基于 Orbitrap GC-MS 的非靶向代谢组学

1.000
0.015
0.001
0.026
156.1203 16.88 1169362271 1.0 3.6 3.9 5.1
1.000
0.000
0.000
0.007
5
使用 SIMCA 软件进行多变量统计分析。5将结论数据转化为更为直观的对数值，将 Y 类别设为各时间点，生成数据的偏最小二乘 判别分析（PLS-DA）模型。该软件生成分数图和载荷图，以显示沿着主成分每个时间点的聚类和分离（图 6）情况。从本次分析 可知，死亡后立即取样的样品（RAT_T0）聚集在一起，与已分解的大鼠样品（T1–T3）具有显著性差异。从 T1–T3 样品中可以观 察到分组聚类和持续分解。X 或 Y 轴上的位移表示某一代谢物对分数图中样品群组之间分离的作用大小。在本例中，X 轴将 T0 与 T1–3 分开，Y 轴将 T1、T2 和 T3 分开（图 6）。载荷图上的每个蓝点表示每个已检测到的含 EI 碎片离子簇的代谢物（图 7）。
T0 T1 T2 T3 30
20
10
t [2]
0
-10
-20
-30
-40 -80
-60
-40
-20
0
20
40
60
t [1]
R2ⅹ [1] = 0.385
R2ⅹ [2] = 0.127
E11ipse: Hote11ing's T2 (95%)
SIMCA 13.0-31/03/2015 11:47:15(UTC-1)
数据处理
数据分析流程首先使用 MSConvert（ProteoWizard 套件1的一 部分）将原始数据文件转换为 MzXML 文件。使用 XCMS 包2 和 centWave 算法提取峰。已检测到的峰以 PeakML 格式输出， 然后使用 MzMatch.R 包对已检测到的峰进行后处理（过滤每 组重复进样的最低检测值、相对标准偏差和对 EI 碎片组进行分 组的相关性匹配）。3生成的文本文件输出使用 IDEOM 软件4 进 行单变量统计处理，使用 SIMCA™ 13.0.35 进行多变量统计处 理。使用 Thermo Scientific 解卷积软件进行峰簇识别和解析。
入口（℃）
250
入口模块和模式
SSL，分流 1:60
载气（mL/min）
He，1.2
柱温箱温度程序
温度 1（℃）
70
保持时间（min）
2
温度 2（℃）
325
速度（℃/min）
10
保持时间（min）
8.5
表 2. 质谱仪参数
Q Exactive GC 质谱仪参数
传输线（℃）
275
电离类型
EI
离子源（℃）
基峰质量数 RT
最大强度
T0
T1
T2
T3
T0:T0
T1:T0
T2:T0
T3:T0
219.1100 10.71 507930367 1.0 2.7 3.4 4.5
1.000
0.008
0.000
0.003
232.1184 11.78 291673570 1.0 1.5 1.6 2.1
1.000
0.043
关键词
法医学；代谢组学；多变量统计分析；Q Exactive GC 系统
引言
代谢组学旨在表征和定量生物系统中的完整小分子代谢通路或 代谢物组。代谢物组包含小分子多元混合物（包括氨基酸、糖 和磷酸糖、生物胺和脂质）。非靶向代谢组学极具挑战性，因 为其要求定性和定量上百个不同种类化合物，而有关这些代谢 物的经验知识有限。因此，有必要使用一个既可以以非靶向的 方式灵敏检测特定分子，又可以提供精确质量数信息，用于确 认未知物并对其进行结构解析的检测系统。
仪器和方法设置
样品制备 从各个大鼠腿部肌肉组织切片取样，以时间顺序增加进行尸检 及采样。采用氯仿/甲醇/水（1:3:1）提取经匀质的组织切片中 的代谢物，在冰块下孵育 1 小时。蛋白质和 DNA 进行离心沉 淀。去除上清液，贮藏在 -80 ℃ 条件下备用。
2 样品衍生化 移取 200 µL 提取液至 1.5 mL 硼硅玻璃小瓶中，加盖 9 mm 螺 丝盖。然后，将样品置于 Thermo Scientific™ Reacti-Vap™ 蒸 发器中，在 30 ℃ 条件下以低流速氮气流干燥 60 min。以下所 有衍生化步骤均采用 Thermo Scientific™ TriPlus™ RSH 自动 样品处理器进行。 加入 20 µL 20 mg/mL（w/v）甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液至 每个干燥小瓶中。将小瓶涡旋 10 秒并在 30 ℃ 条件下孵育 60 min。甲氧基化步骤完成以后，加入 30 µL MSTFA +1% TMCS（N-甲基-N-（三甲基硅基）三氟乙酰胺+1％三甲基氯 硅烷）的混合液，进一步涡旋 30 秒。将小瓶置于 45 ℃ 条件 下孵育 60 min 进行硅烷化。将样品冷却至室温以备进样。
0.04
0.02
W*c [2]
使用单变量 统计分析
使用谱库识别特征峰 生物学解析
图 1. Q Exactive GC 系统代谢组学研究的工作流程。以不同颜色显示 工作流程包中的任务分工：绿色用于生物技术人员；橙色用于实验室 技术人员；紫色用于仪器操作人员；蓝色用于生物学信息处理人员。
3
相对丰度
分钟
图 2. 大鼠肌肉组织样品代谢 0–3 天后的 GC-MS 色谱图（自上而下天数增加），X 轴为保留时间，Y 轴为强度（固定为1E9 计数）。例如，记下
结果和结论
将八只大鼠尸体置于室温下四天。每日提取肌肉组织进行分 析，共检测 16 个样品中代谢物浓度的变化以分析尸体分解程 度。对样品进行随机分析以减小系统误差。代谢组学优化后的 分析流程见图 1。
表 1. GC 温度程序
TRACE 1310 GC 参数
进样量（µL）
1.0
衬管
单锥形（P/N 453A1345）
4
相对丰度
Component spectrum
酪氨酸 – 三甲基硅脂 – 匹配：818，R 匹配：891，概率：82.8%
Library spectrum
图 5. 数据分析流程的总结。对原始数据进行峰检测和解卷积（a），然后将其以基峰的形式显示在 IDEOM 代谢组学软件中（b），含定量信息和 定量统计方法。IDEOM 软件也提供定量图形信息（c），该图显示了每种条件下的平均强度和标准偏差，本例中每种条件下含四份相同的生物样 品。使用 NIST 库归属目标峰，（d）证实了质谱数据的匹配的结果，图下方含已归属衍生化氨基酸的Nist分数值。
GC-MS 分析 所有实验均采用 Thermo Scientific™ Q Exactive™ GC 组合型 四极杆 Orbitrap 质谱仪进行。采用 TriPlus RSH 自动进样器 进样，采用 Thermo Scientific™ TRACE™ 1310 GC 色谱仪和 Thermo Scientific™ TraceGOLD™ TG-5SilMS 15 m × 0.25 mm I.D. × 0.25 µm 薄膜毛细管柱（P/N: 26096-1301）进行 色谱分离。仪器参数的其他详细信息见表 1 和表 2。
本项研究展示了新型 Thermo Scientific™ Orbitrap™ GC-MS 完整非靶向代谢组学工作流程，检测了大鼠模型中的生物标记 物，以判定其死亡时间。死亡时间（PMI）推断是法医调查中 一项最关键也是最困难的任务，尤其当尸体温度与周围环境温 度达到平衡后。由于当前用于确定 PMI 的方法不精确性且以 目视检查尸体为主。因此，建立一种实验方法，使用耐用生物 标志物推断死亡时间可辅助法医调查。
0.055
0.030
232.1184 12.41 941914122 1.0 5.9 8.5 11.0
1.000
0.013
0.001
0.002
156.0840 15.32 1163630714 1.0 2.1 1.9 2.0
1.000
0.019
0.008
0.021
174.1128 16.18 203636192 1.0 2.5 3.2 5.0
气相色谱质谱联用仪（GC-MS）基于其自身的优点经常用于 代谢组学分析，尤其是其色谱分辨率、重现性、峰容量和便于 使用的质谱库。GC为非靶向代谢组学中生物标志物的发现提 供了卓越的色谱分离能力，但是，由于目前缺乏高端质谱仪的 支持，从而限制了提供用于分析复杂样品（例如，哺乳动物的 肌肉组织）的动态范围、精确质量数和扫描速度。鉴于大部分 重要代谢物的极性特征，必须将其衍生化，以使其有效挥发， 从而确保得到良好的色谱分离。代谢组学分析尤其是临床代谢 组学要求高通量和先进的自动化技术。
230
电离能量（eV）
70
采集模式
全扫描
质量数范围（m/z）
50–750
质量数分辨率（m/z 200 时的 FWHM） 60,000
质量数内标的质量数（m/z）
207.03235
样品提取
干燥样品
GCMS 进样 原始采集数据
加甲氧胺衍生化
加 MSTFA 衍生化
解卷积并检测峰簇 样品分组
使用多变量 统计分析
图 6. 分解数据的 PLS-DA 模型。该模型为有监督多变量分析，将高维数据（例如，大量强度不同的代谢物）折叠为涵盖数据集中主要变化的几种主 成分。在本例中，X 轴是主成分 1，Y 轴是主成分 2。注意，本项研究对样品进行了适当聚类，每个群组聚集在一起，T0 已明显与其他群组分开。
0.06
● W*c [2]
该 GC-MS 装置使用基于 Orbitrap 的检测器，得到超高质量
数分辨率、亚 ppm 质量数精度、宽动态范围以及一定的扫描 速度，用于有效定量极复杂代谢组学样品。高分辨率、稳定的 质量数精度和快速的扫描速度是进行稳定的数据解卷积的关 键因素，以检测重叠 TIC 峰中的化合物，进行非靶向代谢组 学分析。电子轰击电离（EI）裂解模式也适合基于应用广泛的 NIST 库和 Wiley 库进行匹配，以识别化合物，同时为更深入的 表征提供精确质量数。
表 3. 已检测峰簇的定量矩阵。基峰（峰簇中强度最大的峰）、保留时间（RT）和检测到的最大强度见第 1–3 列。将 T0 的强度归一化为 1，其他 时间点的强度与 T0 强度相比并视情况以不同颜色显示，见第 4–7 列。第 8–11 列包含每项比值的 T 检验 P 值。
T 检验： T 检验： T 检验： T 检验：
高亮区域中峰强度随时间的变化。
BP: 218.10272 @ 5.44E+008
化合物发现阶段 Q Exactive GC 系统获取了每个样品的全扫描色谱图（图 2）。 该系统在较宽的动态范围内采集不同浓度水平代谢物的全扫描 色谱图，不会丢失任何精确质量数信息。使用自动峰选取（结 合使用 XCMS 和 MzMatch.R）功能提取每个 EI 峰簇。在该步 骤中，已检测到 1193 个明显峰簇并进行了初步定量，强度阈 值为 100,000。已解卷积峰簇的示例见图 3。
P 值（T 检验）
4.00E+008
2.00E+008
0.00E+000 16.92232 16.97232
17.02232
17.07232 17.12232 17.17232
图 3. 已解卷积峰簇被推断识别为酪氨酸。
17.22232
wenku.baidu.com
T0/T3
强度比
图 4. 发生显著性变化代谢物的火山图。每个代谢物以深蓝色菱形表示。 强度比（X 轴）是指 T0/T3 时代谢物的倍数变化，Y 轴显示代谢物的 P 值。因此，右上方和左上角的代谢物是倍数变化最大且最具有统计学意 义的代谢物。
定量阶段 首先使用单变量统计方法分析结果。使用 Student's t 检验对比 每个时间点和时间零点。将每个代谢物的平均 T0 强度设为 1， 倍数变化显示为 1 的倍数值，以方便对比强度明显不同的代谢 物（图 4 和图 5）。已检测到 272 个代谢物的平均强度发生显 著性变化（P 值小于 0.05），包含已检测峰簇的定量矩阵示例 见表 3。
AN 10457_C_GCMSMS_201508Y
基于 Orbitrap GC-MS 的非靶向代谢组学
Stefan Weidt,2 Bogusia Pesko,2 Cristian Cojocariu,1 Paul Silcock,1 Richard J. Burchmore,2 and Karl Burgess2 1Thermo Fisher Scienti c, Runcorn, UK 2Glasgow Polyomics, University of Glasgow, Glasgow, UK