ch13 微生物细胞工程

溶菌酶1mg/ml， 溶菌酶100mg/ml， 5mg/ml Novozyme、0.5%蜗牛 30℃，15~60 42℃，30分钟 酶＋1%纤维素酶，28℃，180 min min 65%PEG（分子 40%PEG（分子 量4000）0.5~1 量6000）2 min min 30%PEG（分子量6000）， 0.01mol/L CaCl2溶液＋ 0.05mol/L甘氨酸（pH=7.5） 30℃，10 min
适 应 原 材 料
改 变 产 品 组 分
分 析 生 物 合 成 机 制
了 解 菌 种 遗 传 背 景
提 供 分 子 遗 传 学 研 究 材 料
增 加 菌 种 遗 传 标 记
微生物细胞的改造－育种


传统菌种选育技术 杂交和原生质体融合技术 基因工程 定向进化
传统菌种选育技术

自发突变育种 诱变育种
第十三章 微生物细胞工程
微生物细胞的特点


微生物作为可以独立存在的个体，其生长 特点、代谢的特点与植物、动物有着显著 的区别。 一般情况下，微生物由其自身完成其基本 功能；
微生物菌种选育的目的和意义
菌种选育的目的
生产
Biblioteka Baidu
科研
提 高 产 量
改 进 质 量
合 成 新 化 合 物
缩 短 生 产 周 期
简 化 生 产 工 艺
亚硝基胍 （固体）
0.1~1.0 mg/ml ， 孢子 3mg/ml (高浓度 及碱性 pH)
诱变剂使用续1
氮芥（液 状物）
0.1~1mg/ 密闭反应5~10 甘氨 ml 酸或 大量 稀释
烷化剂，引起染 色体畸变
与NaHCO3作用即 释放N –芥子气糜 烂性毒气，小心操 作
乙烯亚胺 （液体）
盐酸羟胺 （液体） 氯化锂 （白色粉 末）
诱变剂 亚硝酸 （液体） 浓度 0.01~0. 1M 处理时间 （min） 5~10 缓冲液 pH4.5,1M 醋酸缓冲 液 终止反应 方法 pH8.6, 0.07M Na2HPO4 溶液 效 应 备 注 有致癌作 用，小心 操作
脱去碱基中的氨 基后引起碱基转 换，造成突变
硫酸二乙 o.5~1% 酯（液体） (V/V)
原生质体融合
-
• 原生质体制备：
（1） 根据材料选择破壁酶 细菌：溶菌酶 真菌: Zymolyase-20T，5000T， Novozyme 234，蜗牛酶，纤维素酶， 溶壁酶，崩溃酶， 几丁质酶等
（2） 缓冲液
（3）酶解条件 温度、时间、酶成分配比等
• 融合
电融合技术：
原生质体在电场中，由于加直流脉冲， 膜被击穿，导致融合的发生。 特点： 空间定向，时间同步，显微镜监视
在PCR系统中可用于增加碱基错误 插入频率的方法
1. 2.
增加MgCl2浓度； 加入一定浓度的MnCl2；
3.
4.
在PCR中采用不平衡的核苷酸浓度；
核苷酸类似物的三磷酸衍生物的混合 物.
DNA shuffling

DNA Shuffling 技术
1. 一个或多个不同来源的基因切成片段 2. 无引物PCR扩增 3. 筛选一个或多个所需的性状 4. 重复DNA Shuffling 5. 获得高百分比的功能基因库
化学因子诱导融合：
聚乙二醇（polyetheneglycol, PEG） Ca 2+ 、Mg 2+ 等阳离子 pH
•再生
恢复细胞原貌，能够再生长 高渗培养基 蔗糖 （0.6 M） 山梨醇 (1.0 M) 氯化钠 (0.7 M)
基因工程
一、概念
基因工程是指在基因水平上的遗传工程，即用人工 方法将所需要的某一供体生物的遗传物质－DNA大分 子提取出来，在离体条件下进行切割后，把它和载体 的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，以 让外来的遗传物质在其中“安家落户”，进行正常的 复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。 所以基因工种是人们在分子生物学理论指导下的一种 自觉的能象工程一样可事先设计和控制的育种新技术， 是人工的离体的分子水平上的一种遗传重组技术，是 一种可完全超远缘杂交的育种新技术，因而是一种最 新、最有前途的定向育种新技术。
（三）重组载体导入受体细胞内
（四）复制、表达
这种杂种质粒进入受体细胞后， 通过自我复制而扩增，并使受 体细胞表达为供体细胞所固有 的部分遗传性状，这种受体菌， 即成为“工程菌”。
（五）筛选、繁殖
质粒，或所带DNA能表达产生一 定产物，可通过一选择性培养基或 试剂鉴别出来。 原来100000g胰脏仅能提取3－4g 胰岛素，而用工程菌发酵生产，只 要几升发酵液便可取得同样数量的 产品。

主要优点：大大减少与鉴别所需候选产物有 关的成本和时间

难点：设计一个高效的分析和筛选方法
基本培养基(含菌)
基本培养基
检出缺陷型 大，野
限 量 补 充 法
小，变
<1%蛋白胨
检出缺陷型
基 本 培 养 基
逐 个 检 出 法
完全培养基
完 全 培 养 基
检出缺陷型
影 印 培 养 法
完全培养基
培养
基本培养基
鉴定缺陷型
生长谱法
含营养物滤纸片 (氨基酸、维生 素、碱基等)
含菌基本培养基
各种化学诱变剂常用浓度和处理时间
生理生化变异
抗性变异
病原性变异
遗传变异类型
遗传变异类型
细胞质
细胞核
质粒、噬菌体和 线粒体DNA
DNA
染色体数目（单、双、多 倍体和非整倍体）
体外重组
突变
重组（转化、转 导、接合和融合）
转化或转染进入 宿主细胞中
点突变 （DNA分子中某一个碱基发 生顺序或数目的变化所致）
区段突变（染色体或DNA片段的 缺失、易位、倒位、替换、添 加等造成的突变）
1:100~1: 1000
28℃或低温处 稀释 理30~60
数小时或生长 稀释 过程中诱变 加入培养基中，稀释 在生长过程中 诱变
烷化剂，高浓度 效果较好
与胞嘧啶作用产 生转换，引起 CG→AT突变 需与紫外线、亚 硝酸、硫酸二乙 酯等复合处理才 有效
有剧毒，易燃，可 在4℃冰箱小心操 作，避光保存
有损健康，注意安 全操作 易溶于水，易潮解
0.1~5%
0.3~0.5 %
5-溴鸟嘧啶 20~30mg 与孢子悬浮液 稀释 /ml （白色粉 混合振荡培养， 末） 处理一定时间 后，稀释涂皿
有机体缺乏胸腺 碱基类似物 嘧啶时较易掺入 DNA中引起突变， 能诱发正突变与 回复突变
微生物原生质体融合
微生物

选择简单有效的诱变剂及合适剂量 处理单细胞或单孢子悬液 复合诱变剂的处理
营养缺陷型的筛选方法

1、诱变处理 2、淘汰野生型
• 抗生素法 青霉素 • 制霉菌素(抑制甾醇的合成) • 菌丝过滤法(适于真菌和放线菌)

3、检出缺陷型 4、鉴定缺陷型
检出缺陷型
夹层培养法
完全或补充培养基 基本培养基
孢子 15~30， 菌丝 18~24h
孢子 30~120, 菌丝 90~120
pH7.0磷酸 Na2S2O3或 诱变作用较强， 不溶于水， 缓冲液 大量稀释 杀菌作用较弱， 加微量乙 使DNA的碱基和 醇可溶解 磷酸基发生烷化 作用，引起突变。
pH6.0, 1M 大量稀释 磷酸或醋 酸缓冲液 或三羟基 甲基氨基 甲烷-缩苹 果酸缓冲 液 pH低于5~5.5时， 同硫酸二乙酯形 成亚硝酸，碱性 条件下产生重氮 甲烷，引起杀菌 和变异 有致癌作 用，小心 操作，避 光保存， 易产生突 变群
自发突变育种

从生产中育种 定向培育优良菌株
卡介苗的获得 吡哆醇高产菌株的获得
诱变育种

诱变育种的基本环节
谷氨酸棒杆菌的野生型（左）和 dapD突变株（右）细胞的电镜照片
诱变育种中的几个原则

挑选优良的出发菌株
• 单一遗传纯菌株 • 选用对诱变剂敏感的菌株 • 选用有应用前景的菌株 • 来自生产中的自发突变菌株
微生物突变类型
变 异 类 型 形 态 变 异 菌落形态 细胞形态 细胞结构 变 异 性 状 菌落大小、形态、表面结构、颜色、产 孢子多寡或有无
鞭毛、夹膜、菌丝形状、生长速度、分 枝多少及形状、孢子大小和形状、产孢 子器官形状 细胞膜、孢子的表面结构及抗原构造
糖类分解能力、色素产生能力、有关酶 的活性、营养要求和性质、温度敏感性、 代谢产物生产能力 耐药性、对自身代谢产物抗性、噬菌体 抗性、对紫外线及其他辐射因子的抗性 等 病原产生能力、表面抗原等
二、主要操作过程
（一）基因分离 1、分别提取供体细胞（各种生物都可选 用）的DNA与作为载体的松驰型细菌质 粒（也可用噬菌体或病毒作载体）。 2、根据“工程蓝图”的要求，在供体 DNA中加入专一性很强的限制性核酸内 切酶，从而获得带有特定基因并露出粘 性末端的DNA单链部分（必须时可人工 合成粘性末端）。
（二）体外重组
把供体细胞DNA片段与质粒DNA片段 放在试管中，在较低的温度（56℃）下 混合“退火”。由于每一种限制性内切 酶所切断的双链DNA片段的粘接末端有 相同的核苷酸组成，所以当两者混在一 起时，凡粘接末端上碱基互补片段就会 因氢键的作用而彼此吸引，重新形成双 链，这时在外加的连接酶作用下，供体 的DNA与质粒DNA片段相连，形成了一 个完整复制能力的环状重组体“杂种质 粒”。
分子育种

容错PCR DNA shuffling
容错PCR（Error-prone Polymerase Chain Reaction, epPCR）

Taq聚合酶是从一株耐热细菌Thermus aquaticus中分离获得，由于它缺乏3’－ 5’的校正活性，因此在PCR过程中会插入 一些错误的碱基。在通常情况下，发生错 误碱基插入的频率为0.1～2x10-4。通过 改变PCR的一些反应条件，可以增加这种 错误碱基插入的频率，从而可用来实现基 因的定向进化。
方法
放线菌 （链霉菌）
G+细菌 （杆菌）
霉菌 （顶头孢霉） 0.2g湿菌体在含有0.01mol/L DTT的柠檬酸－磷酸盐buffer中 预处理60 min 0.7mol/L NaCl
菌体准 备 稳定剂 酶及浓 度 融合剂
液体培养基中加 液体培养基加 0.3%~1%甘氨 0.5mol/L蔗糖 酸 P buffer※ SMMAD buffer※※