问题：
1．采样时间 尽可能在发病的初期，急性期 或患者入院的当天进行，越早越好，最好在治 疗之前。疾病后期体内产生免疫力，病毒量减 少或消失。
最新课件
5
2．标本种类的选择
根据临床感染的症状及流行病学资
料，判断可能感染病毒的种类，选择相
清学实验；后者主要是核酸杂交与PCR 及现代免疫学技术。
最新课件
3
病毒分离培养
病原学诊断 形态学检测
病 毒
分子生物学技术——病毒核酸
学
补体结合试验
检
中和试验
验
血清学诊断 血凝抑制试验
病毒感染的检查方法与防治原则
埃可病毒( 埃可病毒(-) CPE(+)—风疹病毒( CPE(+)—风疹病毒(-) 埃可病毒(+) 埃可病毒(+)
(4)细胞代谢改变
细胞代谢变慢 pH变化减慢 pH变化减慢
2.病毒形态学鉴定
电子显微镜：设备、操作复杂， 电子显微镜：设备、操作复杂，应用受限 光学显微镜：可见大病毒 痘类病毒） 光学显微镜：可见大病毒（痘类病毒）， 大病毒（ 对一般病毒检测意义不大 对一般病毒检测意义不大
腮腺炎病毒感染细胞
(3)干扰现象（interference） 干扰现象（interference）
风疹病毒＋ 风疹病毒＋胚肾细胞 病毒增殖，CPE(－) 病毒增殖，CPE(
埃可病毒＋ 埃可病毒＋人胚肾细胞
病毒增殖，CPE(＋) 病毒增殖，CPE( CPE(CPE(-)—风疹病毒(+) 风疹病毒(
风疹病毒？ 风疹病毒？ ＋人胚肾细胞 埃可病毒
四、病毒感染的快速诊断
数小时内出结果 病毒颗粒 病毒成分（抗原或核酸） 病毒成分（抗原或核酸） 早期抗体检测（ gM） 早期抗体检测（IgM）
（一）形态学检查
电镜和免疫电镜检查 普通光学显微镜检查 包涵体
（二）病毒成分检测
1.病毒蛋白抗原检测 免疫标记技术
2.病毒核酸检测 核酸扩增技术 核酸杂交技术 基因芯片技术 基因测序
3.病毒血清学鉴定
(2)免疫标记法（FIA、EIA、RIA） 免疫标记法（FIA、EIA、RIA） ——多种病毒鉴定 ——多种病毒鉴定 (3)凝胶免疫扩散试验(gel immuno凝胶免疫扩散试验( immunodiffusion test) test) ——多种病毒鉴定 ——多种病毒鉴定
4.病毒分子生物学鉴定
《微生物和微生物学检验》
Ｇ＋菌肽聚糖厚、层数多、立体状坚固。
图 金黄色葡萄球糖细胞细胞壁的 肽聚糖结构
图 大肠杆菌细胞壁的肽聚糖结构
Ｇ＋菌细胞壁 特殊结构
膜磷壁酸 壁磷壁酸 表面蛋白：SPA、M蛋白
Ｇ－菌细胞壁 特殊结构 (外膜)
磷脂
脂蛋白
类脂Ａ：毒性部分
脂多糖（LPS，内毒素）： 核心多糖：属和组特异
特异多糖：种和型特异
革兰氏阴性菌多见
化学组成 蛋白质（分子量27，000～900，000）
磷脂一多糖一蛋白质复合物 （毒性主要为类脂A）
稳定性 不稳定，60℃以上能迅速破坏
耐热，60℃耐受数小时
毒性作用
强，微量对实验动物有致死作用（以ug计
稍弱，对实验动物致死作用的
量）。各种外毒素有选择作用，引起特殊病 量比外毒素为大。各种细菌内
目前检验科的主要任务。 ４．对医院感染进行监控。
五、临微学习方法：
重要性：与毕业后工作紧密相关。 （１）平时注意预习、复习； （２）对内容上，紧紧围绕诊断，诊断又是 由各种典型特性建立的方法来进行的 抓特性、去共性 （３）注意新动向。
第一篇 微生物学
细菌学总论
一、细菌(bacterium)的形态与结构
3．质粒可自行失去或经人工处理而消失。 4．质粒可以独立复制。 5．可有几种质粒同时共存在于一个细菌内。
（二）细菌的变异现象
形态与结构变异 培养特性变异 毒力变异 耐药性变异
（三）细菌变异的机制
突变
基因的转移和重组
转化（transformation）是受体菌直接摄取供体菌 游离的DNA片段，通过与染色体重组，获得了供体 菌的部分遗传特性。
医院感染：医院中发生的一切感染。包
医学微生物学：病毒感染的检查方法与防治原则
第一节 病毒感染的检查方法
一、标本采集与送检
原则：与细菌类似 •用于分离培养的标本： 采取采取急性期标本、使用抗生素处 理防细菌污染
无菌操作、低温保存、尽快送检
•血清学诊断的标本： 双份血清？
早期采集
标本的采集和送检六原则
无菌采集 采集合适的标本
采集双份血清
尽快送检 正确标记
❖ 种类：常用的传代细胞有HeLa（宫颈癌）细胞、KB（口 腔癌）细胞、HEp-2（喉癌）细胞、Vero（非洲绿猴肾） 细胞等。
❖ 特点及作用：由于传代细胞系能有规律地持续传代，容
易保存（-70℃~-196℃）且对某些病毒易感，因此，在
诊断、科研等非疫苗生产的项目中常被采用。目前广泛 用于病毒的实验室诊断工作，根据病毒对细胞的亲嗜性 ，选择敏感的细胞系使用传代细胞系
病毒1:100稀释
病毒1:1000稀释
中性红染色：活细胞呈红色，受病毒感染破坏的细胞不着色
三、病毒感染的诊断
1.病毒形态学检查 2.病毒成分（病毒蛋白和核酸）检查 3.病毒感染的血清学（病毒抗体）检查
❖ 标本类型？ 与细菌标本类似 ❖ 好的标本？ 正常无菌性体液 ❖ 标本内容物一般需要含有宿主细胞
二、病毒的分离培养与鉴定
病毒的实验室诊断方法
动物接种
病 毒
鸡胚培养
分离培养方法（金标准）
检 细胞培 养 测 病毒成分检测
活细胞
血清学诊断
（一）病毒的分离培养
1.动物接种
❖ 最原始的病毒培养方法 多用于没有敏感细胞进行细胞培养的病毒 （乙肝、丙肝、丁肝、戊肝病毒等）
二倍体细胞培养(diploid cell culture )
浅谈微生物检验质量控制
浅谈微生物检验质量控制为了保证微生物检验结果的准确性和可靠性，微生物实验室必须建立质量控制体系，充分考虑到影响检验结果的因素并加以控制，可提高微生物检验工作的质量。
我们就如何为卫生防疫工作提供可靠的依据进行了探讨，主要有以下几点。
1 样品采集和交接质量管理样品由业务科室或业务科室会同检验人员采取。
采样时必须无菌操作，避免杂菌污染。
盛装检样的容器避免倒置或破碎，确保安全。
盛装检样的容器必须有标签，注明采样时间、采样来源及编号。
采取的样品应在规定的时间内（一般不超过3～4h）送到试验室，有的样品如病毒标本等要使用运送培养基或在特殊环境（冰瓶或其它冷藏器具）中运送。
运送血液应当避免剧烈震荡，防止溶血。
需要血清的检样，采血后使其在试管中凝固运送，并及时分离血清。
送往实验室的样品，必须附有样品检验单和样品交接单。
接受样品时，检验者必须核对无误。
由接收者在样品交接单上签字，同时进行检样登记。
瓶装启开或固体形状不完全、数量不足者都必须拒收［3］。
2 实验操作人员的作用微生物实验室的质量可以通过正确的操作来体现，例如，革兰氏染色，可以通过对标准质控菌株的染色来反映操作和试剂的质量，这是有形的、看得见的，然而，质量保证更依赖工作人员的认知能力。
一个受过充分培训的、能够严谨地分析实验结果的工作人员，不是只能忠实地记录实验数据，而是可以实施更加严格的标准。
在微生物检验中会遇到一些不常见结果或一些散在地发生的错误，例如，试验中发现的少见菌、从未见过的药敏表型、污染率的增加等，往往通过一些质控方法难以检查出来，但具有质量意识的微生物技术人员能对这些现象质疑，及时纠正，保证结果的准确可靠。
3 实验室内消毒灭菌质量控制无菌室应保证洁净、防潮、按时消毒，所用紫外线灯管应检验其性能，使用前必须开紫外线灯消毒45min以上。
消毒后2h内应无菌，每季度应进行一次“紫外线对空气消毒效果测定”。
如灯管发黑，超过使用期限，及时更换紫外线灯管。
病毒感染的微生物学检查方法
（一）病毒分离
标本采集
杀灭杂菌
（青链霉素）
接种
三大方法
易感动物 出现病状 鸡胚 病变或死亡 细胞培养 细胞病变
鉴定病毒种型
（二）病毒鉴定
酒也。节奏划分思考“山行/六七里”为什么不能划分为“山/行六七里”？ 明确：“山行”意指“沿着山路走”，“山行”是个状中短语，不能将其割裂。“望之/蔚然而深秀者”为什么不能划分为“望之蔚然/而深秀者”？明确：“蔚然而深秀”是两个并列的词，不宜割裂，“望之”是总起词语，故应从其后断句。【教学提示】引导学生在反复朗读的过程中划分朗读节奏，在划分节奏的过程中感知文意。对于部分结构复杂的句子，教师可做适 当的讲解引导。目标导学三：结合注释，翻译训练1．学生结合课下注释和工具书自行疏通文义，并画出不解之处。【教学提示】节奏划分与明确文意相辅相成，若能以节奏划分引导学生明确文意最好；若学生理解有限，亦可在解读文意后把握节奏划分。2．以四人小组为单位，组内互助解疑，并尝试用“直译”与“意译”两种方法译读文章。3．教师选择疑难句或值得 翻译的句子，请学生用两种翻译方法进行翻译。翻译示例：若夫日出而林霏开，云归而岩穴暝，晦明变化者，山间之朝暮也。野芳发而幽香，佳木秀而繁阴，风霜高洁，水落而石出者，山间之四时也。直译法：那太阳一出来，树林里的雾气散开，云雾聚拢，山谷就显得昏暗了，朝则自暗而明，暮则自明而暗，或暗或明，变化不一，这是山间早晚的景色。野花开放，有一 股清幽的香味，好的树木枝叶繁茂，形成浓郁的绿荫。天高气爽，霜色洁白，泉水浅了，石底露出水面，这是山中四季的景色。意译法：太阳升起，山林里雾气开始消散，烟云聚拢，山谷又开始显得昏暗，清晨自暗而明，薄暮又自明而暗，如此暗明变化的，就是山中的朝暮。春天野花绽开并散发出阵阵幽香，夏日佳树繁茂并形成一片浓荫，秋天风高气爽，霜色洁白，冬 日水枯而石底上露，如此，就是山中的四季。【教学提示】翻译有直译与意译两种方式，直译锻炼学生用语的准确性，但可能会降低译文的美感；意译可加强译文的美感，培养学生的翻译兴趣，但可能会降低译文的准确性。因此，需两种翻译方式都做必要引导。全文直译内容见《我的积累本》。目标导学四：解读文段，把握文本内容1．赏析第一段，说说本文是如何引 出“醉翁亭”的位置的，作者在此运用了怎样的艺术手法。
微生物感染的病原学检查法
微生物感染的病原学检查法文/ 张力平微生物感染的病原学检查可查明标本中的病原微生物并对其进行种属鉴定，必要时进行药物敏感试验和毒力检查等，从而协助医生对感染性疾病进行病因学诊断、指导合理用药或观察治疗效果。
微生物感染的病原学实验室诊断方法大致包括：①光学显微镜对标本或组织中的病原体的形态学检查；②病原体的分离培养和鉴定；③用免疫学技术对病原体抗原或相应抗体的检测；④用分子生物学方法对病原体特异性基因的检测。
标本的采集与送检微生物学检查的第一步，方法的正确与否直接影响病原体的检出率，因此应注意下述原则：1．采集标本时应无菌操作，尽量避免污染；盛放标本的容器和培养基应预先进行无菌处理并贴好标签。
2．应选择感染部位或病变明显的部位采集标本，避免周围组织、器官或分泌物中的杂菌污染。
例如感染性伤口，应从其深部而不是从表面采集标本；若采集龈沟液检查口腔厌氧菌，应将无菌滤纸条深入龈沟中，停留数秒后取出；怀疑细菌性痢疾时，应采集有粘液或脓血的粪便；采集病毒的标本应尽量含有感染的细胞。
3．根据病原体在感染性疾病的不同时期的体内分布和排出部位选择在最佳时间采集适宜标本。
例如，可疑伤寒的病人，在病程的1～2周内取血液，2～3周时则取粪便或尿液送检；怀疑流行性脑膜炎的病人，应选取脑脊液、血液或皮肤上的出血淤斑进行检测；如果进行病毒培养或其抗原检测，一般应取急性期标本，标本采集越早，病毒的阳性检出率越高。
4．对于怀疑细菌感染的标本，尽量在抗生素使用前采集，特别是对抗生素敏感的病原体，如乙型溶血性链球菌、脑膜炎奈瑟菌。
病毒对抗生素不敏感，故无此限制。
而且用于病毒分离培养的标本应加入抗生素，以避免在病毒培养过程中的细菌污染。
5．检查病原体的特异性抗体IgG时，应采集急性期和恢复期双份血清，只有当恢复期血清抗体效价比急性期的效价明显升高达4倍或以上时，方有诊断价值。
检测血清特异性抗体的标本应保存在-20℃。
6．标本采集后应及时送检。
微生物学细菌感染的检查方法与防治
甲基红 (methyl red) 试验
产气肠杆菌分解葡萄糖产生丙酮酸，后 者经脱羧后生成中性的乙酰甲基甲醇，故 培养液pH＞5．4，甲基红指示剂呈桔黄色， 是为甲基红试验阴性。大肠埃希菌分解葡 萄糖产生丙酮酸，培养液pH＜4．5，甲基 红指示剂呈红色，则为甲基红试验阳性。
枸橼酸盐利用 (citrate utilization) 试验
糖发酵试验
不同细菌分解糖类的能力和代谢产物 不同。例如大肠埃希菌能发酵葡萄糖和 乳糖；而伤寒沙门菌可发酵葡萄糖，但 不能发酵乳糖。即使两种细菌均可发酵 同一糖类，其结果也不尽相同，如大肠 埃希菌有甲酸脱氢酶，能将葡萄糖发酵 生成的甲酸进一步分解为CO2和H2，故 产酸并产气；而伤寒沙门菌缺乏该酶， 发酵葡萄糖仅产酸不产气。
Himalayan palm civet
6+/6
Chinese hare
0+/3
病毒在细胞中增值的指标： 1 细胞变化 2 红细胞吸附 3 干扰现象 4 细胞代谢改变
Uninfected cells
3 days
4 days
Fig. 1
Isolation of SCoV like animal virus in FRhK-4 cell cultures.
检测病毒抗原及抗体方法
对于一些血清型别不多的病毒或在寻常细胞培养 系统中还不能成功增殖的病毒，直接检测抗原是 快速而实用的方法。这一方法要求标本中有一定 量的抗原和具备高质量的抗体；其原则为免疫学 技术，即用特异标记的抗体检测相应的抗原。可 以用免疫荧光或免疫酶标记抗体检测在病毒感染 局部脱落细胞或分泌物细胞中的抗原，也可用酶 联免疫测定法 (ELISA) 或乳胶凝集法检测抗原。 这一方法在数小时或一天内可获得结果。
医学微生物第24章病毒感染的检查方法与防治原则
尽早诊断和治疗，控制病毒复制，减轻病情，降 低并发症的发生率。
公共卫生措施
监测与预警
01
建立健全的病毒监测网络，及时发现疫情，采取有效措施控制
疫情扩散。
卫生宣传教育
02
加强公众的卫生宣传教育，提高公众的自我防护意识和能力。
隔离与控制措施
03
对疑似和确诊病例采取隔离措施，控制传染源，切断传播途径。
04 病毒感染的案例分析
案例一：流感病毒感染的检查与防治
病毒分离与培养
通过采集呼吸道标本进行病毒分 离与培养，是确诊流感病毒感染 的金标准。
抗原检测
利用抗原抗体反应原理，通过采 集鼻咽拭子等标本进行快速检测 。
案例一：流感病毒感染的检查与防治
• 核酸检测：利用聚合酶链式反应（PCR） 技术对病毒核酸进行检测，具有高灵敏度 和特异性。
血清学检查的优缺点
方法简便、快速，可用于回顾性诊断和流行病学调查，但不能用于 早期诊断。
抗原检测
01
02
03
原理
通过检测病毒抗原，确定 病毒的存在。
方法
包括免疫荧光法、酶联免 疫法等。
抗原检测的优缺点
灵敏度高，特异性强，可 用于早期诊断，但可能出 现假阳性或假阴性结果。
核酸检测
1 2
原理
通过检测病毒核酸（DNA或RNA），确定病毒 的存在。
方法
包括反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、实时 荧光定量PCR等。
3
核酸检测的优缺点
灵敏度高，特异性强，可快速诊断，但可能出现 假阳性或假阴性结果，且对检测技术要求较高。
02 病毒感染的防治原则
预防原则
疫苗接种
通过接种疫苗，提高人群免疫 力，预防病毒感染。
常见感染病原体及其检测方法：了解不同微生物的检测方式
常见感染病原体及其检测方法：了解不同微生物的检测方式一、引言感染病原体是指能够进入人体并引发感染的微生物，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等。
这些微生物能够侵入人体，繁殖并对机体造成损害，引发各种感染性疾病。
为了及时、准确地诊断和治疗感染疾病，科学家们开发了一系列的检测方法，用以鉴定不同微生物的存在和病原性。
本文将带您了解常见感染病原体以及它们的检测方法，帮助我们更好地认识和抵抗这些微生物。
二、细菌2.1 培养法培养法是一种传统且常用的细菌检测方法。
它通过将患者样本（如血液、尿液或伤口渗出液等）接种到培养基上，利用培养基提供的适宜条件使细菌繁殖，从而使其形成可见的菌落。
通过观察和分析这些菌落的形态、染色特性和生理生化反应等，可以初步鉴定细菌属种。
2.2 免疫学方法免疫学方法主要利用抗原与抗体之间的特异性反应来检测细菌。
其中，酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫荧光技术是常用的检测方法。
ELISA利用特定的抗体与细菌或其分泌的抗原反应，通过测定产生的光学信号来定量检测细菌的存在。
免疫荧光技术则是在标本中加入荧光标记的抗体，通过观察标本中的荧光信号来判断是否存在细菌感染。
2.3 分子生物学方法分子生物学方法，如PCR和实时荧光定量PCR等，通过检测微生物的核酸特异性序列来定量和鉴定细菌。
这些方法利用特异引物与细菌基因组DNA或mRNA 发生特异性反应，扩增和检测目的序列。
由于其高灵敏度和高特异性，分子生物学方法在实验室中得到广泛应用。
2.4 质谱法质谱法是一种高灵敏度的检测方法，可以对微生物样本进行直接分析。
常用的质谱法包括质谱图谱法（MS）和质谱成像法（MSI）。
MS可以通过检测微生物代谢产物、蛋白质或特定化合物来鉴定微生物。
而MSI则是通过将样本直接贴附在载玻片上，利用激光扫描样本表面进行检测，实现对微生物的快速定性和定量分析。
三、病毒3.1 传统病毒培养法传统病毒培养法是一种检测和鉴定病毒的常用方法。
病毒学病毒感染的检查方法和防治原则讲义
• 医学微生物学 （第9版）
三、病毒感染的诊断
（一）形态学检查
1. 电镜和免疫电镜检查：病毒形态和大小
（李凡主编的第 8 版医学微生物学 图 27-1，258 页）
• 医学微生物学 （第9版）
三、病毒感染的诊断
（一）形态学检查
2. 光学显微镜检查：病毒形成的包涵体、合胞体等
（李凡主编的第 8 版医学微生物学 图 33-2，314 页）
（二）病毒的鉴定
二、病毒的分离与鉴定
1. 病毒感染的常用鉴定方法
（2）病毒血清学鉴定：用已知特异性抗体对病毒进行种、型和亚型的鉴定
• 医学微生物学 （第9版）
（二）病毒的鉴定
二、病毒的分离与鉴定
1. 病毒感染的常用鉴定方法
（3）病毒分子生物学鉴定：对病毒的蛋白抗原和核酸进行检测，方法包括 蛋白印迹技术、核酸扩增、核酸杂交、基因芯片和基因测序等
• 医学微生物学 （第9版）
• 医学微生物学 （第9版）
三、病毒感染的诊断
（二）病毒成分检测
1. 病毒蛋白抗原检测 用已知特异性抗体对病毒抗原进行早期诊断，常用方法酶免疫测定
（enzyme immunoassay，EIA）、免疫荧光测定（immunofluorescence assay，IFA）、蛋白印迹（Western blot）
• 医学微生物学 （第9版）
二、病毒的分离与鉴定
（一）病毒的分离培养
1. 动物接种
（1）应用：无敏感细胞培养的病毒 （2）优点：结果易观察，可建立动物模型 （3）缺点：要有饲养条件，费用高，可能有潜伏病毒，对许多人类病毒不敏感
• 医学微生物学 （第9版）
二、病毒的分离与鉴定
（一）病毒的分离培养
医学微生物学(第9版)第二篇 病毒学 第二十四章 病毒感染的检查方法与防治原则
第一节
病毒感染的检查方法 diagnosis of viral infection
配套题库请下载 医学猫 APP，执业、三基、规培、主治、卫生资格、正副高等题库都已入库。
医学微生物学（第9版）
一、标本的采集与送检
1. 采急性期标本 2. 抗生素处理易污染标本 3. 低温保存，尽快送检 4. 血清学诊断采双份血清（发病初期、病后 2~3 周）
医学微生物学（第9版）
二、病毒的分离与鉴定
（二）病毒的鉴定
3. 病毒的感染性及数量测定 （3）空斑形成试验 （plaque forming test）：
原理：将适量病毒接种单层细胞，病毒增殖使感染的细胞脱落，形成肉眼可见的空斑， 一个空斑即一个空斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：每个空斑是由一个感染 性病毒颗粒形成的。可测定活病毒数量（感染性病毒量的滴度可用 PFU/ml 表示）
配套题库请下载 医学猫 APP，执业、三基、规培、主治、卫生资格、正副高等题库都已入库。
医学微生物学（第9版）
三、病毒感染的诊断
（一）形态学检查
1. 电镜和免疫电镜检查：病毒形态和大小
（李凡主编的第 8 版医学微生物学 图 27-1，258 页）
配套题库请下载 医学猫 APP，执业、三基、规培、主治、卫生资格、正副高等题库都已入库。
配套题库请下载 医学猫 APP，执业、三基、规培、主治、卫生资格、正副高等题库都已入库。
医学微生物学（第9版）
二、病毒的分离与鉴定
（一）病毒的分离培养
2. 鸡胚培养 （1）孵化 9~14 天的鸡胚 （2）优点：对多种病毒敏感，条件易控制，操作简单，成本较低 （3）缺点：无病毒增殖指标；有些病毒可致鸡胚死亡
8病毒感染的分子生物学检验
6、DNA病毒一般比RNA病毒大，生活周期较复杂
10
RNA病毒基因组特点
1. RNA病毒基因组：多为ssRNA，少数dsRNA 2. 基因组所携带的遗传信息都在同一条链上 3. 许多哺乳动物retro-V为双倍体(+) RNA，它可与宿
主基因重组，干扰宿主基因表达调控 4. 变异率很高 5. 复制和转录常独立于宿主细胞核 6. 均需经逆转录完成基因组复制，错误率高
毒基因表达有关
27
HBV基因组编码产物
病毒颗粒装配，基因组复制，基因表达调控
➢ S基因区→ 外膜蛋白(HBsAg等) ➢ C基因区 → e抗原（HBeAg）
pre-C → 前-C蛋白 C区→ C蛋白(HBcAg)
➢ P基因区→ HBV多聚酶蛋白 ➢ X基因区→ X蛋白（HSxAg）
28
36
HBV耐药性分析
➢ 抗HBV药物：核苷酸类似物（拉米夫定lamivudine，阿德
福韦adefovir等） 服拉米夫定0.5-1年，20%患者产生耐药，服2年，38%耐
药，服4年，66%耐药…
➢ HBV发生耐药突变后肝功能恶化的比例显著增高 ➢ 耐药原因：HBV变异较高
病毒复制须经过RNA中间体的逆转录过程，DNAP具逆转 录酶性质，缺乏严格的校正功能
病毒复制水平下降，病毒蛋白合成减少，血清中 标志物滴度下降 ➢ 功能复杂，能直接或间接损害宿主细胞，导致肝 细胞凋亡、死亡、癌变
34
HBV的分子生物学检验
➢ 病毒核酸的检测 ➢ 病毒的耐药性分析 ➢ 病毒的基因分型
35
HBV核酸检测
HBV DNA是病毒复制和传染性的直接标志 ➢ 普通PCR：特异性引物（保守区） ➢ 荧光定量PCR：灵敏度高，量化 ➢ 支链DNA：灵敏度较低，检测范围较窄 ➢ 核酸杂交：特异性高，灵敏度较低 ➢ 基因芯片：多位点（保守区）
试述病毒微生物学诊断的方法与流程
试述病毒微生物学诊断的方法与流程咱来唠唠病毒微生物学诊断这事儿哈。
一、标本采集。
这可是很关键的一步呢。
你得根据怀疑的病毒类型和感染部位去采集标本。
比如说吧，如果怀疑是呼吸道病毒感染，那像鼻咽拭子就很重要啦。
要是肠道病毒，那便便标本就少不了。
采集的时候一定要注意哦，得按照正确的方法来，不然标本不合格，后面的诊断就都白搭了。
就像你做饭，食材要是没选好，做出来的菜肯定也不好吃呀。
二、标本运送。
采好标本了就得赶紧送实验室。
这个过程可不能慢悠悠的，因为有些病毒很脆弱，在外界环境里待久了就可能死掉或者发生变化。
就像你送个小宝贝去某个地方，得小心翼翼还得快快的，不能让小宝贝在路上出啥岔子。
三、病毒的分离培养。
实验室里呢，有时候会进行病毒的分离培养。
这就像是给病毒盖个小房子，让它们在里面生长繁殖。
不过这个过程可不容易，不同的病毒需要不同的培养条件。
有些病毒需要特定的细胞来培养，就像不同的小动物要住在适合自己的小窝里一样。
而且这个培养的时间有时候还挺长的，要耐心地等着病毒慢慢长大。
四、病毒的形态学检查。
这一步就有点像给病毒拍个照片，看看它长啥样。
可以用电子显微镜来观察病毒的形态。
从显微镜里看到那些奇奇怪怪的病毒形状，就像发现了外星小生物一样有趣呢。
通过病毒的形态，能初步判断是哪种病毒哦。
五、血清学诊断。
这是看我们身体里的免疫反应啦。
检测血液里的抗体，如果抗体水平很高，那就说明我们的身体可能正在和病毒打仗呢。
就像身体里的小战士们在和病毒这个小怪兽战斗，然后留下了战斗的痕迹，我们就是通过检测这些痕迹来判断是不是感染了病毒。
六、核酸检测。
现在这个可流行啦。
检测病毒的核酸，就像找到病毒的小密码一样。
这种方法又快又灵敏。
如果在标本里发现了病毒的核酸，那基本上就能确定有病毒存在啦。
总之呢，病毒微生物学诊断是个很复杂但是又很有趣的过程。
每一步都很重要，就像一个小链条上的一个个小环，缺了哪一个都不行呢。
病毒感染微生物学检查方法浅谈共34页
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
病毒感染微生物学检查方法浅谈
56、死去何所道，托体同山阿。 57、春秋多佳日，登高赋新诗。 58、种豆南山下，草盛豆苗稀。晨兴 理荒秽 ，带月 荷锄归 。道狭 草木长 ，夕露 沾我衣 。衣沾 不足惜 ，但使 愿无违 。 59、相见无杂言，但道桑麻长。 60、迢迢新秋夕，亭亭月将圆。
▪
谢谢！
34
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
观察CPE。常见的细胞形态学变化为细胞变圆、坏死、 溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能形成包涵体。
正常细胞
病变细胞
2. 血吸附和血凝作用
多见于以出芽方式释放的病毒。
感染细胞具有吸附红细胞的能力
感染细胞的培养液中有许多游离病毒存在，具有凝集红细胞
的作用
（1）血吸附作用
吸附试验可通过特异抗血清抑制来达到鉴定
具有吸附特性的病毒
正常细胞
红细胞吸附
（2）血凝作用
血凝试验
血凝抑制试验
（3）病毒成分的直接检测 用免疫学或分子生物学技术直接检查感染 细胞或其上清液中病毒抗原（或核酸）。
三、 电子显微镜检查
病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借
助电子显微镜进行检查。对于目前尚难培养而形态 又非常典型的病毒，可直接从感染组织或分泌液， 或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子 显微镜检查，直接观察病毒粒子。
六、 感染组织的组织学检查
病毒在光学显微镜下无法看到，但是在某些
病毒感染细胞内出现包涵体，或者细胞形态发生
变化，则对诊断有重要意义。如Negri氏包涵体
是狂犬病犬脑细胞的特征。病理组织或渗出液作
成涂片检查包涵体时，常用苏木紫-伊红染色法。
狂犬病毒包涵体（Negri body）
酶标记染色
四、 血清学试验
是一种常用的诊断病毒病的方法。可采用
ELISA、琼脂扩散、中和试验、标记抗体技术
等免疫血清学方法检查病畜的抗体消长情况和
发病组织中的病毒抗原。
1.中和反应
观察特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡，能否 抑制病毒的细胞病变效应。凡能与病毒结合，使其失 去感染力的抗体又称中和抗体。
病毒感染的检查方法
标本采集与送检
病毒的分离鉴定 电镜技术
血清学试验
分子生物学技术
一、标本采集与送检
（一）供分离病毒、检出核酸及抗原的标本
原则： 1.尽早采取：发病初期 2.部位适宜：由感染部位采取 3.冷藏速送：装有冰块或干冰的容器内
（二）检测特异性抗体 的标本
采集双份血清，4-20℃保存
病毒材料采集与检验结果的关系
virus
2.补体结合反应
Ag
Ab Ag
红细胞
补体
溶血素
溶血
（ -）
红细胞
补体
不溶血 （+）
溶血素
Ab
3.免疫扩散
4.酶联免疫吸附试验 （ELISA）
将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并
保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗 原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体 或抗原发生反应。然后加入酶的作用底物催化显 色，进行定性或定量测定。
（1）间接ELISA
（2）夹心ELISA
五、分子生物学技术
3′ 5′ 3′
1. 聚合酶链反应 （PCR）
5′
模板DNA双链
3′ 5′
5′ 3′
变性
3′ 5′ 3′
5′
3′
5′ 3′
退火
5′
3′ 5′ 3′ 5′
5′ 3′ 5′ 3′
形成新的双链 DNA
2. 核酸杂交技术 核酸探针（probe）是指能与特定核酸序列 发生特异性互补的已知核酸片段，可检测 待检样品中特定的基因顺序。
采取标本的时期 潜伏期及前驱期 检查病毒及其成分 较难查见 最多查见 测定抗体 未增多
刚发病或急性期
未增多或增 多不明显 明显增多
（常超过4倍）
恢复期及康复期
很难查见
二、常规分离与鉴定
病毒分离是诊断病毒感染的金标准，成本高，阳性 检出率低等
透射电子显微镜
1. 正染法：超薄切片法
浸透 清洗与 脱水 包埋 聚合
取材
固定
戊二醛
四氧化锇
铀染
切片
染色
铅染
鸡痘病毒（超薄切片）
超薄切片法的优缺点：
优点：可观察病毒形态和形态发生过程
缺点：操作复杂，费时，但标本可长时间保存
2.负染技术
负染是指通过重金属盐在样品四周的堆积而 加强样品外周的电子密度，使样品显示负的 反差，衬托出样品的形态和大小。
（1）免疫凝集电镜技术
抗原与抗体凝集反应后，可使标本中病毒颗粒聚 集成团，再经负染直接在电镜下观察，提高了敏 感性，确定病毒的血清学性质。
（2）免疫电镜定位技术
特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、过氧化物酶等标 记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察 到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。
有时不得不分离病毒，例如发现了一种新的病毒病， 必须分离病毒进行研究，或者分离株的鉴定对流行 病学有很大作用（如流感病毒），或者需要培育疫 苗，或者希望获得天然弱毒株等。
（一）病毒分离
标本采集
杀灭杂菌
（青链霉素）
易感动物 出现病状 病变或死亡 细胞病变
接种
三大方法
鸡胚
细胞培养
鉴定病毒种型
（二）病毒鉴定
口蹄疫病毒的电镜负染
负染法的优缺点： 优点：快速简易（10-20min）；分辨率高；图象清晰
地病毒结构
缺点：敏感性低，要求病毒量在107以上；所有样品应处
于悬浮状态
3.免疫电镜技术(Immune electron microscopy，IEM)
免疫电镜技术是将抗原抗体反应的特异性与电 子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微 结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高 度精确、灵敏的方法。