2015版药典微生物限度微生物无菌方法学验证流程
版药典微生物限度检查方法验证方案
版药典微生物限度检查方法验证方案验证微生物限度检查方法的方案一、实验目的：验证药典中的微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性。
二、实验材料：1.药典中规定的微生物限度检查方法；2.待验证的药品样品；3.适用的培养基和培养条件；4.培养基的质量控制菌种。
三、实验步骤：1.制备适用的培养基：按照药典中规定的方法和成分制备适用的培养基，并进行批次记录。
2.准备质量控制菌种：3.制备菌液悬液：从购买的质量控制菌种中，挑取一株菌种进行连续传代培养至活性最佳的生长阶段。
然后制备菌液悬液，以备后续试验使用。
4.扩大悬液应用范围：从第3步得到的菌液悬液中，取适量接种于适用培养基上，培养出代表性的细菌菌液悬液。
然后，通过菌液的光学检测、显微镜检查和菌落计数，确定菌液的细菌浓度。
5.验证方法的准确性：将待验证的药品样品加入培养基，根据药典中的方法将培养基分成不少于3组。
每组培养基中分别加入一定量的菌液悬液，并在药典规定的温度和时间下培养。
同时，设置对照组，只加入菌液悬液和培养基。
6.菌落计数：取适量的培养基样品，分别进行菌落计数，并根据培养基的数量、培养基总菌落数、对照组的菌落数等数据，计算菌落形成单位。
7.验证方法的可靠性：将待验证的药品样品按照药典中的方法进行连续验证，至少重复3次。
然后，对比不同验证结果的一致性和稳定性，评估方法的可靠性。
8.验证方法的可行性：根据实际的样品情况和验证结果，评估方法在操作上和技术上的可行性。
如，是否存在样品的特殊要求，检测方法是否能满足检测要求等。
四、数据处理与分析：根据实验结果的菌落计数和验证的次数，进行数据处理和统计分析。
评估验证结果的一致性、可靠性和可行性。
五、结论：根据实验结果和数据分析，得出关于药典中微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性的结论。
如果验证结果与药典一致，说明方法可靠并可以使用。
如果验证结果与药典不一致，需要进一步分析原因和进行修正或优化。
2015版中国药典四部微生物限度
2015版中国药典四部微生物限度中国药典是我国医药行业的重要规范，其中微生物限度是其中一个关键内容。
微生物限度是指药品中允许存在的微生物数量的上限。
它对药品的质量和安全性提出了严格要求。
2015版中国药典中明确了药品微生物限度的标准和方法，以保障药品的质量和使用的安全性。
一、微生物限度的定义和意义微生物限度是指在药品中存在的微生物数量的上限。
它是衡量药品质量和安全性的重要指标之一。
由于微生物对人体健康有潜在的危害，药品中过多的微生物污染可能导致药品的变质和降解，甚至引起严重的药品安全问题。
因此，微生物限度的控制是确保药品质量和安全性的关键步骤之一。
二、微生物的限度标准和分类微生物限度的标准和分类在2015版中国药典中得到了详细说明。
根据药品的特性和用途不同，微生物限度标准和分类也有所差异。
常见的微生物限度分类包括细菌总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌等。
各类微生物的限度标准和方法在药典中都有详细描述，以确保药品的质量和安全性。
三、微生物限度的检测方法为了准确检测微生物限度，2015版中国药典提供了一系列的微生物检测方法。
常见的方法包括菌落总数的测定、大肠菌群的测定、霉菌和酵母菌的测定等。
这些方法要求检测人员具备专业的技术和操作能力，确保检测结果的准确性和可靠性。
四、微生物限度的控制措施为了保证药品的质量和安全性，生产企业需要采取一系列的控制措施来控制微生物限度。
这些措施包括原料和辅料的检验、生产环境的控制、生产工艺的严格执行和产品的质量控制等。
通过全面有效的控制措施，企业可以确保药品的微生物限度在合理的范围内，从而保证药品的质量和安全性。
五、微生物限度的意义和前景微生物限度的控制是保障药品质量和安全性的重要手段，它直接影响着人们的生命健康。
随着人们对药品质量和安全性的要求越来越高，对微生物限度的控制也越来越严格。
中国药典不断完善微生物限度标准和方法，为药品生产和使用提供了规范和指导。
未来，微生物限度的研究和控制将成为药品质量控制的重要方向。
2015版中国药典微生物限度解析
（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
• 供试品微生物计数中所使用的培养基应进 行适用性检查。
• 供试品的微生物计数方法应进行方法适用 性试验【10版：方法验证】， 以确认所 采用的方法适合于该产品的微生物计数。
• 若检验程序或产品发生变化可能影响检验 结果时， 计数方法应重新进行适用性试 验。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
2015版中国药典纯化水微生物限度检测方法验证方案
2015版中国药典纯化⽔微⽣物限度检测⽅法验证⽅案1. 审批起草⼈签名：审核⼈签名：批准⼈签名：2. ⽬录1.审批 (1)2.⽬录 (2)3.⽬的 (3)4.范围 (3)5.职责 (3)6.执⾏程序 (4)7.描述 (4)8.⽅法验证 (4)8.1.⼈员培训 (4)8.2.⽂件确认 (5)8.3.仪器确认 (5)8.4.供试品确认 (6)8.5.培养基及缓冲液确认 (6)8.6.菌种确认 (7)8.7.培养基 (7)8.8.菌种：枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌。
(7)8.9.供试品制备 (8)8.10.试验结果 (9)8.11.验证结果分析与评价 (10)9.偏差处理 (10)10.变更控制 (10)11.附件⽇志 (11)12.再验证 (11)13.参考书⽬ (11)14.修订历史 (12)3. ⽬的纯化⽔微⽣物限度检查采⽤薄膜过滤法，验证该⽅法适⽤于纯化⽔中需氧菌总数的测定。
4. 范围本验证⽅案适⽤于上海XXXX有限公司QC实验室，对纯化⽔微⽣物限度检查⽅法（薄膜过滤法）适⽤性的验证。
5. 职责5.1. 验证⼩组组成：5.2. 验证⼩组组长负责5.2.1. 组织起草或审核验证⽅案及变更申请；5.2.2. 对验证⼩组成员进⾏培训；5.2.3. 验证⽅案的组织实施；5.2.4. 对验证过程中的记录审核，保证其真实性、可靠性和完整性；5.2.5. 组织验证报告的起草、汇总并参与对其进⾏审核及验证周期的拟定。
5.3. QA参与⼈员负责5.3.1. 审核验证⽅案、报告及报告中出现的偏差、变更；5.3.2. 参与验证⽅案的实施及评价；5.3.3. 对验证⽅案及报告进⾏编号并纳⼊验证⽂件系统且归档。
5.4. QC参与⼈员负责5.4.1. 起草验证⽅案；5.4.2. 已经批准的验证⽅案的具体实施；5.4.3. 收集测试数据，应评估数据并对测试数据做出评论；5.4.4. 参与偏差调查、变更申请等；5.4.5. 起草验证报告。
2015年版中国药典微生物限度检查方法验证方案
2015年版中国药典微生物限度检查方法验证方案佛山市华普生药业有限公司文件编码：TS-VP-4201-00页数：1/56 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案起草部门：QC组签名：日期：审核部门：QC组签名：日期：部门：质量部签名：日期：批准质量负责人签名：日期：质量部颁发本文件根据需要应分发于以下部门：01 质量部下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
佛山市华普生药业有限公司文件编码：TS-VP-4201-00页数：2/56 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案文件编号修订原因修订日期TS-VP-4201-00 按GMP（2010年修订版）要求新制定2015.10.22佛山市华普生药业有限公司文件编码：TS-VP-4201-00页数：3/56 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案目录1. 概述2. 验证目的和范围3. 组织及职责4. 验证进度计划表5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认7.验证项目和验证方法7.1试验菌株7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法8.偏差与漏项控制佛山市华普生药业有限公司文件编码：TS-VP-4201-00页数：4/56 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案9.验证报告会审佛山市华普生药业有限公司文件编码：TS-VP-4201-00页数：5/56 人工牛黄甲哨唑胶囊微生物限度检查方法验证方案1. 概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。
参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。
微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则)
霉菌与酵母菌总数、控制菌得检查。
二、引用标准：《中国药典》２015年版（通则1１05-1106）三、目录1。
微生物限度标准2.设备、仪器及用具3。
消毒液、稀释剂、试液及培养基4。
检查总则(通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法,通则1106非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法）5。
微生物计数法检查6.控制菌检查法7．实验技术8、附件１.微生物限度标准非无菌药用原料及辅料得微生物限度标准(2)．目测霉变者以不合格论。
（３）。
“无”为标准依据或无相应规定。
准依据或无相应规定.2.设施、仪器及用具2、１、设施：2、１、1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查得要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染得措施不得影响供试品中微生物得检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
２、1、2．其她设备:高压蒸汽灭菌器;细菌培养箱(3０~3５℃);霉菌培养箱(２5～2８℃)；电炉(或其她适宜得加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱(250~３00℃)；电冰箱。
生化试剂储存箱。
2、2仪器及器皿2、2、1。
菌落计数器；显微镜（15０0X）;电子天平或药物天平（感量0、1ｇ）;ｐH 系列比色计。
2、2、2．玻璃器皿：锥形瓶(2５０~３００ml,内装玻璃珠若干)、研钵（玻璃或陶瓷制,∮10～12ｃm)、培养皿（∮9 ｃm）、量筒(１00ml）、试管（1８×180ｍm）及塞、吸管（1ml分度0、01，10ml分度0、１)、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。
2、2、3新购得玻璃器皿得清洁:先用流水冲洗，浸泡于1％~２%盐酸（工业用）液中约2～6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗.用于化学分析得玻璃仪器,需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2～3次，晾干备用。
2、3用过得玻璃器皿：2、3、1未被病原微生物污染得器皿：可随时洗涤.用清水冲洗(或浸泡)，除容量仪器外，可用毛刷与肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净,晾干备用.容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗,最后以纯化水涮洗2～3次.试管及培养皿:先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内,经1２1℃灭菌30 分钟.趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗,最后以流水涮净。
微生物限度检查法标准操作规程
目的建立微生物限度检查法标准操作规程，规操作，保证结果的准确性。
围成品、辅料、包装袋及纯化水的检验。
责任微生物限度检验人员容本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。
微生物计数法一、计数方法1、微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。
3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备4.1试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验。
4.2菌液制备按规定培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时使用；若保存在2-8℃，可在24小时使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期使用。
4.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
4.4培养基适用性检查按照表规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。
2015版中国药典微生物限度
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑵ 水不溶性非油脂类供试品
• 取供试品， 用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或 pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基制备成 1:10 供试液。 分散力较差的供试品，可在稀释液中加入 表面活性剂如 0.1%的聚山梨酯 80，使供 试品分散均匀。若需要，调节供试液 pH 值至 6～8。必要时，用同一稀释液将供 试液进一步 10倍系列稀释。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
或cm²）。
– 除另有规定外,一般供试品的检验量为10g 或
• 需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的 总菌落数（包括真菌菌落数）；
• 霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上 生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。
• 若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌 和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可 使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡 萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红 钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂供试品 • 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 气雾剂、喷雾剂供试品 • 贴膏剂供试品
1.4.2供试品检查
1. 平皿法
– 平皿法包括倾注法和涂布法。 – 除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性
试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每 稀释级每种培养基至少制备2个平皿。 – 培养和计数 除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养 基平板在30～35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂 培养基平板在20～25℃培养5 ~7天， 观察菌落 生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，必要时 可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告 。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落 数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌 数报告规则报告菌数。 – 若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15， 则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。
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微生物限度/无菌方法学验证流程
1.：提交单位购买申请菌种的购买：需要1.5个月
单位介绍信证明工作用途等文件，并向中检院网站提交申请，接到申请后一个月后中检院会把有的菌种邮寄到使用单位，中检院菌种经常缺货并不是很齐全，不能一次买齐所需要的8种菌一次性买齐，
2.每种从菌复活、分离、纯化复壮：共需要30天
药典规定进行药品检验所需8种标准阳性菌，购买中检院冻干菌粉后进行复活与保藏1大肠埃希菌
2金黄色葡萄球菌
3枯草芽孢杆菌
4生孢梭菌
5铜绿假单胞菌
6沙门菌
（细菌每种冻干菌粉复活到分离纯化保藏各需要3-4天时间）
7白色念珠菌
8黑曲霉菌
（霉菌酵母菌冻干菌粉从复活到分离纯化制备孢子菌悬液需要至少7天时间）
3.培养基适用性/灵敏度验证：需要60-80天
实验中使用的培养基需要进行与中检院提供的标准培养基进行培养基适用性验证
每种培养基不同批号之间也需要进行验证之后方可以进行微生物检验用
药检室现有培养基种类20余种，每种培养基验证需要3-4天，完成所有培养基适用性验证需要60-80天。
恩替卡韦分散片微生物限度方法学适用性验证：
1.回收率验证：回收率验证实验共需要26天
（若回收率达不到药典规定需要重新选用另一种方法进行验证）
五种实验菌分别验证
1金黄色葡萄球菌
2铜绿假单胞菌
3枯草芽孢杆菌
4白色念珠菌
5黑曲霉菌
五种阳性菌的回收率验证需使标准阳性菌回收率在阳性对照组计数达到50％-200％之间
假设验证一次成功
3种细菌回收率各需要4天时间，2霉菌酵母菌各需要7天时间
2.控制菌适用性验证：共需要20天
大肠埃希菌控制菌方法：需要5天时间
其他制剂含药材原粉的中药制剂需要检查沙门菌、耐胆盐革兰式阴性菌各需要7天时间共1周实验室消毒实验用具灭菌，实验细菌培养物灭活处理，实验用具洗涮等
方法学验证一次顺利完成共需要46天，验证方法过程需要重复一遍作为方法学适用性确认
复方茵陈注射液无菌方法学适用性验证：
1.方法适用性验证：验证实验共需要30天
（若回收率失败或达不到药典规定回收率需要重新选用方法进行验证）
五种实验菌分别验证
1金黄色葡萄球菌
2大肠埃希菌菌
3枯草芽孢杆菌
4生孢梭菌
5白色念珠菌
6黑曲霉菌
6种实验组阳性菌需与对照管组进行对照,含供试品的实验菌均生长良好则说明方法可行
假设验证一次成功
每种菌分别按规定温度培养，培养时间不得超过5天
实验室消毒实验用具灭菌，实验细菌培养物灭活处理，实验用具洗涮等，
方法学验证一次顺利完成共需要30余天，验证方法过程需要重复一遍作为方法学适用性确认。