微生物限度方法学验证方案(沙门菌)
沙门氏菌检验能力验证技术方案
沙门氏菌检验能力验证技术方案沙门氏菌是一种存在于动物和人类肠道中的细菌，可以引起沙门氏菌感染。
由于其传播途径多样且易于感染，沙门氏菌成为食品安全和公共卫生的重要问题。
为了确保食品的安全性，需要对检测沙门氏菌的实验室进行能力验证。
以下是一个针对沙门氏菌检验能力验证的技术方案。
一、实验室设备准备1.需要准备培养基、培养皿、离心管和移液器等常规实验室设备。
2.保证实验室的温度和湿度适宜，以促进沙门氏菌的生长和培养。
二、样本准备1.选择新鲜的食品样品，如鸡蛋、肉类或蔬菜等，并保证样品的新鲜度，以确保样品中的沙门氏菌含量。
2.将样品进行消毒，以杀死潜在的细菌和病原体，然后进行预处理，如打碎、切割或混合。
三、沙门氏菌培养和检测1.使用适当的培养基，如SS培养基或XLD培养基等，将样品接种到培养皿中，然后在适当的温度和湿度下培养。
2.根据实验需要，选择不同的培养期，一般情况下选择24小时的培养期。
3.培养结束后，观察培养皿上是否有沙门氏菌的生长，如有则表示样品中可能含有沙门氏菌。
4.进一步确认是否为沙门氏菌，可以进行进一步的鉴定测试，如气体产生试验或生化试验等。
四、记录和分析结果1.对于每个样品，记录培养结束后培养皿上的菌落数量和形态。
2.分析结果，计算出样品中沙门氏菌的存在量，可以使用经验计数法或统计学方法进行计算。
3.将实验结果与预期结果进行比较，评估实验室的沙门氏菌检验能力是否达到要求。
五、能力验证1.根据实验需要和要求，选择合适的参考材料进行能力验证。
2.安排合适的被试验员进行实验，确保实验员具备相关的培训和经验。
3.分析验证结果，评估实验室的沙门氏菌检验能力，并根据结果进行改进和调整。
六、结果验证1.将实验结果分析和能力验证结果整理成报告，明确实验室的沙门氏菌检验能力是否达到预期要求。
2.如果实验室的能力未达到要求，可根据评估结果进行改进和培训，以提高实验室的能力。
通过以上技术方案，可以对沙门氏菌的检验能力进行有效的验证。
微生物限度检查法
微生物限度检查法细菌及控制菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃。
检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。
检验量检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g 或10ml用于阳性对照试验)。
检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。
供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
常用的供试液制备方法如下。
1．液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。
油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2．固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：10的供试液。
必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
阴性（-）对照试验取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。
每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。
阳性（+）对照试验阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查，对照菌（检测的控制菌）的加菌量为10～100cfu（加对应控制菌制成的溶液1ml）。
阳性对照试验应检出相应的控制菌。
培养和计数除另有规定外，细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。
微生物检测系列之沙门氏菌检验技巧及详解
微生物检测系列之沙门氏菌检测过程详解及注意事项
严烨
沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细 菌科，包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。它们除可感染人外，还 可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。人畜感染后可呈无症状带菌 状态，也可表现为有临床症状的致死疾，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生 产力。
所以将沙门氏菌检验规定为食品致病性菌种检验中的重要项目，它的检测过程一般包括 样品前增菌、选择性增菌、选择性平板分离划线、初步生化鉴定（确定可疑菌）、生化鉴定、 血清学鉴定及血清学分型（选做）共计 7 个步骤。整个步骤完全完成至少需要 7 天时间。下 面以样品检测示例对整个检测过程进行分析梳理。
微生物限度方法学验证方案
微生物限度检测方法学验证方案文件编号：P-批准签字页目录1.目的 (4)2.范围 (4)3.责任者及职责 (4)4.验证简介 (4)5．验证过程 (7)6．结果判断 (8)7．结论和建议 (8)8．异常情况报告 (8)9．再验证 (8)10．附件 (8)附件1：培养基的灵敏度复核 (9)附件2：稀释液的无菌性检查 (10)附件3：方法验证 (11)1. 目的按照中国药典2010版（第三部），采用薄膜过滤法进行微生物限度检查，本方案对新修订的方法进行验证。
2. 范围本公司要求进行微生物限度检查的原辅料和制剂，中间制品以及消毒剂。
3. 责任者及职责4. 验证简介4.1 定义●CFU：菌落数●供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
●试验组当采取薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌加在最后一次冲洗液中，过滤后，取出滤膜接入对应培养基中。
●菌液组测定所加的试验菌数。
●稀释剂对照组用相应的稀释液替代供试品，按试验组规定的方法进行菌落计数。
4.2 菌悬液4.2.1菌种及来源检查人：复核人：检查日期：4.2.2菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，30~35℃培养18~24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，20~25℃培养24~48h。
上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50~100CFU的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28℃培养5~7天，加入3~5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100CFU的孢子溶液。
4.3 培养基及稀释液4.3.1培养基和稀释液的名称培养基：营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基稀释液：pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液、灭菌纯化水4.3.2培养基灵敏度复核培养基灵敏度复核，参见《培养基的灵敏度检查操作规程》QC2524.3.3稀释液的无菌性检查对稀释液进行无菌检查，14天规定温度培养后应无菌。
2020版药典微生物限度计数—沙门菌
2020版药典微生物限度计数—沙门菌2020版本药典(1) 菌种及菌液制备1) 菌液制备将铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌分别接种在胰酪大豆胨琼脂培养基上，35℃条件下培养24小时，将新鲜培养物用pH7.0的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。
(2) 控制菌检查方法适用性试验控制菌检査用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查，各培养基的检查项目及所用的菌株见表1。
表1 控制菌检査用培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性沙门菌菌检查方法适用性试验1、RV沙门菌增菌液体培养基促生长能力检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养18小时。
2、RV沙门菌增菌液体培养基抑制能力检查：分别接种不大于l00cfu的金黄色葡萄球菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养24小时。
3、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基促生长能力检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养18小时。
4、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基指示特性检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养18小时。
5、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基抑制能力检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养24小时。
6、三糖铁琼脂培养基指示特性检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养18小时。
7、三糖铁琼脂培养基抑制能力检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养18小时。
(3) 沙门菌检査1) 供试液制备和增菌培养取10g供试品直接接种至90ml的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，35℃培养24小时。
2020版《中国药典》微生物限度计数—沙门菌
规定的最短培养时生长
被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特 征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。
液体培养基促 生长能力检查
固体培养基促 生长能力检查
培养基抑制能 力检查
培养基指示特 性检查
RV 沙门菌增菌 30～35℃培养
—
30～35℃培养
—
液体培养基
18 小时
24 小时
2020版药典微生物限度计数—沙门菌 2020版本药典
(1) 菌种及菌液制备 1) 菌液制备
将铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌分别 接种在胰酪大豆胨琼脂培养基上，35℃条件下培养24小时，将新鲜 培养物用pH7.0的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。 (2) 控制菌检查方法适用性试验
取上述预培养物 0.1mL ↓
接种至 10mL RV 沙门增菌液体培养基中，0～35℃培养 18～24 小时。 ↓
取少量 RV 沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养 基平板上，30～35℃培养 18～48 小时。 ↓
沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上生长良好，菌落为淡红色或无
试验用菌株的传代次数不得超过 5 代 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 〔CMCC（B）26 003〕 乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC（B）50 094〕 1.2 菌液制备 将金黄色葡萄球菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大 豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养 18～24 小时。 菌液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用；若保存在 2～8℃，可在 24 小时内使用。
指示能性 假单胞菌
沙门菌
微生物限度检查方法适用性试验方案
微生物限度检查方法适用性试验方案一、试验目的本试验旨在验证微生物限度检查方法的适用性，并评估其在实际样品中的准确性、精密度和灵敏度，以确保检测结果的可靠性。
二、试验范围本试验适用于各类药品、食品、环境以及生物制品等样品的微生物限度检查。
三、试验设备与试剂1. 培养基：本试验需使用适当的培养基，如大肠杆菌培养基、沙门氏菌培养基等，以满足特定微生物的培养需求。
2. 灭菌设备：试验中的培养基、工具及试剂需经过灭菌处理，以保证试验环境的无菌状态。
3. 微量移液器：用于准确取样和移液，确保实验的精确性。
4. 微生物培养箱：用于提供适宜的温度和湿度条件来培养微生物样品。
四、试验步骤1. 样品制备：按照相关规定和标准采集样品，并根据不同样品的特性进行适当处理，以便得到具有代表性的样品。
2. 培养基接种：将样品按照试验要求接种到相应的培养基中，并在一定条件下进行培养，以促使微生物生长。
3. 培养基培养：将接种过样品的培养基置于微生物培养箱中，根据微生物的生长特性进行培养，通常包括温度、湿度和培养时间等方面的控制。
4. 结果观察与记录：根据实验要求，观察培养基上是否有微生物的生长，并记录对应的观察结果。
5. 试验数据处理与分析：根据试验结果进行数据处理与分析，并评估微生物限度检查方法的适用性、准确性和灵敏度。
五、试验评价指标1. 准确性：通过与参考方法的比对，评估限度检查方法的准确程度。
2. 精密度：利用不同实验者、设备和试剂的重复试验，评估方法的可重复性和稳定性。
3. 确定度：评估方法的灵敏度和特异性，以确定方法对微生物的检测能力。
4. 可靠性：综合以上评价指标，评估方法在实际应用中的可靠性和适用性。
六、试验结果与分析根据试验评价指标，通过一系列试验和数据分析，我们可以得出以下结论：1. 限度检查方法在各类样品中的准确性良好，能够准确反映样品中微生物的含量。
2. 试验结果表明，方法具有较好的重复性和稳定性，不同实验者、设备和试剂的试验结果相对一致。
微生物限度检验
Cetrimide 琼 脂 35-37 ℃,1872h
金黄色葡萄球 菌 10g (10ml)样 品 90ml 缓冲蛋 白胨水
10ml加入 100ml TSB 35-37 ℃,1848h
Baird Parker 琼脂 35-37 ℃,1872h
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验证内容
（一）计数方法验证 （二）控制菌检验方法验证
12
微生物限度检验方法验证 （一）
计数方法验证
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供试液制备（ 中国药典2005版）
- 表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效性及 对微生物的生长和存活无影响。
- 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小 时。
- 供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。 - 供试液的体积：100ml。
MacConkey 琼 脂 35-37 ℃,1872h
沙门菌
10g (10ml)样品
90ml TSB 35-37 ℃,1824h
1ml 加入10ml TTB 肉汤 41-43 ℃,1824h
脱氧胆盐琼脂 XLD琼脂 亮绿(BG)琼脂 35-37 ℃,1872h
铜绿假单胞菌
10g (10ml)样 品 90ml 缓冲蛋白 胨水
肠杆菌和G-杆
10g (10ml)样 品 90ml乳糖肉汤 35-37 ℃,2-5h
10ml 加入 100ml Mossel 肉汤 (EE肉汤) 35-37 ℃,1848h VRBG 琼脂 35-37 ℃,1824h
大肠杆菌
10g (10ml)样品
90ml TSB 35-37 ℃,1848h
1ml 加入100ml McConkey 肉 汤 43-45 ℃,1824h
微生物限度检验方法验证方案
微生物限度检验方法验证方案1. 适用范围本方案适用于本公司各品种微生物限度检验方法的验证。
2. 目的通过验证确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度的测定。
3. 职责项目责任人：负责验证方案的起草及具体实施。
验证管理员：负责验证工作的组织、协调及管理。
QA 现场监控员：负责验证实施过程中的监督检查，取样，确保结果的可靠性。
QC 负责人：负责验证方案中检验方法的审核及按照规定的取样计划对标准检验操作程序的准确执行，负责组织实施。
QC 检验员：负责验证方案的起草与参与实施，并对所测数据准确性负责。
质量部经理：负责验证方案及报告的审核和批准。
4. 内容4.1. 概述通过验证以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于该药品的控制菌的检查。
根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
若符合，按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
4.2 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证当建立药品的微生物限度检查时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。
验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。
4.2.1. 验证用菌株及菌种要求大肠埃希菌【CMCC（B）44102】金黄色葡萄球菌【CMCC （B）26003】枯草芽孢杆菌【CMCC （B）63501】黑曲霉【CMCC （F）98003】白色念珠菌【CMCC （F）98001】。
大肠埃希菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌为产芽孢杆菌，前述菌株作为细菌计数验证用菌株；黑曲霉为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为霉菌及酵母菌计数验证用菌株。
验证实验所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0 代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
6.沙门菌检查用培养基适用性检查验证方案
1.概述:培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。
适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制是提供优质培养基的保证。
供试品微生物限度检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
2.验证目的：本次验证的目的是确认沙门菌检查用培养基适用性检查用的RV沙门菌增菌液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基的质量，以及其制备程序、保存条件等是否满足微生物限度检查用要求。
3.验证依据：《中国药典》2015年版四部“1106非无菌产品微生物限度检查：微生物控制菌检查”、“9203药品微生物实验室质量管理指导原则”。
4.验证项目：RV沙门菌增菌液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基的适用性检查。
5.适用范围：成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
6.验证周期：除另有规定外，在实验室中，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可以只进行一次。
如果培养基的制备过程未经验证，那么每一灭菌批培养基均要进行适用性检查试验。
7.验证小组人员及职责：7.1验证小组人员:7.2验证人员职责及要求7.2.1按验证方案及相关文件实施验证。
7.2.2认真观察并做好验证原始记录。
7.2.3对实施验证的结果负责。
7.3验证中各部门的职责7.3.1验证领导组职责7.3.1.1制订验证总计划，负责全公司验证工作的管理。
7.3.1.2确定验证项目及验证项目负责人。
7.3.1.3负责验证方案的批准工作。
7.3.1.4负责验证资料及结果的审核工作。
7.3.1.5负责验证报告的批准工作。
7.3.2验证项目小组职责7.3.2.1负责验证方案的起草工作。
7.3.2.2参与验证方案的讨论、确认工作。
7.3.2.3负责验证方案的实施。
7.3.2.4负责验证结果的分析、统计、报告工作。
7.3.2.5参与验证结果的评价工作。
7.3.3质量部职责7.3.3.1负责公司验证日常管理工作。
微生物限度方法学验证完整版
微生物限度方法学验证 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。
二、菌种、培养基及稀释液表2培养基表3对照用培养基表4试剂稀释液：（1）缓冲液取L磷酸二氢钾溶液250ml,加L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。
（2）%无菌氯化钠溶液取氯化钠，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。
（3）％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80 ，用％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。
（4）靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。
三、菌液的制备1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。
上述培养物用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。
2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。
用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu 的菌悬液。
熊胆粉微生物限度检查方法学验证
熊胆粉微生物限度检查方法学验证目的建立熊胆粉微生物限度检查方法，并对方法进行验证。
方法采用《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法对熊胆粉进行微生物限度检查。
结果用pH 7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制备样品，可采用培养基稀释法（1∶20供试液，0.1 mL/皿）进行细菌计数；采用培养基稀释法（400 mL 营养肉汤）进行沙门菌检查；采用1∶10供试液的常规法进行霉菌及酵母菌计数和控制菌检查。
结论该方法消除了样品的抑菌性，可用于该品种的微生物限度检查。
[Abstract] Objective To set up the microbial limit test ways for bear gall powder and verification of the method. Methods A microbial limits method of Chinese Pharmacopeia (2010 edition) part one appendix ⅩⅢC was used to detected the microbial limit test method of bear gall powder. Results Sodium chloride-peptone aseptic buffer solution (pH=7.0) was used to prepare the test sample. Culture media dilution (1∶20 sample solution, 0.1 mL/dish) was used to count the bear gall powder bacteria. Salmonella test method for culture media dilution method (400 mL NB) was used. 1∶10 selected liquid was adopted to do the mildew and yeast count and control bacteria inspection by the conventional method. Conclusion This method can eliminate the antimicrobial properties and it can be used for the microbial limit test for bear gall powder.[Key words] Bear gall powder; Microbial limit test; Validation熊胆粉为熊科动物黑熊Selenaretos thibetanus Cuvier经胆囊手术引流胆汁而得的干燥品，收载于国家药品标准《新药转正标准》第11册[1]，本品有一定的抑菌作用[2]，但其微生物限度檢查一直采用常规方法检验，根据《中国药典》2010年版的要求，对原用的常规方法进行验证[3]。
微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法[发明专利]
![微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/bfd6f70c5627a5e9856a561252d380eb6294239f.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510313160.6(22)申请日 2015.06.10C12N 1/04(2006.01)C12N 1/20(2006.01)C12Q 1/02(2006.01)(71)申请人舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心地址316000 浙江省舟山市定海昌国路222号(72)发明人胡兴娟 沈飚 邵宏宏 周秀锦徐君辉 杨赛军(74)专利代理机构杭州杭诚专利事务所有限公司 33109代理人尉伟敏(54)发明名称微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法(57)摘要本发明涉及微生物能力验证技术领域，公开了一种微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，以沙门氏菌为目标菌，以粘质沙雷氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌为干扰菌，包括：(A)、菌株的复苏、增菌；(B)、菌株的分离；(C)、菌悬液的制备；(D)、冷冻干燥和包装。
最后制备的样品包括：简单级阴性样品，简单级阳性样品；中级阴性样品，中级阳性样品；困难级阴性样品，困难级阳性样品。
同一等级的样品配对使用。
本发明方法制备的样品稳定性好，菌种存活率高，且具有合理的不同难度等级标准。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书9页 附图1页CN 105176823 A 2015.12.23C N 105176823A1.微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法，以沙门氏菌为目标菌，以粘质沙雷氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌为干扰菌，其特征在于包括如下步骤：(A)、菌株的复苏、增菌：将目标菌的标准菌和各干扰菌的标准菌分别加入到营养肉汤或营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使所述各标准菌复苏、生长和增菌，培养期间并对各菌株进行菌种鉴定；(B)、菌株的分离：当上述培养的沙门氏菌培养至稳定期时对其培养基进行离心分离，得到沙门氏菌菌泥；当每一种干扰菌培养至对数生长期后，对其培养基进行离心分离，得到各干扰菌菌泥；(C)、菌悬液的制备：简单级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液的浓度为(3-7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阴性样品菌悬液；简单级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份大肠杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到简单级阳性样品菌悬液；中级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阴性样品菌悬液；中级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102 cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到中级阳性样品菌悬液；困难级阴性样品菌悬液的制备：将1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102 cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阴性样品菌悬液；困难级阳性样品菌悬液的制备：将1份沙门氏菌菌泥、1份大肠杆菌菌泥、1份粘质沙雷氏菌菌泥和1份弗氏柠檬酸杆菌菌泥添加到浓度为8-12wt%的脱脂牛乳水溶液中，控制菌悬液中目标菌的浓度为(3-7)×102 cfu/mL，各干扰菌的浓度为(3-7)×104 cfu/mL，搅拌均匀后得到困难级阳性样品菌悬液；上述份数均为重量份数；(D)、冷冻干燥和包装：分别称取上述制备的每种菌悬液1mL，并分别添加到各自的安瓶中，将所述安瓶平开盖放入冷冻干燥机中，在-22℃至-18℃温度下预先冻结7-9h，接着转移到温度为-50℃至-40℃的冷冻干燥机中，抽真空并使真空度达到100Hg以上，然后将安瓶均匀放置于冷冻室内的隔板上，升华干燥45-55h；待安瓶内物质呈乳白色疏松海绵状时，对安瓶继续进行解析干燥1.5-2.5h；结束后对安瓶进行封口、压盖、贴签，制得微生物能力验证沙门氏菌样品，将所述样品贮存于4℃的环境中。
药品微生物检验及方法验证
药品微生物限度检查及方法验证从事药品微生物限度检查工作两年时间，从学做到承担工作到变得有点经验，经历了一个摸索、学习和积累的过程，回过头来做一个总结，把一些零散的经验和体会做一个梳理和归整，以供在此岗位工作的同仁参考。
第一部分：外围工作外围工作主要有器皿清洗、灭菌，培养基、试剂配制及灭菌，无菌室清洁消毒等。
器皿的清洗是每个实验室和每一个实验员必须要做的最起码的工作，工作要求简单，操作方便，把握一个原则：干净。
培养基、试剂配制后一般都要求调PH到7.20，因为高温灭菌之后PH值会下降0.2左右。
固体培养基在灭菌前要先加热煮沸，使琼脂均匀分散。
煮沸时要注意不要溢出容器，以免发生烫伤。
万一不小心溢出，可用一湿抹布盖住容器口，迅速将其从加热源上移开，不要在情急之下徒手去拿或者在容器侧面拿，那样容易被从容器口源源不断溢出的培养基烫伤。
液体物品灭菌后，不能立即打开放气阀放气，因为此时被灭菌物品的温度大于100℃，在压力等于常压时，液体会暴沸，造成液体喷出或容器炸裂，发生事故。
万级洁净度的无菌室应当每周进行一次消毒，消毒剂每月更换一次，防止长期使用同一种消毒剂而使微生物形成耐药性。
消毒范围包括墙壁，地面，天花板以及空气。
表面消毒可以用消毒剂擦拭，尤其注意门框边缘以及出风回风口，不能留有死角；空气消毒宜采用臭氧或者紫外灯。
可以使用专门的臭氧发生器产生臭氧进行消毒，也可以在每一个操作间包括净化台安装适宜功率的紫外灯，一方面紫外线可以对近距离的物体表面进行消毒，另一方面紫外线的作用也可以使空气中的氧气转换成臭氧，从而能够杀死空气中的微生物。
另外在每次做完实验之后，都应当对实验台面以及地面进行消毒处理。
第二部分：检验过程整个无菌室的检验操作过程应当有一个标准的操作规范，严格按照无菌操作的规定进行操作，包括进入无菌室的程序以及人员清洁消毒，都应当遵守标准来进行。
首先，进入无菌室应当严格按照洁净区（室）有关规定进行。
进入之前先进行洗手消毒，在一更换鞋，脱去外衣，进入二更，穿洁净工作服，注意穿戴洁净工作衣帽时必须做到衣服的任何部位不得拖地。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。
3.规范性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。
4.验证实施：4.4.1 试验前的准备:4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天内使用。
4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
4.4.2 试验菌的制备和稀释：4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液：4.4.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24～48小时；取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天。
沙门氏菌检验能力验证技术方案
食品微生物学检验沙门氏菌能力验证技术方案根据《新项目论证技术要求》，为保证此次能力验证数据准确，结果可靠，特制定如下技术方案：一、检验依据《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB4789.4-2016 》二、检品A、B、C三种物质形态不同种类的典型性样品三、人员比对a、b分别试验进行数据比对（双人双平行）四、准备工作仔细核对试验使用试剂及相关培养基，灭菌试验所需要的试剂、耗材以及玻璃器皿等。
五、质量控制1、按照国家标准规定准确称取样品和试剂并进行前处理。
2、仪器设备性能和检测环境的确认（1）依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录；（2）依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、生物安全柜、超净台、无菌衣进行清洁消毒灭菌并记录；（3）依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室、生物安全柜及超净台进行沉降菌检测并记录。
3、培养基性能测试依据《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB4789.28-2013》对此参数涉及到的亚硫酸铋琼脂、沙门氏菌显色培养基、四硫磺酸钠煌绿增菌液、亚硒酸盐胱氨酸增菌液培养基进行验证并记录。
4、对照每次实验均应进行阳性、阴性、空白对照确保实验数据的可靠性。
六、注意事项1、实验后对本实验所涉及到含阳性菌的耗材、容器、玻璃器皿、培养基、菌株等进行灭菌处理并做好记录；2、实验人员要严格按照《无菌检查系统操作规程》进出无菌室；3、严格按照《食品微生物学检验总则GB4789.1-2016》进行采样和实验。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案微生物限度检查方法验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理1.1验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
1.2原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤2.1验证前的准备：进行微生物限度检查方法验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径0.45um直径50mm）、无菌移液管（5ml）4.验证方法4.1菌液的制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在30～35℃下培养18～24小时，将白色念珠菌接种至改良马丁液体培养基中，在23～28℃下培养24～48小时。
沙门氏菌方法验证报告
沙门氏菌方法验证报告沙门氏菌是一种常见的细菌，它可以引起人体的食物中毒和感染。
因此，在食品加工和生产过程中，需要对沙门氏菌进行检测和验证。
本文将介绍沙门氏菌方法验证报告。
一、实验目的本实验的主要目的是验证所使用的方法是否能够准确地检测出样品中的沙门氏菌，并确定该方法的灵敏度和特异性。
二、实验材料与仪器1. 沙门氏菌标准品2. 无菌生理盐水3. 培养基：XLD培养基、SS培养基、EB培养基4. 灭菌好的试管、移液管、显微镜等实验器材三、实验步骤1. 准备样品：从食品中取出适量样品，加入适量无菌生理盐水，混合均匀。
2. 检测方法：(1) XLD培养基法：将混合好的样品涂布在XLD培养基上，放置在37℃恒温箱中培养24小时。
观察培养基上是否有红色或黑色小斑点形成。
(2) SS培养基法：将混合好的样品涂布在SS培养基上，放置在37℃恒温箱中培养24小时。
观察培养基上是否有黑色小斑点形成。
(3) EB培养基法：将混合好的样品涂布在EB培养基上，放置在37℃恒温箱中培养24小时。
观察培养基上是否有蓝色或绿色小斑点形成。
3. 结果判断：(1) XLD培养基法：如果在XLD培养基上出现红色或黑色小斑点，则说明样品中存在沙门氏菌。
(2) SS培养基法：如果在SS培养基上出现黑色小斑点，则说明样品中存在沙门氏菌。
(3) EB培养基法：如果在EB培养基上出现蓝色或绿色小斑点，则说明样品中存在沙门氏菌。
四、实验结果经过实验验证，三种方法均能够准确地检测出样品中的沙门氏菌，并且具有较高的特异性和灵敏度。
其中，XLD和EB两种方法对沙门氏菌的检测效果更为明显，能够更快地形成小斑点，因此在实际应用中更为常用。
五、实验结论本实验采用的三种方法均可用于沙门氏菌的检测和验证，具有较高的特异性和灵敏度。
在实际应用中，可以根据样品类型和检测要求选择合适的方法进行检测。
同时，为了确保检测结果的准确性，应严格控制实验条件，并使用标准品进行对照验证。
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微生物限度方法学验证方案(沙门菌)
微生物限度检测方法学验证方案
文件编号：YZ-WJ-001-0
批准签字页
目录
1.目的 (6)
2.责任者及职责 (6)
3.验证简介 (6)
4．验证过程 (5)
5．结果判断 (5)
6．结论和建议 (5)
7．再验证 (5)
8．附件 (5)
附件1：培养基的灵敏度复核 (6)
附件2：稀释液的无菌性检查 (10)
附件3：方法验证 (8)
附件4：培养基厂家报告 (9)
1.目的
按照中国药典2015版（第四部）规定，确认所采用的方法适合该药品的沙门菌的测定。
照此检测法和检验条件进行沙门菌检查，能保证结果的准确、可靠。
2.责任者及职责
3.验证简介
验证时，按供试液的制备控制菌检查法所规定的方法及要求进行，验证实验至少进行3次独立平行实验。
3.1验证用菌株
3.2样品名称及数量
3.3实验用品
3.4培养基
检查人：复核人：检查日期：
4．验证过程
4.1试验器具准备
试验前，将先前已准备的适量稀释液和培养基灵敏度复核检查合格的培养基、检品和所用仪器一同放入无菌室的传递厨内。
用消毒剂对无菌室进行消毒，并擦拭超净台，打开超净工作台风机及紫外灯灭菌1小时以上。
4.2测定
4.2.1 按照无菌室更衣程序更衣，进入无菌室。
4.2.2 用70%酒精棉球擦拭工作台面与待测品表面。
4.2.3菌液制备：沙门菌菌数控制在10~100cfu/ml
4.2.4取胰酪大豆胨液体培养基两份，分别加入10ml供试液及1ml10~100cfu/ml沙门菌菌悬液，混匀，30~35℃培养18~24小时。
取上述各培养物0.2ml，接种至木糖赖氨酸脱氧胆算盐琼脂培养基平板上。
沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆算盐琼脂培养基平板上生长良好，菌落为淡红色或无色透明或半透明，中心有或无黑色。
未接种的木糖赖氨酸脱氧胆算盐琼脂培养基平板作为空白对照。
用接种针挑选疑似菌落于三铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18~24小时，或采用其他适宜方法进一步鉴定。
5．结果判定
若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄色，或斜面为黄色、底层为黄色或黑色，应进一步进行适宜鉴定试验，确证是否为沙门菌。
如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色，底层未见黄色或黑色，判定供试品未检出沙门菌。
6．结论和建议
此项中将根据实际测试的结果给出运行确认的结论，有异议的将给出建议。
7．再验证
如该验证的试验方法或试验相关试剂发生改变，需再验证。
8．附件
8.1附件1 培养基灵敏度检查记录
8.2附件2 稀释液无菌检查记录
8.3附件3 微生物方法学验证记录
8.4附件4 培养基厂家报告
附件1：培养基的灵敏度复核
复核人：操作人：
附件2：稀释液的无菌性检查
复核人：检验人：
附件3：方法验证
样品名称：培养基：
试验菌名称：菌种批号：
3批样品按顺序进行3次试验
复核人：操作人：YZ-WJ-001-011。