转基因育种

（3） 图位克隆(map-based cloning) 染色体步行(chromosome walking) 以一个被克隆特定的标记作为探针去筛选基因文库中所有 DNA片段，
染色体步行 法
30%
（4）转座子标签法
（5）差异显示
高等真核生物的基因根据表达特性的差异可分为
看家基因（house-keeping gene） 以其组成表达模式维持细胞的基本代谢活动
（2）表达序列标签法
（expressed sequence tagging method)
能够特异性标记某个基因的部分序列
1）cDNA文库筛选
2）快速扩增 cDNA 末端 ( Rapid Amplification of cDNA End，RACE )
利用一条根据已知序列设计的特异性引物和一条与 mRNA的PolyA (3’RACE)或加至第一链cDNA3’端的同聚 尾(5’RACE)互补的通用引物，合成全长cDNA。
（二）从基因组DNA或mRNA 克隆目的基因
1、同源序列法 (Homology based candidate gene method)
1）PCR克隆目的基因
2）基因组文库克隆目的基因
基因组文库
某种生物基因组全部遗传信息的一系列DNA片段， 通过克隆载体贮存在一种受体菌群体之中，包含某生物基 因组全部DNA片段的受体菌群体（一套克隆）称为基因 组文库。
3）cDNA文库克隆目的基因
cDNA （complementary DNA）
基因通过转录和加工的mRNA，经反转录可产生的互 补DNA。
cDNA只含基因 编码序列，不具启动 子和终止 子以及内含 子。
cDNA文库
某生物基因组经转录和反转录产生的各种cDNA片 段分别与克隆载体连接，通过转化（转导）贮存在一种 受体菌的群体中。把这种某生物基因组全部基因cDNA 的受体菌群体（一套克隆）称为该生物cDNA文库。
能使外源DNA片段插入 （2）复制原点(ORI, origin )
能进行自我复制 （3）选择标记基因
承载外源DNA片段的 载体进入细胞后，以便筛 选克隆子。
（4）安全
1 、大肠杆菌质粒载体
（1）pBR322质粒 p表示质粒
BR分别为Boliver & Rodrigue首字母缩 写
选择标记基因 氨苄青霉素（Ampr，Tn3 ） 四环素抗性（Tetr，pSC101 ）基因
2）Ti质粒的结构 T-DNA区／转移DNA （transferred-DNA region）
农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转 移到植物细胞的一段DNA
该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关
Vir区／毒区（virulence region）
该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现 出毒性
第二节 转基因育种的程序
一、目的基因的获得
目的基因 被用于基因重组、改变受体细胞性状和得到 表达产物的基因
目的基因一般为结构基因，也就是能转录和 翻译出多肽（蛋白质）的基因。
（一）根据基因表达产物蛋白质克隆基因
分离纯化目的基因表达 的蛋白或多肽
氨基酸测序 根据氨基酸序列推导 相应的核苷酸序列 化学合成目的基因
pBR322质粒的复制起点（ori）
氨苄青霉素抗性基因（ampr） 大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因 （lacZ）的启动子及编码β半乳糖苷酶 α-肽链的DNA 序列(lacZ'基因)
lacZ '内有13个酶切位点的多 克隆位点。
2、Ti质粒（Ti plasmid）载体 一种细菌质粒 存在于土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens）中 可诱导植物产生瘤细胞( Tumor- inducing, Ti )，
第十三章 作物转基因育种
转基因育种的优点 1、可利用的基因资源广 微生物、动物与植物的的基因 2、提供了新的育种途径 3、可对目标性状进行定向变异和选择
4、可大大提高选择效率，加快育种进程
第一节 作物的转基因技术的发展 一、转基因技术的发展现状
我国的转基因农作物
转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠 菜、甜椒、小麦等，转基因棉花已经大规模商品化生产。 Bt-CpTI
3、CaMV基因克隆载体 花椰菜花斑病毒（CaMV）
含有8kb大小的双链DNA病毒
最大装载大于CaMV-DNA 300bp
Cawenku.baidu.comV 35S 启动子融合基因载体系统
CaMV的DNA在植物中 高水平转录35S RNA， 其启动子是一强启动子。
将不含启动子的外源目的 基因组装在35S启动子的 下游，构建成可在植物中 高效表达的载体。
T-DNA区 与Vir区在质粒 DNA上彼此相 邻，合起来约占 Ti质粒DNA的 三分之一
Con区／接合转移编码区 （conjugation encoding region）
该区段上存在细菌间接合转移的有关基因（tra）， 调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。
冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移
Ori区／复制起始（origin of replication） 该区段基因调控Ti质粒的自我复制
复制原点
pMB1 （类似 Col E1质粒，具 大肠杆菌素E1合成酶基因）
多克隆位点（multiple cloning site）
64个限制性内 切酶位点
TcR内有11个限制 性内切酶位点，其启 动子内2个
ApR内有6个限制 性内切酶位点
（2）pUC质粒载体
Messing & Vieria （University of California）1987年构建
发育调控基因（developmental regulated gene） 以时空特异性表达模式完成个体的正常生长、 发育与分化
二、目的基因重组质粒的构建 载体（vector）
能够携带外源基因进入受体细胞的DNA分子。 基因克隆载体必备条件 （1）多克隆位点（ MCS，multiple cloning site）
冠瘿瘤（grown gall tumors)。
1） Ti质粒的类型
根据Ti质粒诱导的植物冠 瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类 不同，可以分成四种类型：
章鱼碱型（octopine） 烟脂碱型（nopaline） 农杆碱型（agropine） 农杆菌素碱型（agrocinopine） 或称琥珀碱型（succnamopine）