胶体金免疫标记技术培训
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其基本步骤如下： (1) 将亲和纯化抗体用生理盐水稀释为 0.5-1 mg/ml 浓度 (2) 在 3 M KCNS（硫氰酸钾）溶液中透析 12 h
4
浙江大学胶体金免疫标记培训班资料
(3) 在 2 mMol pH 9.0 的硼酸缓冲液中透析 12 h（更换透析液数次） (4) 分装备用 其它蛋白可参考此方法进行。但注意后一种透析液的 pH 值应与交联时 pH 值一致。 在实际运用中，一般省略去 3M KCNS 透析这一步，特别是当蛋白分子量较小，且为非糖 蛋白时。我们建议在制备通用探针（如二抗 IgG，Protein A，Protein G，Streptavidin）等时， 严格使用该方法，而制备直接标记探针时，也可以忽略处理步骤。
同用量的单宁酸及等量的 25 mM K2CO3。预热至 60～70℃。K2CO3 的作用是保持 溶液的中性 pH。因此如果单宁酸的量少于 0.5 ml 时，对 pH 的影响不大，K2CO3 可以省略。 (3) 将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温 10 分钟。自然冷却。
1
浙江大学胶体金免疫标记培训班资料
其基本过程如下： (1) 用 PBS（pH 7.0，含 10 mM EDTA，20 mM 盐酸半胱氨酸）溶解纯化的 IgG (2) 加固化木瓜蛋白酶 (3) 37℃处理 5h (4) 离心，去除固化木瓜蛋白酶（沉淀） (5) 过 Protein G 柱 (6) 纯化的 Fab 片段按前文方法做进一步处理
胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理，其目的在于（1）去除高浓度的盐分，高浓 度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用 低浓度缓冲液中进行。（2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋 白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定 量分析。（3）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（30 kD），形成的蛋白复合体往 往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是已知 蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长 探针寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如 BSA，牛血清蛋 白等）结合后，能制备出稳定性更佳的探针。
注：Fab 与胶体金结合的 pH 值为 6.5
4、蛋白与胶体金结合最佳 pH 测定
(例纤维素酶，pI 未知)
(1) 取若干个 1.5ml 试管，分别加入 1 ml 10 nm 胶体金； (2) 用 25 mM K2CO3 将 pH 分别调为 3，4，5，6，7，8，9，10； (3) 取一 96 孔培养板，按 pH 从低到高分别将上述胶体金分别取 100 μl 加入孔中，重
3
浙江大学胶体金免疫标记培训班资料
这里需要特别指出的是，使用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全 不同外，往往最佳 pH 也有一定变化。
因此，在探针制备每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性。
1、抗血清的前处理
一般抗血清中 IgG 的含量为 10-25%，而绝大部分为其它蛋白。用抗血清直接制备探 针其标记活性与特异性均不理想。因此需去除其中多数杂蛋白。但处理环节不宜太繁，在 实验室设备与经验缺乏的情况下更是如此，否则会导致 IgG 活性的大幅降低。如果你的实 验室在蛋白纯化方面有很强的技术支持，高度纯化后效果会更好。
柠檬酸钠（ml）
4 4 4 4 4 4
单宁酸（μl）
5000 2000 500 120
70 10
胶体金（nm）
3 4 6 8 10 16
2、白磷还原法制备 5 nm 胶体金
(1) 取 250 ml 三角瓶一个，加 79 ml 双蒸水，1 ml 1%氯化金，并用 0.25 M K2CO3 将 溶液调至中性（pH7.0）。
浙江大学电子显微镜室 浙江大学生物技术研究所
胶体金免疫标记技术培训班
技术资料 胡东维 洪 健 徐 颖
浙江大学 2001 年 10 月
浙江大学胶体金免疫标记培训班资料
一、胶体金的制备
根据不同的制备方法，可以制备出直径 1－500nm 的胶体金粒子，但做为免疫标记探 针，其直径应在 3-30nm 范围内。
利用柠檬酸为还原剂，可以制备 12～150 nm 直径的胶体金。但制备大体积的胶体金 时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备 12-16 nm 直径 的胶体金。
除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备 5 nm 的胶体金，它避免了单宁酸残 基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理， 故该方法已经很少使用。
当蛋白前处理完成后，接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳 pH 值。对于理化性质不 确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同 pH 值得胶体金结合后，只有某一特定 pH 值能够形成结合最稳定的探针。在高浓度电解质（如 NaCl）作用下不会凝聚。不同蛋白的 适宜 pH 范围的宽窄大不相同。一般选择最小适宜 pH 值为最佳 pH 值。但有些探针的实际 情况并不完全如此，最稳定发探针并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。
(2) 胶体金溶液最好保存在 4℃冰箱中；也可保存在室温下，一般可保存 1-2 个月。但决不可保存 在 0℃以下，否则金粒子发生凝聚。
二、蛋白-金复合体的制备
一般认为胶体金粒子表面为一层 AuCl2，因此，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒 子之间相互排斥，形成稳定悬浮的胶体金溶液。
金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来 电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于 pH 值，这是因蛋 白的净电荷取决于溶液的 pH 值，在 pH=pI 时为中性。由于在 pH=pI 时蛋白溶解度最小， 因此这时它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体金探针制备 中，一般胶体金调整为 pH=PI+0.5，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。
(1) 取 250 ml 三角瓶一个，加 100 ml 双蒸水及 1 ml 1%氯化金，加热沸腾； (2) 取不同量的 1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀，再保持沸腾 30 min，溶液颜色首
先变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，则 颜色偏向紫色。
柠檬酸钠(ml)
5 4 3 2.8
氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g 或 1g），因此在配制氯化金溶液 时一次配完，暂时不用的可以用 1.5 ml 试管分装为 1 ml 保存（-20℃）。注意各种玻璃器皿 一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1％双氯硅烷/氯仿浸泡 1 小时， 烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用 0.22 μm 微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可 反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。
在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同 种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最 初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多 的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍， 数量减少为原来的 1/8。
为最大限度保持抗体活性，整个过程应在 4℃下进行。对于冻干抗血清或长时间保存的血清，将生 理盐水透析改为 3 M KCNS 透析，促使聚合的多聚体解聚。如果抗血清效价较低时，不宜准备胶体金探 针。
2、亲和纯化抗体的处理
亲和纯化抗体多是一些商品化的通用抗体，即二抗。一般为羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人 的抗体。这些抗体一般有两个问题，一是 IgG 分子往往聚集为多聚体分子，二是往往含有 较多的盐分。因此前处理的目的在于脱盐和解聚。
制备好的胶体金保存寿命较长，可 4℃保存 6 个月以上或室温下保存 1-2 个月。当出 现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如 出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。
1、单宁酸/柠檬酸钠法制备 3～16 nm 胶体金
(1) 取一 250 ml 三角瓶，加入 79 ml 双蒸水和 1 ml 1％氯化金，预热至 60～70℃。 (2) 取一 50 ml 烧杯，加入 4 ml 1％柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入不
胶体金(nm)
12 16 24 30
注 意： 2
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(1) 由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差，以及制备过程中的其它问题，胶体金粒子的大 小及一致性与理论值可能有偏差，因此，在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太 大，粒子凝聚，粒子边缘不清晰等问题，须重新制备。
在确定最佳 pH 值后，最后要确定最小蛋白量，即能够形成稳定探针的蛋白的最小量。 如果在制备探针时加入太多的蛋白，不仅造成浪费，而且更为严重的是容易造成探针凝聚， 并严重影响标记活性。因为探针溶液中的游离蛋白容易抢先与标记位点结合，起到“封闭” （Blocking）作用，而胶体金探针标记不上。在标记位点希少、被标记物含量较少的情况 下要特别注意。
复三次； (4) 每孔分别加入 3 μl 浓度为 1 mg/ml 的纤维素酶，混合，室温下放置 10-15 min； (5) 每孔分别加入 20 μl 浓度为 10％ NaCl 溶液，混合，室温下放置 10 min；
5Leabharlann Baidu
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(6) 观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低 pH(X)； (7) 重复(1)-(5)步，pH 梯度为 X-0.6；X-0.3；X；X+0.3；X+0.6；X+1。 (8) 观察胶体金颜色变化直到室温下放置 2 小时，记录仍保持红色的最低 pH。
以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径 3～16nm 的胶体金。因 此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残 留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加 0.1～0.2％的 H2O2 能够去除这些残基。双标记或制备 5-10 nm 的胶体金时建议使用该方法。
大量工作表明，只用硫酸铵沉淀就可以得到足够纯度及高活性的 IgG 蛋白。其基本步 骤如下：
(1) 取抗血清 0.2 ml； (2) 加生理盐水（0.85％ NaCl）0.3 ml，混匀； (3) 逐滴加入饱和 (NH4)2SO4 0.5 ml，充分振荡混匀，4℃静置 1 h； (4) 10000 rpm/min 离心 20 min，弃上清； (5) 加 0.5 ml 生理盐水重悬浮，混匀； (6) 逐滴加 0.25 ml 饱和 (NH4)2SO4，充分振荡混匀，4℃静置 1 h； (7) 10000 rpm/min 离心 20 min，弃上清； (8) 重复 5～8 步骤一次； (9) 加生理盐水 0.5 ml 重悬浮，混匀； (10)生理盐水中透析 12～24 h； (11)在 0.2 M pH 9.0 硼酸缓冲液透析 12～24 h； (12)分装，即将使用时 4℃保存，备用-20℃保存。
3、IgG Fab 片段的制备
一般来说体积较小的探针具有相对较高的标记活性。主要原因在于胶体金颗粒较小时 有利于在标记溶液中的扩散运动；在胶体金直径一定时，蛋白分子量越小，金表面吸附的 蛋白分子越多，活性位点也越密集，也容易于靶位点结合。
IgG 分子量为 150 kD 左右，由 4 个亚基组成，即两条重链（H）和两条轻链（L）。用 水解酶（木瓜蛋白酶）水解后可得到两种片段，即 Fab 和 Fc。其中 Fab 是具有抗原识别活 性的部分，回收后制备探针。Fc 能够与 Protein A 和 Protein G 特异性结合。但这种分离只 能在有条件的实验室进行。
(2) 取 0.2 ml 饱和磷/乙醚溶液加到 1.5 ml 试管中，再加 0.8 ml 乙醚，混匀。取 0.7 ml 加入溶液（1）中(磷有毒且易燃，操作请带手套，多余的磷溶液用 CuSO4 进行中 和)。
(3) 室温下轻轻摇匀 15 min，然后加热沸腾并保持 5 min，自然冷却。
3、柠檬酸三钠法制备 12-30 nm 胶体金(Frens, 1973)
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(3) 在 2 mMol pH 9.0 的硼酸缓冲液中透析 12 h（更换透析液数次） (4) 分装备用 其它蛋白可参考此方法进行。但注意后一种透析液的 pH 值应与交联时 pH 值一致。 在实际运用中，一般省略去 3M KCNS 透析这一步，特别是当蛋白分子量较小，且为非糖 蛋白时。我们建议在制备通用探针（如二抗 IgG，Protein A，Protein G，Streptavidin）等时， 严格使用该方法，而制备直接标记探针时，也可以忽略处理步骤。
同用量的单宁酸及等量的 25 mM K2CO3。预热至 60～70℃。K2CO3 的作用是保持 溶液的中性 pH。因此如果单宁酸的量少于 0.5 ml 时，对 pH 的影响不大，K2CO3 可以省略。 (3) 将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温 10 分钟。自然冷却。
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其基本过程如下： (1) 用 PBS（pH 7.0，含 10 mM EDTA，20 mM 盐酸半胱氨酸）溶解纯化的 IgG (2) 加固化木瓜蛋白酶 (3) 37℃处理 5h (4) 离心，去除固化木瓜蛋白酶（沉淀） (5) 过 Protein G 柱 (6) 纯化的 Fab 片段按前文方法做进一步处理
胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理，其目的在于（1）去除高浓度的盐分，高浓 度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用 低浓度缓冲液中进行。（2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋 白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定 量分析。（3）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（30 kD），形成的蛋白复合体往 往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是已知 蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长 探针寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如 BSA，牛血清蛋 白等）结合后，能制备出稳定性更佳的探针。
注：Fab 与胶体金结合的 pH 值为 6.5
4、蛋白与胶体金结合最佳 pH 测定
(例纤维素酶，pI 未知)
(1) 取若干个 1.5ml 试管，分别加入 1 ml 10 nm 胶体金； (2) 用 25 mM K2CO3 将 pH 分别调为 3，4，5，6，7，8，9，10； (3) 取一 96 孔培养板，按 pH 从低到高分别将上述胶体金分别取 100 μl 加入孔中，重
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这里需要特别指出的是，使用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全 不同外，往往最佳 pH 也有一定变化。
因此，在探针制备每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性。
1、抗血清的前处理
一般抗血清中 IgG 的含量为 10-25%，而绝大部分为其它蛋白。用抗血清直接制备探 针其标记活性与特异性均不理想。因此需去除其中多数杂蛋白。但处理环节不宜太繁，在 实验室设备与经验缺乏的情况下更是如此，否则会导致 IgG 活性的大幅降低。如果你的实 验室在蛋白纯化方面有很强的技术支持，高度纯化后效果会更好。
柠檬酸钠（ml）
4 4 4 4 4 4
单宁酸（μl）
5000 2000 500 120
70 10
胶体金（nm）
3 4 6 8 10 16
2、白磷还原法制备 5 nm 胶体金
(1) 取 250 ml 三角瓶一个，加 79 ml 双蒸水，1 ml 1%氯化金，并用 0.25 M K2CO3 将 溶液调至中性（pH7.0）。
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技术资料 胡东维 洪 健 徐 颖
浙江大学 2001 年 10 月
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一、胶体金的制备
根据不同的制备方法，可以制备出直径 1－500nm 的胶体金粒子，但做为免疫标记探 针，其直径应在 3-30nm 范围内。
利用柠檬酸为还原剂，可以制备 12～150 nm 直径的胶体金。但制备大体积的胶体金 时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备 12-16 nm 直径 的胶体金。
除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备 5 nm 的胶体金，它避免了单宁酸残 基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理， 故该方法已经很少使用。
当蛋白前处理完成后，接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳 pH 值。对于理化性质不 确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同 pH 值得胶体金结合后，只有某一特定 pH 值能够形成结合最稳定的探针。在高浓度电解质（如 NaCl）作用下不会凝聚。不同蛋白的 适宜 pH 范围的宽窄大不相同。一般选择最小适宜 pH 值为最佳 pH 值。但有些探针的实际 情况并不完全如此，最稳定发探针并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。
(2) 胶体金溶液最好保存在 4℃冰箱中；也可保存在室温下，一般可保存 1-2 个月。但决不可保存 在 0℃以下，否则金粒子发生凝聚。
二、蛋白-金复合体的制备
一般认为胶体金粒子表面为一层 AuCl2，因此，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒 子之间相互排斥，形成稳定悬浮的胶体金溶液。
金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来 电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于 pH 值，这是因蛋 白的净电荷取决于溶液的 pH 值，在 pH=pI 时为中性。由于在 pH=pI 时蛋白溶解度最小， 因此这时它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体金探针制备 中，一般胶体金调整为 pH=PI+0.5，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。
(1) 取 250 ml 三角瓶一个，加 100 ml 双蒸水及 1 ml 1%氯化金，加热沸腾； (2) 取不同量的 1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀，再保持沸腾 30 min，溶液颜色首
先变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，则 颜色偏向紫色。
柠檬酸钠(ml)
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氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g 或 1g），因此在配制氯化金溶液 时一次配完，暂时不用的可以用 1.5 ml 试管分装为 1 ml 保存（-20℃）。注意各种玻璃器皿 一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1％双氯硅烷/氯仿浸泡 1 小时， 烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用 0.22 μm 微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可 反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。
在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同 种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最 初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多 的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍， 数量减少为原来的 1/8。
为最大限度保持抗体活性，整个过程应在 4℃下进行。对于冻干抗血清或长时间保存的血清，将生 理盐水透析改为 3 M KCNS 透析，促使聚合的多聚体解聚。如果抗血清效价较低时，不宜准备胶体金探 针。
2、亲和纯化抗体的处理
亲和纯化抗体多是一些商品化的通用抗体，即二抗。一般为羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人 的抗体。这些抗体一般有两个问题，一是 IgG 分子往往聚集为多聚体分子，二是往往含有 较多的盐分。因此前处理的目的在于脱盐和解聚。
制备好的胶体金保存寿命较长，可 4℃保存 6 个月以上或室温下保存 1-2 个月。当出 现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如 出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。
1、单宁酸/柠檬酸钠法制备 3～16 nm 胶体金
(1) 取一 250 ml 三角瓶，加入 79 ml 双蒸水和 1 ml 1％氯化金，预热至 60～70℃。 (2) 取一 50 ml 烧杯，加入 4 ml 1％柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入不
胶体金(nm)
12 16 24 30
注 意： 2
浙江大学胶体金免疫标记培训班资料
(1) 由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差，以及制备过程中的其它问题，胶体金粒子的大 小及一致性与理论值可能有偏差，因此，在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太 大，粒子凝聚，粒子边缘不清晰等问题，须重新制备。
在确定最佳 pH 值后，最后要确定最小蛋白量，即能够形成稳定探针的蛋白的最小量。 如果在制备探针时加入太多的蛋白，不仅造成浪费，而且更为严重的是容易造成探针凝聚， 并严重影响标记活性。因为探针溶液中的游离蛋白容易抢先与标记位点结合，起到“封闭” （Blocking）作用，而胶体金探针标记不上。在标记位点希少、被标记物含量较少的情况 下要特别注意。
复三次； (4) 每孔分别加入 3 μl 浓度为 1 mg/ml 的纤维素酶，混合，室温下放置 10-15 min； (5) 每孔分别加入 20 μl 浓度为 10％ NaCl 溶液，混合，室温下放置 10 min；
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(6) 观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低 pH(X)； (7) 重复(1)-(5)步，pH 梯度为 X-0.6；X-0.3；X；X+0.3；X+0.6；X+1。 (8) 观察胶体金颜色变化直到室温下放置 2 小时，记录仍保持红色的最低 pH。
以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径 3～16nm 的胶体金。因 此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残 留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加 0.1～0.2％的 H2O2 能够去除这些残基。双标记或制备 5-10 nm 的胶体金时建议使用该方法。
大量工作表明，只用硫酸铵沉淀就可以得到足够纯度及高活性的 IgG 蛋白。其基本步 骤如下：
(1) 取抗血清 0.2 ml； (2) 加生理盐水（0.85％ NaCl）0.3 ml，混匀； (3) 逐滴加入饱和 (NH4)2SO4 0.5 ml，充分振荡混匀，4℃静置 1 h； (4) 10000 rpm/min 离心 20 min，弃上清； (5) 加 0.5 ml 生理盐水重悬浮，混匀； (6) 逐滴加 0.25 ml 饱和 (NH4)2SO4，充分振荡混匀，4℃静置 1 h； (7) 10000 rpm/min 离心 20 min，弃上清； (8) 重复 5～8 步骤一次； (9) 加生理盐水 0.5 ml 重悬浮，混匀； (10)生理盐水中透析 12～24 h； (11)在 0.2 M pH 9.0 硼酸缓冲液透析 12～24 h； (12)分装，即将使用时 4℃保存，备用-20℃保存。
3、IgG Fab 片段的制备
一般来说体积较小的探针具有相对较高的标记活性。主要原因在于胶体金颗粒较小时 有利于在标记溶液中的扩散运动；在胶体金直径一定时，蛋白分子量越小，金表面吸附的 蛋白分子越多，活性位点也越密集，也容易于靶位点结合。
IgG 分子量为 150 kD 左右，由 4 个亚基组成，即两条重链（H）和两条轻链（L）。用 水解酶（木瓜蛋白酶）水解后可得到两种片段，即 Fab 和 Fc。其中 Fab 是具有抗原识别活 性的部分，回收后制备探针。Fc 能够与 Protein A 和 Protein G 特异性结合。但这种分离只 能在有条件的实验室进行。
(2) 取 0.2 ml 饱和磷/乙醚溶液加到 1.5 ml 试管中，再加 0.8 ml 乙醚，混匀。取 0.7 ml 加入溶液（1）中(磷有毒且易燃，操作请带手套，多余的磷溶液用 CuSO4 进行中 和)。
(3) 室温下轻轻摇匀 15 min，然后加热沸腾并保持 5 min，自然冷却。
3、柠檬酸三钠法制备 12-30 nm 胶体金(Frens, 1973)