薄层扫描法

薄层扫描法

一、定义

薄层扫描法（TLCS）又称原位定量薄层色谱扫描法（QTLC）系指用一定的波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品定性定量的分析方法。

回顾薄层色谱法（TLC）

1、薄层板的制备（硅胶板，Al2O3板，聚酰胺薄膜等）

2、点样（选择合适的展开剂，在薄板底1cm处画基线，点样）

3、展开（浸入展开剂，展开到距薄板顶端1~2cm）

4、检视（在紫外光灯下观察斑点）

了解一下薄层扫描仪

薄层扫描仪的组成及主要功能

薄层色谱扫描仪有多个厂家生产，型号不同，仪器外形、光路系统及某些功能也有差异，但其基本结构及主要功能是基本相同的。每台仪器都包括主机、数据处理及信号输出等部分。

（1）分光器及测量范围

大多数薄层扫描仪的分光器为光栅，少数为棱镜，极个别的用滤光片，其测

量范围光栅为200-800nm,棱镜为200-2500nm。

（2）光源及检测器

光源室具有可见光源鸨灯，波长范围为400-800,紫外光源免灯波长范围为

200-400nm,荧光光源为氟灯或汞灯。操作时可通过光源选择杆来变换光源选择镜的位

置；检测器一般为光电倍增管。

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国外几种主要专用薄层色谱扫描仪

、TLCS 基本原理与方法 薄层扫描法可分为薄层吸收扫描及薄层荧光扫描两类方法。 1.薄层吸收扫描法的基本原理

薄层吸收扫描法是用可见光或紫外线的单色光照射展开后的薄层色谱

PD

由・5・5醐制招 L 顼浪MC-草色最P-就枚; PD-表 7-5-2

板，测定薄层色谱斑点（简称斑点）的吸光度（A）随展开压离（L）的变化，而获得A 一L成A — Rf曲线，即薄层色谱扫描图（简称扫描图）。

曲线上的色谱峰峰面积可用于定量分析。由于薄层板存在着明显的散射现象，而使斑点中物质的浓度与吸光度的关系不服从Beer定律，所以需田Kubelka—Munk（古柏尔卡一曼克）理论来描述。该方程式是薄层扫描法的定量分析基础。定量校正方法可分为曲线校直法及非线性回归法等。

设薄板固定相的厚度为X,入射光的强度为I.,当透过厚度x的的固定相后，照射在微分薄层厚度dx上的入射光强与反射光强分别为i和j时，如左图。其入射光强的增量与反射光强的增量分别符合以下两个微分方程：

——二-（S+ K）3 皈

dx

-（S + A+ Si

dx

即光照射到厚度为x的薄层后，光被吸收及散射。在入射方向，光强度因为被吸收与散射而减弱；在入射的反方向，则光强度因散射而增强。解上述方程得：

i二』血而+ B螂瞄

j =（ d - 3B）而献i +1 uifl - M血&

在薄层扫描时，人们只是对进入薄层和由薄层出来的光有兴趣，也即上式的极 端情况，x=0及x=X 时

1 = 0 y = 0* i — T

x = ' 时，i - /… j 二 R

式中.T 和H 分别为透射率和反射率::

T =——T 七莎 + ax^infu/hA

D sirift/iXY t m n - -. i, L ,. + bv （inht ）＞\ a^inhbW 若薄层对咒不吸收,即后0

（7-5-3）

（7-5-4）

SX

由方程式(7-5- 1)」7-5-4),町以计算出在不同散射系数必时-]g(T/r 0)^- 1g (R/RQ 与KX 间的关系，如图

7-5 - 1、

7-5・2所示.KX 与样品浓度成正比。

（7-5-2）

h = = /仲 2SI3

对比两图很易发现，由于薄层固定相的散射作用使在透射法中所测得的斑点的吸光度产生正偏差，而在反射法测定时产生负偏差。这是因为照射光被散射，降低了透射率，吸光度增加；散射光增加了反射光光强，增加了反射率，而降低了吸光度的缘故。其次，还可发现后图比前图的横座标大25倍，这说明了反

射法的灵敏度（响应值）比透过法小。

1 - 1 Kubelka-Munk 曲线校直

Kubelka- Munk曲线说明了薄层色谱斑点的吸光度与其浓度间呈非线性关系，该曲线是薄层扫描法进行定量分析的理论依据。曲线处理采用两类方法：曲线校直法及计算机回归法（线性及非线性回归）。CS系列仪器采用前者，CAMAG仪器采用后者方法。

曲线校直法是根据薄层板的散射参数SX值，将Kubelka- Munk曲线校正为直线，简化A与KX间的关系，以利于定量分析。

用曲线校正法校直Kubelka— Munk曲线，必须巳知薄层板的SX值，Mrck预制硅胶板的SX = 3,Merck预制氧化铝板的SX = 7,Wako预制硅胶FM（硅胶GF254）板的SX = 7。国产预制薄层板及白制薄层板，可参考上述数据试调，而后检查校正是否适宜，修正SX值再校，直至A — KX曲线成直线为止。检查方法如下图所示。图中点样量显（横坐标）常用单位为ug/点。

应用时应注意：

曲线校直法是一种简便的薄层扫描定量校准方法，但比较粗糙，且有时难于准确知道薄层板的SX值。为了降低定量误差，应使标准品的色谱峰峰面积与待测品(供试品)的色谱峰面积尽量接近为好。

2.薄层吸收扫描法的扫描方式及条件的选择

薄层吸收扫描法的扫描条件，包括扫描方式、波长及测光方式等。扫描方式分为直线式及锯齿式扫描。扫描波长的选择至关重要，不仅关系检测灵敏度，而且关系干扰的排除等。测光方式分为透射式及反射式

2.1扫描方式选择

(1) 直线扫描

直线式扫描是用一光带先照射在薄层板的一端，而后作直线运动至另