DNA测序方法

哌啶甲酸可以使 哌啶甲酸可以使 DNA 链上的嘌呤在酸的作用下 发生糖苷水解，导致 DNA 链在脱嘌呤位点（G和 链在脱嘌呤位点（G A）发生断裂。 肼，又称联氨 NH2.NH2 ，在碱性环境中作用于 ，又称联氨 胞嘧啶 C 和胸腺嘧啶 T 的 C4 和 C6 位置，导致糖 苷键断裂。如果加入高浓度的盐（1.2M NaOH）， 苷键断裂。如果加入高浓度的盐（1.2M NaOH）， 肼则主要作用于胞嘧啶 C ，使之断裂。 作为标记用的放射性同位素主要有 γ-32Ｐ（[γ-32 32Ｐ（[γＰ]ATP，[γ-32Ｐ]GTP. [γ-32Ｐ]TTP ，或[γ-32 ]ATP，[γ-32Ｐ [γ-32Ｐ ，或[γＰ]CTP）。 ]CTP）。
DNA 样 品 TATGCAATCTAG 与基因芯片上 65,000 种可能的 八聚体进行杂交从而形成特定 的结合图形 1 ATACGTTA 2 2 CGTTAGAT GTTAGATC
4 CGTTAGAT 4 AC源自文库TTAGA
3 3 ACGTTAGA TACGTTAG 5 GTTAGATC 1 ATACGTTA 3 4 2 5 TACGTTAG ACGTTAGA CGTTAGAT GTTAGATC 互补序列为：ATACGTTAGATC 样品序列为：TATGCAATCTAG 计算机 分析杂交图象 并由探 针的重叠情况 推导样品的核酸序列
MaxamMaxam-Gilbert 化学降解法测序
基本原理： 将一个 DNA 片段的 5' 端磷酸基作放射性标 记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂 解特定碱基，从而产生一系列长度不一而 5' 端被标记的 DNA 片段，这些以特定碱基结 尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射 线自显影，确定各片段末端碱基，从而得 出目的 DNA 的碱基序列。
硫酸二甲酯[dimethyl 硫酸二甲酯[dimethyl sulphate ，DMS ， （CH3O）2SO2]是一种碱性化学试剂，可 CH3O）2SO2]是一种碱性化学试剂，可 以使 DNA 链上的腺嘌呤 A 的 N2 和鸟嘌呤 G 的 N７ 甲基化，但是鸟嘌呤 G 的 N７ 甲 基化速度比腺嘌呤 A 的 N2 甲基化速度要快 4-10 倍，并且在中性 pH 环境中， DMS 主 要作用于鸟嘌呤 G ，使之甲基化，导致糖 苷键断裂。
DNA测序原理与方法 DNA测序原理与方法
DNA测序：是对DNA DNA测序：是对DNA 分子的一级结构的分 析。其基本原理是DNA 析。其基本原理是DNA 的复制反应体系中 需要存在DNA 聚合酶、DNA 需要存在DNA 聚合酶、DNA 模板、寡核苷 酸引物和dNTP，引物和模板退火形成双链 酸引物和dNTP，引物和模板退火形成双链 后，DNA 后，DNA 聚合酶在引物的引导下在模板链 上沿3 →5’的方向移动，dNTP 上沿3’→5’的方向移动，dNTP 按照碱基配 对原则，逐个连接在引物的3 对原则，逐个连接在引物的3’-OH 末端。
双脱氧链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 基因芯片测序
双脱氧链终止法测序(the chain
termination method) 基本原理： 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链， 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链， 由于合成的互补链可在不同位置随机终止 反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子， 反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子， 从而来读取待测DNA分子的顺序。 从而来读取待测DNA分子的顺序。
芯片测序
原理：杂交测序方法，即通过与一组已知 序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的 方法。在一块基片表面固定了已知序列的 八核苷酸的探针，当溶液中带有荧光标记 八核苷酸的探针，当溶液中带有荧光标记 的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯 的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯 片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时， 通过确定荧光强度最强的探针位置，获得 通过确定荧光强度最强的探针位置，获得 一组序列完全互补的探针序列。据此可重 组出靶核酸的序列。
用于终止反应的双脱氧核苷酸： 用于终止反应的双脱氧核苷酸： 将2’ ，3’ –双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到 双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到 新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺 新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺 乏3’ –羟基，因此不能与下一位核苷酸反应 形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。 形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。
自动化测序
基本原理： 基本原理： 与链终止法测序原理相同, 与链终止法测序原理相同,只是 用不同的荧光色彩标记ddNTP,如 荧光色彩标记 用不同的荧光色彩标记ddNTP,如 ddATP标记红色荧光, ddTTP标记绿 ddATP标记红色荧光 ddTTP标记 标记红色荧光, 标记绿 色荧光,ddCTP标记 色荧光, 标记蓝 色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标记黄色荧光,.由于每种 ddGTP标记黄色荧光 由于每种 标记黄色荧光,. ddNTP带有各自特定的荧光颜色 ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而 带有各自特定的荧光颜色, 简化为由1个泳道同时判读4种碱基. 简化为由1个泳道同时判读4种碱基.
Maxam-Gilber法所能测定的长度要比Sanger法短一些，它 Maxam-Gilber法所能测定的长度要比Sanger法短一些，它 对放射性标记末端 250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。 250个核苷酸以内的 个核苷酸以内的DNA序列 序列效果最佳。 Sanger 法需要单链模板和特异寡核苷酸，并需获得大肠杆 菌DNA 聚合酶IKlenow 片段的高质量酶制剂，而Maxam聚合酶IKlenow 片段的高质量酶制剂，而MaxamGilbert法只需简单化学试剂。 Gilbert法只需简单化学试剂。 随着M13 随着M13 噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成 引物唾手可得及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法 引物唾手可得及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法如今 双脱氧链终止法如今 远比Maxam-Gilbert法应用得广泛 远比Maxam-Gilbert法应用得广泛。 广泛。 然而，化学降解较之链终止法具有一个明显的优点： 然而，化学降解较之链终止法具有一个明显的优点：所测 优点 序列来自原DNA 分子而不是酶促合成所产生的拷贝。因 序列来自原DNA 分子而不是酶促合成所产生的拷贝。因 此，利用Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序， 此，利用Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序， 可以分析诸如甲基化等DNA 可以分析诸如甲基化等DNA 修饰的情况。 由于Sanger法既简便又快速，因此是现今的最佳选择方案。 由于Sanger法既简便又快速，因此是现今的最佳选择方案。 目前大多数测序策略都是为Sanger法而设计的 法而设计的。 事实上，目前大多数测序策略都是为 事实上，目前大多数测序策略都是为Sanger法而设计的。